يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عكس الخميرة نظام هجين اثنين من التعرف على الثدييات مستقبلات النووية التي تتفاعل مع بقايا تقوم الليجندات و / أو الخصوم

12.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51085

⸱

نوفمبر 15, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content" > يرتبط Ketoconazole بتنشيط Pregnane X Receptor (PXR) ويعاديه. تحدد شاشات الخميرة عالية الإنتاجية للطفرات PXR منطقة فريدة لربط الكيتوكونازول. تكتشف هذه الطريقة الجينية القائمة على الخميرة تفاعلات مستقبلات نووية جديدة مع الروابط التي ترتبط بمواقع الارتباط السطحي.

الملخص

< p class = "jove_content"> كمنظم حاسم لعملية التمثيل الغذائي للدواء والالتهابات ، يلعب Pregnane X Receptor (PXR) دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية للمرض الذي يربط بين التمثيل الغذائي والالتهاب (مثل التنكس الدهني الكبدي) 1،2. كان هناك تقدم كبير في تحديد الروابط الناهضة ل PXR ، ومع ذلك ، هناك أوصاف محدودة للمضادات الشبيهة بالأدوية ومواقع ربطها على PXR3 ، 4 ، 5. كان أحد العوائق الحاسمة هو عدم القدرة على تنقية البروتين كامل الطول بكفاءة للدراسات الهيكلية مع المضادات على الرغم من حقيقة أن PXR تم استنساخه وتمييزه في عام 1998. طور مختبرنا اختبارا هجينا جديدا عالي الإنتاجية قائم على الخميرة لتحديد بقايا الربط المضاد ، الكيتوكونازول ، على PXR6. تتضمن طريقتنا إنشاء مكتبات طفرية من شأنها أن تنقذ تأثير الطفرات المفردة على سطح AF-2 من PXR المتوقع أن يتفاعل مع الكيتوكونازول. يمكن إجراء طفرات ثانية للإنقاذ أو "اكتساب الوظيفة" بحيث تكون الاستنتاجات المتعلقة بالتفاعل الجيني للكيتوكونازول وبقايا (البقايا) السطحية على PXR ممكنة. وهكذا ، قمنا بتطوير شاشة خميرة هجينة عالية الإنتاجية للطفرات PXR التي تتفاعل مع المنشط الخاص بها ، SRC-1. باستخدام هذا النهج ، الذي تم فيه تعديل الخميرة لاستيعاب دراسة الدواء المضاد للفطريات ، الكيتوكونازول ، يمكننا إظهار طفرات محددة على PXR المخصب في المستنسخة غير القادرة على الارتباط بالكيتوكونازول. من خلال المنطق العكسي ، نستنتج أن المخلفات الأصلية هي بقايا تفاعل مباشر مع الكيتوكونازول. يمثل هذا الاختبار اختبارا جينيا جديدا قابلا للتتبع لفحص مواقع ربط المضاد على أسطح المستقبلات النووية. يمكن تطبيق هذا الاختبار على أي دواء بغض النظر عن قدرته السامة للخلايا على الخميرة وكذلك على البروتين الخلوي (البروتينات) الخلوية التي لا يمكن دراستها باستخدام البيولوجيا الهيكلية القياسية أو الأساليب القائمة على البروتينات. تشمل المزالق المحتملة تفسير البيانات (طرق تكميلية مفيدة) ، والاعتماد على طريقة Y2H الفردية ، والخبرة في التعامل مع الخميرة أو إجراء فحوصات ثنائية الهجين للخميرة ، وتحسين الفحص.

