تقدم هذه الورقة خطوة خطوة الدليل لأسلوب تحليل تذبذب ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) لقياس معاملات نشر fluorescently المسمى غشاء بروتينات البلازما في خلايا الثدييات الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
من السهل قياس إنتشار معاملات EGFP الموسومة البروتينات عن طريق غشاء البلازما ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وينظم انتشار الأفقي وتجزئة بروتينات غشاء البلازما بإحكام في الخلايا، وبالتالي، ودراسة هذه العمليات سوف تكشف عن رؤى جديدة لغشاء البلازما وظيفة البروتين والتنظيم. مؤخرا، ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) وقد وضعت 1 لتمكين القياسات الروتينية للمعاملات نشرها مباشرة من صور الموسومة fluorescently البروتينات غشاء البلازما، التي تجنب التحيز المنهجي الذي عرضته photophysics التحقيق. على الرغم من أن الأساس النظري لتحليل معقد، وطريقة يمكن تنفيذها من قبل nonexperts باستخدام رمز متاحة بحرية لقياس معاملات نشر من البروتينات. KICS بحساب دالة الارتباط الوقت من صورة كومة مضان المجهري بعد فورييه تحويل كل صورة إلى المتبادلة (ك) الفضاء. في وقت لاحق، في المتوسط دائرية، اللوغاريتم الطبيعي وتحويل الخطية يناسب إلى وظيفة ارتباط تعطي معامل الانتشار. هذاوتوفر ورقة دليل خطوة بخطوة لتحليل الصورة وقياس معاملات الانتشار عبر KICS.
أولا، يتم الحصول على ارتفاع معدل الإطار تسلسل الصور من البلازما بروتين الغشاء fluorescently المسمى باستخدام المجهر مضان. ثم، يتم تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) تجنب عضيات داخل الخلايا، والانتقال حويصلات أو جاحظ مناطق الغشاء. يتم استيراد المكدس العائد على الاستثمار في مدونة متاحة بحرية ويتم تعيين العديد من المعلمات تحديدا (انظر القسم الطريقة) لتحليل KICS. البرنامج ثم يقوم بإنشاء "المنحدر من المنحدرات" مؤامرة من وظائف الارتباط الوقت ك الفضاء، ويتم حساب معامل الانتشار من المنحدر من المؤامرة. وفيما يلي الإجراء خطوة بخطوة KICS لقياس معامل الانتشار من بروتين الغشاء باستخدام الكلوي قناة المياه aquaporin-3 المفتاحية EGFP كمثال الكنسي.
المقدمة
تنظم المنظمة الزمانية المكانية أربعة الأبعاد والتنقل الجانبي للبروتينات غشاء البلازما بإحكام ويمكن أن تلعب دورا في وظيفة البروتين والنشاط والتفاعل البروتين البروتين. الانتشار الأفقي للبروتينات غشاء البلازما، وقد جرت العادة على درس عن طريق حساب معاملات نشر للجسيمات واحدة من الوقت الفاصل بين التصوير من الكم نقطة أو صبغ المسمى غشاء بروتينات البلازما 2-4. هذا النهج يتطلب إدخال علامة خارج الخلية البروتين في غشاء البلازما لالكم نقطة أو وضع العلامات الصبغة، والتي يمكن أن تمس للطي البروتين وظيفة، وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق لبعض البروتينات. وقد تبين حجم الفراغية من الكم نقطة لإبطاء انتشار البروتين 5 وعلاوة على ذلك، وصفت سوى نسبة ضئيلة من البروتينات في عدد السكان مع نقاط الكم، وليس من المعروف ما إذا كان هذا الكسر هو ممثل لمجموع مجموعة من البروتينات غشاء البلازما. هيئة تنظيم الاتصالات جسيم واحدcking يبدو (SPT) قياسات معاملات نشر سلسلة من الصور من الكم نقطة البروتينات المسمى ينطوي على تعيين المناصب ذروة تصوير الجزيئات مع اثنين من الأبعاد التمويه يناسب تليها خوارزميات التحليل واسعة النطاق. التحليل هو حسابيا مكثفة للغاية، وتتطلب منحنى غير الخطية واسعة النطاق المناسب في كل إطار صورة تسلسل الوقت الفاصل بين لتقريب وظيفة انتشار نقطة المجهر (عادة اثنين من الأبعاد المكانية Gaussians) وربط لاحقة من المناصب الجسيمات في مسارات الجسيمات التي تصف حركة الجزيئات واحدة 6،7.
