Method Article

عكس الخميرة نظام هجين اثنين من التعرف على الثدييات مستقبلات النووية التي تتفاعل مع بقايا تقوم الليجندات و / أو الخصوم

DOI:

10.3791/51085

⸱

November 15th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > يرتبط Ketoconazole بتنشيط Pregnane X Receptor (PXR) ويعاديه. تحدد شاشات الخميرة عالية الإنتاجية للطفرات PXR منطقة فريدة لربط الكيتوكونازول. تكتشف هذه الطريقة الجينية القائمة على الخميرة تفاعلات مستقبلات نووية جديدة مع الروابط التي ترتبط بمواقع الارتباط السطحي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content"> كمنظم حاسم لعملية التمثيل الغذائي للدواء والالتهابات ، يلعب Pregnane X Receptor (PXR) دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية للمرض الذي يربط بين التمثيل الغذائي والالتهاب (مثل التنكس الدهني الكبدي) 1،2. كان هناك تقدم كبير في تحديد الروابط الناهضة ل PXR ، ومع ذلك ، هناك أوصاف محدودة للمضادات الشبيهة بالأدوية ومواقع ربطها على PXR3 ، 4 ، 5. كان أحد العوائق الحاسمة هو عدم القدرة على تنقية البروتين كامل الطول بكفاءة للدراسات الهيكلية مع المضادات على الرغم من حقيقة أن PXR تم استنساخه وتمييزه في عام 1998. طور مختبرنا اختبارا هجينا جديدا عالي الإنتاجية قائم على الخميرة لتحديد بقايا الربط المضاد ، الكيتوكونازول ، على PXR6. تتضمن طريقتنا إنشاء مكتبات طفرية من شأنها أن تنقذ تأثير الطفرات المفردة على سطح AF-2 من PXR المتوقع أن يتفاعل مع الكيتوكونازول. يمكن إجراء طفرات ثانية للإنقاذ أو "اكتساب الوظيفة" بحيث تكون الاستنتاجات المتعلقة بالتفاعل الجيني للكيتوكونازول وبقايا (البقايا) السطحية على PXR ممكنة. وهكذا ، قمنا بتطوير شاشة خميرة هجينة عالية الإنتاجية للطفرات PXR التي تتفاعل مع المنشط الخاص بها ، SRC-1. باستخدام هذا النهج ، الذي تم فيه تعديل الخميرة لاستيعاب دراسة الدواء المضاد للفطريات ، الكيتوكونازول ، يمكننا إظهار طفرات محددة على PXR المخصب في المستنسخة غير القادرة على الارتباط بالكيتوكونازول. من خلال المنطق العكسي ، نستنتج أن المخلفات الأصلية هي بقايا تفاعل مباشر مع الكيتوكونازول. يمثل هذا الاختبار اختبارا جينيا جديدا قابلا للتتبع لفحص مواقع ربط المضاد على أسطح المستقبلات النووية. يمكن تطبيق هذا الاختبار على أي دواء بغض النظر عن قدرته السامة للخلايا على الخميرة وكذلك على البروتين الخلوي (البروتينات) الخلوية التي لا يمكن دراستها باستخدام البيولوجيا الهيكلية القياسية أو الأساليب القائمة على البروتينات. تشمل المزالق المحتملة تفسير البيانات (طرق تكميلية مفيدة) ، والاعتماد على طريقة Y2H الفردية ، والخبرة في التعامل مع الخميرة أو إجراء فحوصات ثنائية الهجين للخميرة ، وتحسين الفحص.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > يستخدم مقايسة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) على نطاق واسع لاكتشاف تفاعلات البروتين والبروتين ومؤخرا لاكتشاف جزيئات صغيرة جديدة تعطل مجمعات تفاعل البروتين والبروتين 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11. ومع ذلك ، فإن الأساليب التقليدية لهذا الاختبار ، المستخدمة لاكتشاف الأدوية أو "الزيارات" ، لا تسمح بالكشف عن بقايا التفاعل الخيفي للمركبات الكيميائية داخل أسطح البروتين والبروتين ، والتي عند تغييرها لا تزال تتفاعل وتسمح باستجواب المخلفات المتغيرة11. في الواقع ، فإن مثل هذه الطريقة (الطريقات) ، إذا كان من الممكن تطويرها ، ستمكن نظام خميرة قابل للتتبع لتقييم إنتاجية عالية لمخلفات التفاعل الخيفي الحاسمة لاضطراب تفاعل البروتين والبروتين. في سياق اكتشاف الدواء ، فإن ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. بناء اندماجات PXR و SRC-1 في ناقلات الخميرة