المقدمة

< p class = "jove_content" > يستخدم مقايسة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) على نطاق واسع لاكتشاف تفاعلات البروتين والبروتين ومؤخرا لاكتشاف جزيئات صغيرة جديدة تعطل مجمعات تفاعل البروتين والبروتين 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11. ومع ذلك ، فإن الأساليب التقليدية لهذا الاختبار ، المستخدمة لاكتشاف الأدوية أو "الزيارات" ، لا تسمح بالكشف عن بقايا التفاعل الخيفي للمركبات الكيميائية داخل أسطح البروتين والبروتين ، والتي عند تغييرها لا تزال تتفاعل وتسمح باستجواب المخلفات المتغيرة11. في الواقع ، فإن مثل هذه الطريقة (الطريقات) ، إذا كان من الممكن تطويرها ، ستمكن نظام خميرة قابل للتتبع لتقييم إنتاجية عالية لمخلفات التفاعل الخيفي الحاسمة لاضطراب تفاعل البروتين والبروتين. في سياق اكتشاف الدواء ، فإن الطريقة الأكثر مباشرة لإنشاء تفاعل المركبات مع البروتينات تنطوي على التحديد الهيكلي (مثل بلورة مركب مثبطات البروتين). هذه الأساليب مرهقة ، وتستخدم موارد متقنة وليس من الممكن تقنيا إجراء دراسات هيكلية على كل بروتين.

< p class = "jove_content" > تم إنشاء أنظمة فحص الأدوية الجينية القابلة للتتبع في البكتيريا1 و 2 وأنظمة نموذجية أخرى مثل الثدييات الهجينة الثنائية. ومع ذلك ، تحتاج هذه الأنظمة إلى التحسين ولا تزال الأنظمة البديلة مثل Y2H هي الأكثر اختبارا في اكتشاف الأدوية. هناك قيود تشمل ضعف الحساسية والموثوقية للتفاعلات باستخدام الطرق الفردية13 ، ومع ذلك ، يمكن تعديل مقايسة Y2H واحدة للإجابة على أسئلة محددة تتعلق ببقايا التفاعل. في مجال أبحاث المستقبلات النووية ، تم استخدام Y2H لتحديد البروتينات المتفاعلة14 ، ومع ذلك ، نادرا ما تم استخدام تفاعلات البروتين هذه لتحديد الطبيعة التي تتفاعل فيها الروابط / المضادات مع مجمعات البروتين المستقبلات النووية. وبالتالي ، ركز مختبرنا على تحديد طريقة ، خاصة بالنسبة لبروتينات المستقبلات التي لا يمكن أن تكون قابلة بسهولة للطرق القائمة على البروتينات ، والتي من شأنها اكتشاف بقايا جديدة تتفاعل مع الترابط / المضاد باستخدام منصة اكتشاف عكسية قائمة على Y2H.

بناء على اكتشافنا السابق بأن الكيتوكونازول يعطل PXR ومنشطه SRC-1 ، قمنا بتطوير نظام Y2H عكسي جديد يمكننا من تحديد واستجواب بقايا تفاعل الكيتوكونازول على PXR6. تعتمد طريقتنا على خصائص الخميرة GAL4 البروتين الذي يتكون من مجالات قابلة للفصل مسؤولة عن ربط الحمض النووي وتنشيط النسخ. يتم التعبير عن بروتين PXR LBD على أنه اندماج في مجال ربط الحمض النووي LexA (DNA-BD) ، بينما يتم التعبير عن بروتينات المنشطات المشتركة كاملة الطول SRC-1 (المنشط المشترك لمستقبلات الستيرويد 1) كاندماجات في مجال تنشيط GAL4 (AD). يؤدي التفاعل بين بروتينات الاندماج PXR و SRC-1 إلى تنشيط النسخ لمواقع ربط GAL4 التي تحتوي على جين المراسل β-LacZ الذي تم دمجه في جينوم الخميرة. كيتوكونازول ، مضاد PXR ، يعطل تفاعل PXR و SRC-1 15 و 16 و 17 ويمكننا اكتشاف تفاعل PXR و SRC-1 في وجود أو عدم وجود الكيتوكونازول بعد تلطيخ المستعمرات على المرشحات لنشاط X-gal. يتم توضيح مبدأ Y2H في الشكل 1 ويتم تلخيص الإجراء التجريبي في الشكل 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. بناء اندماجات PXR و SRC-1 في ناقلات الخميرة