صورة تقنية الترابط وضعت مؤخرا، ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) تمكن قياسات بسيطة النسبية للمعاملات نشر الموسومة fluorescently البروتينات غشاء البلازما. إمكانية لحساب معاملات روتينية نشر بروتينات الغشاء المسمى مع البروتينات الفلورية التي كتبها KICS هو أداة فريدة من نوعها التي تتولىالعديد من المزايا التقليدية الكم دوت تحليل SPT: لا يلزم من الأكواد الإدراج خارج الخلية وقتا طويلا خارج الخلية وضع العلامات (خطوط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية يمكن استخدامها)؛ يتم استخراج معاملات نشر من تجمع مجموعه من البروتينات الفلورية مقارنة فرعية المسمى مع نقاط الكم؛ تحليل بسيط دون الحاجة إلى تتبع البروتينات واحد ويمكن إجراء التحليل باستخدام التعليمات البرمجية الموجودة مع عدم وجود شرط للبرمجة مستخدم إضافي. هذه الطريقة السريعة لأنه هو أسلوب المتوسط والتي تمكن بسرعة حساب وحساب معاملات نشر. هذه القياسات الانتشار السريع للسكان البروتين تكمل المعلومات أكثر تفصيلا النقل الجزيئية التي تم الحصول عليها عن مجموعة فرعية من السكان وفقا للأساليب SPT مضنية.
الوقت KICS يرتبط تسلسلات الصور مضان المجهر الأولى التي تحولت إلى فورييه الفضاء، وبالتالي يفصل فلوريداتقلبات uorescence بسبب photophysics من تلك التي تعزى إلى النقل الجزيئية 1. ونتيجة لذلك، يمكن KICS تحديد كثافة العدد، سرعة التدفق، ونشر fluorescently المسمى الجزيئات في حين يجري غير متحيز من قبل photobleaching من معقدة أو امض من fluorophores. وهذا يجعل KICS أداة مفيدة لتحديد بسرعة ديناميات نشر بروتينات غشاء الخلية fluorescently المسمى من دون الحاجة إلى كتابة الخوارزميات مخصص. إلى جانب البروتينات fluorescently المسمى، KICS يمكن أيضا أن تطبق على الكم دوت المسمى غشاء بروتينات 8.
تقدم هذه الورقة مقدمة خطوة بخطوة لكيفية استخدام KICS لاستخراج معاملات نشر EGFP الموسومة البروتينات غشاء البلازما من خلال إظهار كيفية وضع المحصول، وكيفية استخدام رمز وكيفية تقييم المؤامرات ولدت، الذي نشر يتم استخراج معاملات. على سبيل المثال، البيانات التي حصلت عليها الغزل مجموعة القرص المجهري في شبه الانعكاس الداخلي الكامل يتألقيتم تقديم الامتحانات التنافسية الوطنية (TIRF) واسطة، من البروتين الكلى قناة المياه aquaporin-3 (AQP3) الموسومة مع EGFP.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ويمكن أن يتم الحصول على البروتينات الموسومة EGFP في غشاء البلازما لتحليل KICS على مجهر epifluorescence، TIRF الإعداد أو على المجهر القرص الغزل المقرر أن الحصول على صور للغشاء من الفائدة. هناك حاجة إلى حجم بيكسل وكذلك الوقت بين إطارات الصور للتحليل. تسلسل صورة 100-1،200 إطارات بمعدل الإطار من 4-30 هرتز يمكن استخدامها للتحليل. خلال عملية الاستحواذ، فمن المهم للحفاظ على الغشاء في التركيز طوال فترة التصوير، والتركيز على جزء من الغشاء شقة في مضان التي يتم توزيعها بشكل موحد. تتحرك الحويصلات، جاحظ مناطق الغشاء وعضيات الخلية يمكن حصدها في وقت لاحق في عملية التحليل. وينبغي اختيار الوقت الاستحواذ حتى لا يكون هناك أي انحراف أو حركة الخلية.
للحصول على البرامج النصية رمز KICS لMATLAB، اتصل بول وايزمان (Paul.Wiseman @ McGill.ca). أول مرة يتم استخدام رمز KICS، MAT مفتوحةLAB وانقر فوق ملف، ثم تعيين المسار، ثم انقر فوق إضافة مع المجلدات الفرعية والعثور على مجلد على جهاز الكمبيوتر الذي توجد رمز KICS. ثم انقر فوق موافق، وحفظ وإغلاق. الآن تواصل مع تحليل المحاصيل وصفها في النقاط التالية.
1. استيراد صورة تسلسل الاهتمام إلى برنامج تحليل التصوير باعتباره TIFF المكدس
حفظ الملف مع اسم: stack1.tif.
- تحديد منطقة مستطيلة ذات الاهتمام (ROI) في الجزء المسطح من الغشاء باستثناء عضيات الخلية تتحرك وجاحظ مناطق الغشاء. يتم اختيار حجم المحاصيل بحيث يتم إنشاؤها بما فيه الكفاية لإحصاءات جيدة ك 2 المؤامرات.