  1. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من PXR LBD البشري (107-434 من الأحماض الأمينية) و Human SRC-1 كامل الطول (1-1401 من الأحماض الأمينية).
    1. استخدم pSG5-hPXR بلازميد8 كقالب PXR LBD ، واستخدم بلازميد pCMX-SRC1 كقوالب SRC-1.
    2. قم بإذابة الثلج PCR SuperMix وقوالب الحمض النووي والبادئات (انظر المواد) ، واحتفظ بها على الجليد.
    3. أضف 0.25 ميكروغرام / ميكرولتر قالب الحمض النووي 1 ميكرولتر ، 10 أزواج أولية من 10 ملي 2 ميكرولتر لكل منهما ، PCR SuperMix 45 ميكرولتر وأضف H2O ليصل الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر.
    4. اضبط PCR على دورة واحدة 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content">لقد أجرينا فحصا لمعرفة ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف قراءة لونية لارتباط PXR ومنشط مستقبلات الستيرويد -1 (SRC-1). نظرا لأن الخميرة تحتوي على إنتاج كبير للستيرول ، فقد ثبت سابقا أنه يمكن تحفيز تعبير lacZ في الخميرة دون الحاجة إلى ترابط خارجي إضافي. وجدنا أن تعبير lacZ (المستعمرات الزرقاء) يتم إحداثه أيضا في سلالة الخميرة التي تحولت مع PXR و SRC-1. ومع ذلك ، لا يوجد تحريض لتعبير LacZ (المستعمرات البيضاء) في الخميرة المحولة بنواقل فارغة ، PXR أو SRC-1 بشكل فردي (الشكل 3). لتحديد ما إذا كان الكيتوكونازو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في مقايسة Y2H المعدلة ، حددنا بقايا مهمة لتفاعلات الكيتوكونازول على PXR6. نظرا لأن SRC-1 هو منشط مساعد (وتم استنساخه في ناقل pGADNot) ، فقد اختبرنا أيضا ما إذا كان SRC-1 يمكنه تنشيط تعبير lacZ عند استنساخه في نظام ناقل pSH وما إذا كان هذا سيغير ملف تعريف التنشيط و / أو يؤثر على تسرب مقايسة الخميرة ثنائية الهجين. باستخدام البلازميدات المعاد تصميمها ، أجرينا فحوصات هجينة في erg3Δ / erg11Δ الخميرة. كما كان من قبل ، نوضح أن تعبير lacZ (المستعمرات الزرقاء) يتم إحداثه أيضا في erg3Δ / e.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) CA127231 وجائزة المحقق السريري لمؤسسة دامون رونيون (CI 1502) (إلى SM). نود أن نشكر البروفيسور Zdenek Dvorak من جامعة بالاكي أولوموك ، جمهورية التشيك على رؤيته المفيدة في مناقشة قابلية نقل هذه التقنية إلى مؤسستهم وتوحيد البروتوكول.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
سلالة الخميرة CTY10-5d erg3< / em>Δ/erg11ΔمختبرناCTY10-5d مرتين ERG3 < / em> و ERG11< / em> (erg< / em>3< / em>&Delta؛ / erg11 & Delta;) الجينات 6< / sup>.
YPD Growth MediumBD Biosciences630409
Difco خميرة قاعدة نيتروجين (YNB) بدون الأحماض الأمينية وكبريتات الأمونيومBD Biosciences233520
Bacto AgarBD Biosciences214010
CSM-His / -Leu خليط المكملات الغذائية الكاملMP Biomedicals4250-412
ONPG (o-Nitrophenyl & Beta ؛ -D- Galactopyranoside).سيجما ألدريتشN1127
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
مرق لوريا (LB)Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
المنوية السلمون المسلوق (10 مجم / مل)Life Technology156-017
AmpicillinAcros Organics61177
KetoconazoleSigma-AldrichK1003
N ، N-DimethylformamideAcros Organics326871000
أسيتات الليثيومسيجما-ألدريتشL4158
محلول 50٪ PEG-3350 ، غشاء
النيتروسليلوز10402091
10 سمفيشر875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'مختبرناPXR LBD التمهيدي الأمامي ل pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'مختبرناPXR LBD التمهيدي العكسي ل pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGAGAGTTCATCC -3'مختبرناSRC-1 التمهيدي الأمامي ل pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'مختبرناSRC-1 التمهيدي العكسي ل pGADNOT
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
BamHIمختبرناR0136
SalIمختبرناR0138
NotIمختبرناR0189
تم إخراج خميرة DNA من المعقم بالفلتر ، طبق بتري واتمان

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
  2. Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Two hybrid AssayNuclear Receptor InteractionPXR Ligand BindingKetoconazole Binding SitesSRC 1 CoactivatorMutational Library ScreeningLiquid Beta Galactosidase AssayFilter Colony AssayAntagonist Binding SitesHigh Throughput Screening

Related Articles