  1. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من PXR LBD البشري (107-434 من الأحماض الأمينية) و Human SRC-1 كامل الطول (1-1401 من الأحماض الأمينية).
    1. استخدم pSG5-hPXR بلازميد8 كقالب PXR LBD ، واستخدم بلازميد pCMX-SRC1 كقوالب SRC-1.
    2. قم بإذابة الثلج PCR SuperMix وقوالب الحمض النووي والبادئات (انظر المواد) ، واحتفظ بها على الجليد.
    3. أضف 0.25 ميكروغرام / ميكرولتر قالب الحمض النووي 1 ميكرولتر ، 10 أزواج أولية من 10 ملي 2 ميكرولتر لكل منهما ، PCR SuperMix 45 ميكرولتر وأضف H2O ليصل الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر.
    4. اضبط PCR على دورة واحدة 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 20 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، ثم دورة واحدة من 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للتمديد. تحقق من منتجات PCR عن طريق العمل على جل الاغاروز 1٪.
  2. استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في نواقل Y2H.
    1. تنقية منتجات PCR من جل الاغاروز 1٪. ملخص ناقل PXR و LBD و PCR و Y2H pSH2-1 مع BamHI و SalI ؛ استيعاب SRC-1 PCR و Y2H vector pGADNOT مع NotΙ و SalΙ. للقيام بذلك ، أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي ، و 3 ميكرولتر 10x المخزن المؤقت للتفاعل ، و 1 ميكرولتر إنزيمات التقييد ، وأخيرا H2O ليصل الحجم الإجمالي إلى 30 ميكرولتر.
    2. ضع عينات الهضم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تحقق من الهضم عن طريق التشغيل على جل الاغاروز 1٪.
    3. تنقية عينات الهضم من هلام الاغاروز 1٪ ، وربط منتجات PCR المهضومة ونواقل Y2H وتحويلها إلى خلايا مختصة DH5α.
    4. اختر المستعمرات وعزل الحمض النووي البلازميد.
  3. حدد الحمض النووي البلازميد pSH2-1-PXR عن طريق هضم BamHI / SalI ، وحدد الحمض النووي البلازميد pGADNOT-SRC-1 عن طريق هضم NotI / SalI. تحقق من كل الحمض النووي البلازميد الإيجابي عن طريق التسلسل.

2. الخميرة فحوصات هجينة

  1. قم بتلقيح سلالة الخميرة في 5 مل YPAD واحتضانها طوال الليل عن طريق التحريك المستمر (220 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية). ملاحظة: كانت سلالة خميرة الخميرة CTY10-5d (MATa ade2 trp1-901 leu2-3،112 his3-200 ga l4-gal80- URA3 :: lexA-lacZ) التي تحتوي على جين GAL1-lacZ متكامل مع عامل lexA 10. للحصول على خلايا خميرة قابلة للحياة مقاومة للكيتوكونازول ، ولكن تلك التي لم تحمل تعديلات ناقلة كسبب لمقاومة الآزول18-20 ، تم الحصول على سلالات جديدة من خميرة CTY10-5d عن طريق حذف ERG3 أولا (erg3Δ) ثم إدخال حذف إضافي في جينات ERG11 (erg3Δ / erg11Δ) عن طريق إعادة التركيب المتماثل. تم وصف تفاصيل البناء في مخطوطة منشورةسابقا 6.
  2. في اليوم التالي (في الصباح) ، قم بتلقيح الخميرة (1:20) في 5 مل YAPD واحتضانها للحصول على OD600 ~ 0.2 عن طريق التحريض المستمر (220 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية).
  3. بيليه الخلايا عند 2,000 دورة في الدقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقتين وتخلص من المادة الطافية. ثم اغسل الحبيبات مرتين بالماء المعقم ومرة واحدة ب 0.1 M LiAc.
  4. بعد الغسيل النهائي ، تخلص من المادة الطافية وأضف الكواشف التالية إلى حبيبات الخلية: 240 ميكرولتر PEG 3500 50٪ وزن / حجم ، 36 ميكرولتر 1 M LiAc ، 50 ميكرولتر 2 مجم / مل من المنوية السلمون المسلوق ssDNA ، H2O 34 ميكرولتر. دوامة للخلط ، أضف 1 ميكروغرام pSH-PXR و 1 ميكروغرام pGADNOT-SRC-1 DNA واخلطها.
  5. انقل المزيج إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين ، وحرك التحويل ، واخلطه (220 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
  6. الطرد المركزي الأنبوب عند 2,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين وإزالة المادة الطافية. اغسل الحبيبات مرة واحدة بالماء المعقم.
  7. ماصة 100 ميكرولتر من الماء المعقم في الأنبوب ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق النقر بالإصبع اللطيف وسحب العينة ، ثم ضعها على ألواح من -His / -Leu Dropout Medium (التركيبة لكل لتر واحد - His / - Leu Dropout Medium: 20 جم سكر العنب ، 1.7 جم YNB ، 0.67 جم CSM-His / -Leu ، 5 جم كبريتات الأمونيوم ، 1.5٪ أجار) واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام لعزل المحولات.
< p class = "jove_title" >3. فحص مرشح X-gal