- المحاصيل في المنطقة وحفظ المحاصيل كملف TIFF في المجلد المناسب. إذا كان هناك العديد من المحاصيل من نفس الفيلم، واستخدام الزيادة العدد، على سبيل المثال "stack1crop.tif"، "stack1crop2.tif"، "stack1crop3.tif".
- وضع المجلد الذي يحتوي على المحاصيل محلياعلى جهاز الكمبيوتر، وليس على الخادم، في حين تقوم التحليل KICS.
2. استيراد المحاصيل في برمجيات تحليل واحدا تلو الآخر لإجراء تحليل
- MATLAB مفتوحة ونوع "icsgui" في إطار الأوامر ثم اضغط ENTER. ICS GUI هو اسم التنفيذي للبرنامج واجهة المستخدم الرسومية صورة ارتباط التحليل الطيفي.
- في واجهة المستخدم الرسومية ICS انقر على "KICS" علامة التبويب. وأظهرت لقطة شاشة من إطار التحليل في الشكل 1.
- العثور على مجلد مع اسم المجلد "رمز MATLAB" وانتقل إلى الملف مع اسم الملف "مخطوطات" وفتح بذلك عن طريق النقر المزدوج عليها. بدلا من ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن على الملف واختيار "فتح مع MATLAB" أو انتقل إلى ملف مفتوح في MATLAB وفتح ملف البرامج النصية. ويسمى هذا الملف محرر.
- في التمرير لمحرر "KICS تحميل مجموعات البيانات"، ثم نسخ أو اسم نوع الملف وموقع المجلد في سطر الأوامر التي تبدأمع IMG = على سبيل المثال "C: المستخدمين المستندات AQP3dynamics stack1crop.tif". في سطر الأوامر أدناه موقع المجلد تعيين عدد من الأطر ليتم تحليلها - مثل [1:500]. استخدام نفس الإعدادات لكافة الأفلام متتالية في سلسلة بيانات. إذا كان هناك انحراف التركيز في إطارات في وقت لاحق، ينبغي استبعاد هذه من التحليل.
- في محرر انقر فوق "حفظ" ثم انقر فوق "تقييم الخلية". يتم تحميل بيانات الآن في البرنامج في التحليل.
- في إطار تحليل KICS في واجهة المستخدم الرسومية، أدخل الإعدادات للتحليل:
- Unclick صناديق "T الخلية".
- أدخل عدد تأخيرات زمنية ليتم تحليلها. وعدد من الفجوات الزمنية (τ) يكون لها تأثير على المؤامرة نشرها ويجب أن يتم اختياره بحيث المؤامرة نشرها هو الخطية. تبدأ مع دخول 25 ثم تنخفض إلى حيث المؤامرة نشرها هو الخطية. τ هو عدد مرات تتخلف التحليل KICS يقارن وتأخر الوقت هو الوقت المناسب بإلى صف إطار واحد والقادمة. وينبغي اختيار أصغر قيمة التي تعطي مؤامرة الخطية. الحد الأقصى لعدد تأخيرات زمنية يتم اختيار بحيث يتم الحصول على تناسب خطي، واختيار وقيمة أعلى إنتاج البيانات التي لا يمكن تركيبها الخط.
- أدخل الحد الأقصى لقيمة ك 2 (انظر دائرة 1 في الشكل 1)، فإنه عادة ما يكون 20-50. وخير ك 2 المؤامرة هي مؤامرة التي توجد فيها العديد من نقاط البيانات التي يتم توزيعها على طول الخط. تبدأ مع دخول 70 ثم تنخفض بعد أن قيمت ك 2 ونشر المؤامرات وتحديد أدنى قيمة حيث الكتلة نقاط البيانات حول خط مستقيم. ك 2 القيمة هو حجم التربيعية للالمكانية ك متجه في الفضاء فورييه.
في البداية، ينبغي تكرار تحليل حتى يتم تحديد أفضل القيم، ثم استخدام نفس الإعدادات لكافة الأفلام التوالي في سلسلة البيانات ولكن دائما التأكد من أن إعدادات اختيار تعطي مناسبا للبيانات: ك جيدة 2 المؤامراتومؤامرة نشر الخطية. - انقر على زر "إعدادات المتجر والمضي قدما".
- انقر فوق "نعم" لإظهار كافة الرسوم البيانية.
- انقر فوق "تحميل صورة سلسلة" (انظر دائرة 2 في الشكل 1)، ثم انقر فوق "مساحة العمل".
- حدد "imgSerCrop"، ثم انقر فوق "استيراد من مساحة عمل".