  1. قطع غشاء النيتروسليلوز إلى حجم جزء من طبق بتري. قم بتسمية غشاء النيتروسليلوز لتحديد الاتجاه.
  2. ضع غشاء النيتروسليلوز المميز مسبقا على مستعمرات الخميرة ، وتأكد من أن الغشاء ملامس لسطح وسط اللوحة.
  3. قم بإزالة الغشاء ، وضعه جنبا إلى جنب مع المستعمرة لأعلى على ورق ترشيح 3 مم ، وضع الغشاء وورق الترشيح عند -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. اصنع محلول X-gal. أضف 50 ميكرولتر 20 مجم / مل X-gal و 15 ميكرولتر β-mercaptoethanol إلى 5 مل من Z-buffer (يحتوي 1 L Buffer على 16.1 جم Na2HPO47H2O ، 5.5 جم NaH2PO4 H2O ، 0.75 جم KCl ، 0.25 جم MgSO4 • 7H2O). إذا تم الاحتفاظ ب Z Buffer عند 4 درجات مئوية ، فقم بإحضاره إلى درجة حرارة الغرفة قبل إضافة هذه الكواشف.
  5. ضع دائرتين من ورق الترشيح 3 مم في طبق بتري وانقعهما بمحلول X-gal سعة 5 مل. صفي المخزن المؤقت الزائد من طبق بتري وضع غشاء النيتروسليلوز مع وضع جانب المستعمرة لأعلى.
  6. أغلق الغطاء ، وتأكد من أن الغشاء يتلامس تماما مع ورق الترشيح وأنه مبلل تماما. لف طبق بتري بورق القصدير واحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ليلة كاملة.
< p class = "jove_title" >4. فحص β-gal السائل

  1. تنمو الخميرة في وسط سائل -His / -Leu Dropout إلى OD600 0.7.
  2. انقل 1 مل متوسطا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 3,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين.
  3. أضف 1 مل من Z Buffer لإعادة تعليق الحبيبات ، وجهاز الطرد المركزي عند 3,000 دورة في الدقيقة مرة أخرى لمدة دقيقتين.
  4. أضف 150 ميكرولتر من Z Buffer مع 2ME لإعادة تعليق حبيبات الخلية ، واخلطها ثم أضف 50 ميكرولتر من الكلوروفورم و 20 ميكرولتر 0.1٪ SDS. قم بدوامة العينة بقوة لمدة 15 ثانية.
  5. أضف 700 ميكرولتر من محلول ONPG (1 مجم / مل في المخزن المؤقت Z). اضبط المؤقت ، واحتضنه عند 30 درجة مئوية لفترة كافية للسماح للون الأصفر بالتطور وملاحظة إجمالي وقت التفاعل.
  6. أضف 500 ميكرولتر من 1 M Na2CO3 لإيقاف التفاعل وتحديد الامتصاص عند 420 نانومتر. الفراغ هو 700 ميكرولتر محلول ONPG بالإضافة إلى 500 ميكرولتر 1 M Na2CO3.
< p class = "jove_content" > احسب وحدات ميلر على النحو التالي: وحدات ميلر = (Å420 * 1,000) / (Å600 * دقيقة * مل)

فئة

Å420: وحدات الامتصاص عند 420 نانومتر ؛ Å600: وحدات الامتصاص عند 600 نانومتر. دقيقة: وقت رد الفعل بالدقائق. ML: حجم التفاعل بالمل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد أجرينا مقايسة لمعرفة ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف قراءة لونية لارتباط PXR والمساعد المنشط لمستقبلات الستيرويد-1 (SRC-1). وبما أن الخميرة تنتج كميات كبيرة من الستيرول، فقد ثبت سابقاً أن التعبير عن lacZ في الخميرة يمكن تحفيزه دون الحاجة إلى ربيطة خارجية إضافية. ووجدنا أن التعبير عن lacZ (مستعمرات زرقاء) يتم تحفيزه أيضاً في سلالة الخميرة المحولة بـ PXR و SRC-1؛ ومع ذلك، لا يوجد تحفيز للتعبير عن LacZ (مستعمرات بيضاء) في الخميرة المحولة بنواقل فارغة، أو بـ PXR أو SRC-1 بشكل منفرد (الشكل 3). ولتحديد ما إذا ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في مقايسة Y2H المعدلة ، حددنا بقايا مهمة لتفاعلات الكيتوكونازول على PXR6. نظرا لأن SRC-1 هو منشط مساعد (وتم استنساخه في ناقل pGADNot) ، فقد اختبرنا أيضا ما إذا كان SRC-1 يمكنه تنشيط تعبير lacZ عند استنساخه في نظام ناقل pSH وما إذا كان هذا سيغير ملف تعريف التنشيط و / أو يؤثر على تسرب مقايسة الخميرة ثنائية الهجين. باستخدام البلازميدات المعاد تصميمها ، أجرينا فحوصات هجينة في erg3Δ / erg11Δ الخميرة. كما كان من قبل ، نوضح أن تعبير lacZ (المستعمرات الزرقاء) يتم إحداثه أيضا في erg3Δ / e...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) CA127231 وجائزة المحقق السريري لمؤسسة دامون رونيون (CI 1502) (إلى SM). نود أن نشكر البروفيسور Zdenek Dvorak من جامعة بالاكي أولوموك ، جمهورية التشيك على رؤيته المفيدة في مناقشة قابلية نقل هذه التقنية إلى مؤسستهم وتوحيد البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سلالة الخميرة CTY10-5d erg3< / em>Δ/erg11ΔمختبرناCTY10-5d مرتين ERG3 < / em> و ERG11< / em> (erg< / em>3< / em>&Delta؛ / erg11 & Delta;) الجينات 6< / sup>.
YPD Growth MediumBD Biosciences630409
Difco خميرة قاعدة نيتروجين (YNB) بدون الأحماض الأمينية وكبريتات الأمونيومBD Biosciences233520
Bacto AgarBD Biosciences214010
CSM-His / -Leu خليط المكملات الغذائية الكاملMP Biomedicals4250-412
ONPG (o-Nitrophenyl & Beta ؛ -D- Galactopyranoside).سيجما ألدريتشN1127
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
مرق لوريا (LB)Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
المنوية السلمون المسلوق (10 مجم / مل)Life Technology156-017
AmpicillinAcros Organics61177
KetoconazoleSigma-AldrichK1003
N ، N-DimethylformamideAcros Organics326871000
أسيتات الليثيومسيجما-ألدريتشL4158
محلول 50٪ PEG-3350 ، غشاء
النيتروسليلوز10402091
10 سمفيشر875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'مختبرناPXR LBD التمهيدي الأمامي ل pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'مختبرناPXR LBD التمهيدي العكسي ل pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGAGAGTTCATCC -3'مختبرناSRC-1 التمهيدي الأمامي ل pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'مختبرناSRC-1 التمهيدي العكسي ل pGADNOT
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
BamHIمختبرناR0136
SalIمختبرناR0138
NotIمختبرناR0189
تم إخراج خميرة DNA من المعقم بالفلتر ، طبق بتري واتمان

المراجع

  1. Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
  2. Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
  3. Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
  4. Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
  5. Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
  6. Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
  7. Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  8. Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
  9. Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
  10. Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
  11. Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
  12. Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
  13. Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
  14. Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
  15. Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
  16. Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
  17. Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
  18. Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
  19. Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
  20. White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
  21. Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
  22. Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
  23. Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

PXR SRC 1
عكس الخميرة نظام هجين اثنين من التعرف على الثدييات مستقبلات النووية التي تتفاعل مع بقايا تقوم الليجندات و / أو الخصوم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.