- إدخال الضبط جمع نظام التصوير. في "حجم بكسل" مربع أدخل الحجم المتوقع بيكسل للنظام التصوير الذي يتم الحصول مداخن الصورة. لAQP3-EGFP، استخدمت 0.111. في المربع "أدخل الوقت (ق) بين الإطارات"، وكان يستخدم لAQP3 0.1150-EGFP.
- انقر فوق "تحديد رويس"، أدخل "1"، انقر فوق موافق و"استخدام الصورة كاملة".
- انقر على زر "التحليل هل KICS" وانقر فوق نعم للقيام به "تصفية متحرك". سوف تفتح تلقائيا النتائج كصور.
- تصغير إطار إعدادات، والتقليل من معلومات الخلية يندوث، وتصغير إطار photophysics. في إطار ديناميكية، تحقق من أن المؤامرة ديناميات يظهر تناسب خطية من البيانات إلى خط مع ميل سلبي وهذا يعني أن نقاط البيانات ربط ويمكن الافتراض نشرها مجانا. تسجيل معامل الانتشار لتأخر وقت محدد وك 2 إعدادات (أنه ليس من الضروري أن نشير إلى الانحراف المعياري للصالح). يجب أن تتجمع نقاط البيانات في المؤامرات ك 2 حول خط لوقت معين تتخلف.
- مربع التجزئة "حفظ أرقام المفتوحة كصور"، ثم انقر فوق "حفظ أرقام المفتوحة كصور" لإنقاذ يؤدي الملفات. حفظ في مجلد جديد تحت C: المستخدمين المستندات AQP3diffusion. انقر فوق "البيانات الحالية واضحة" وتواصل مع تحليل المحصول المقبل.
يتم احتساب 3. متوسط معامل الانتشار المحسوبة للحصول على نظرة عامة على تحليل البيانات
- أدخل معاملات نشر الفردية من كل العائد على الاستثمار في spreadsheet (تأكد من أن نلاحظ τ وك 2 القيم)، استخدم أسماء المحاصيل كما هو مبين أعلاه.
- حساب متوسط معامل الانتشار والانحراف المعياري باستخدام برنامج جدول بيانات.
- إجراء اختبار كولموجوروف-سميرنوف أو الطلاب اختبار t لتقييم فروق ذات دلالة إحصائية باستخدام مستوى الدلالة 5٪. ويمكن إجراء مقارنات Quantitave بين الخلايا (على سبيل المثال يعامل مقابل nontreated).
- فتح إصدار جداول للنشر المؤامرات التي تم إنشاؤها بواسطة برامج التحليل لكل محصول، ويبلغ متوسط البيانات لكل حالة لكل تأخر الوقت. توليد مؤامرة جديدة لنشرها في المتوسط في تقديم أوراق أو العروض التقديمية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
للحصول على مداخن صورة مناسبة ليتم تحليلها مع KICS، ويمكن استخدام نظم المجهر مختلفة. فمن الممكن لتحليل تسلسلات الصور من المجهر مضان برنامج التحصين الموسع فضلا عن TIRF أو الغزل قرص الإعداد. يجب أن يكون غشاء مسطحة دون أي عضيات الخلية تتحرك كبيرة أو تتحرك الحويصلات / الكائنات. تعرض هذه الورقة على تسلسل الصور الفاصل الزمني من AQP3 المفتاحية EGFP في الخلايا الحية MDCK تصويرها على المجهر القرص الغزل مع التركيز تعيين إلى غشاء البلازما بمعدل 9.2 إطار هرتز. تم تعيين التركيز على القاعدية (أس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قدمت هذه الورقة خطوة بخطوة محة مفصلة عن كيفية تطبيق أسلوب التحليل KICS لتحديد معاملات نشر من صور المجهر من البروتينات ذات الكلمات الدلالية مع البروتينات الفلورية. تحليل مستقل عن التحقيق مع اختيار مجموعة ديناميكية واسعة جدا في كثافة وضع العلامات وبالتالي يمكن أن تطبق أيضا على البروتينات المسمى مع نقاط الكم وكذلك الأصباغ والبروتينات الفلورية مثل EGFP.
لحساب معاملات نشر صالحة للبروتينات، وهناك العديد من الخطوات الحا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل زمالة وندبيك ليدر جروب جديد لLNN. يقر PWW دعم التمويل منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC). كما نشكر المركز الدانمركي الجزيئية Bioimaging في جامعة جنوب الدنمارك للوصول إلى القرص الغزل المجهر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Penicilin | سيجما | 13752 | |
| Kanamycin | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | |
| Phenol red free medium | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 < / a> | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| جهاز | |||
| مجهر قرص | الغزل نيكون | Ti Eclipse | |
| EMCCD كاميرا | Andor | Ixon + |
المراجع
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
