الأمثل تلطيخ سلبي: بروتوكول عالية الإنتاجية للدراسة صغيرة وغير المتناظر هيكل البروتين بواسطة المجهر الإلكتروني

Summary

أكثر من نصف البروتينات هي بروتينات صغيرة (الكتلة الجزيئية <200 كيلو دالتون) التي تم تحدي لكل من الإلكترون التصوير المجهر وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد. الأمثل تلطيخ السلبية هو بروتوكول قوية وعالية الإنتاجية للحصول على صور عالية التباين والبروتينات غير المتماثلة الصغيرة أو المجمعات تحت الظروف الفسيولوجية المختلفة مرتفعة نسبيا القرار (~ 1 نانومتر).

Abstract

تقرير الهيكلي من البروتينات وليس تحديا للبروتينات مع الجماهير الجزيئية بين 40-200 كيلو دالتون. وبالنظر إلى أن أكثر من نصف البروتينات الطبيعية لديهم الكتلة الجزيئية بين 40-200 كيلو دالتون ^1،2، هناك حاجة إلى وسيلة قوية والإنتاجية العالية مع قدرة قرار نانومتر. تلطيخ السلبية (NS) المجهر الإلكتروني (EM) هو نهج سهلة وسريعة، والنوعي الذي كثيرا ما تستخدم في مختبرات الأبحاث لدراسة بنية البروتين والبروتين البروتين التفاعلات. للأسف، NS البروتوكولات التقليدية كثيرا ما تولد التحف الهيكلي على البروتينات، وخاصة مع البروتينات الدهنية التي تشكل عادة تقديم الأعمال الفنية النضائد. باستخدام صور من البروتينات الدهنية من البرد الإلكترون المجهري (البرد EM) كمعيار، تم فحص المعايير الرئيسية في NS ظروف التحضير عينة مؤخرا وتحدثت باسم NS بروتوكول الأمثل (OpNS)، والبروتوكول التقليدي NS تعديل ^3. التحف مثل ريال عمانيuleaux يمكن الحد بشكل كبير من قبل OpNS، بالإضافة إلى توفير التباين العالي مع معقول عالية الدقة (بالقرب من 1 نانومتر) وصور للبروتينات صغيرة وغير المتماثلة. هذه الصور عالية الدقة وعالية التباين، بل هي مواتية للبروتين الفردي (كائن واحد، أي المتوسط) إعادة الإعمار 3D، مثل 160 كيلو دالتون الأجسام المضادة، من خلال طريقة التصوير المقطعي الإلكترون ^4،5. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون أداة OpNS الإنتاجية العالية لفحص مئات العينات من البروتينات الصغيرة. على سبيل المثال، تضمنت آلية المنشورة سابقا من 53 كيلو دالتون البروتين نقل الكوليسترول استر (CETP) الفحص والتصوير من مئات العينات ^6. النظر في البرد EM نادرا بنجاح الصور البروتينات أقل من 200 كيلو دالتون له بعد نشر أي دراسة شملت فحص أكثر من مائة عينة الظروف، فمن الإنصاف أن يدعو OpNS طريقة الإنتاجية العالية لدراسة البروتينات الصغيرة. نأمل بروتوكول OpNS المعروضة هنا يمكن أن تكون أداة مفيدة لدفع حدود EM وتسريع الدراسات EM في هيكل بروتين صغير، وديناميات وآليات.

Introduction

فهم وظيفة البروتين يتطلب معرفة بنية البروتين. تقرير الهيكلي تحديا للبروتينات التي تقع ضمن الجماهير الجزيئية 40 - 200 كيلو دالتون. البلورات بالأشعة السينية يقتصر بواسطة بروتين التبلور. الرنين النووي المغناطيسي (NMR) مطياف يقتصر على الجماهير الجزيئية أقل من 40 كيلو دالتون، في حين المجهري البرد الإلكترون (البرد EM) لديه صعوبة في الحصول على الصور على حد سواء وثلاثية الأبعاد (3D) إعادة بناء البروتينات الصغيرة التي هي أقل جماهير الجزيئية من 200 كيلو دالتون. والجدير بالذكر أن أكثر من 50٪ بروتينات لها الكتلة الجزيئية ضمن نطاق 40-200 كيلو دالتون ^1،2، والطرق الحالية تشكل تحديا في دراسة البروتينات من هذا الحجم، هناك حاجة إلى طريقة جديدة.

على الرغم من أن معظم المجاهر الإلكترونية الإرسال (إحساس الغانيين) قادرة على قرار الذري، أي أفضل من (3) قرار Å، حتى تحقيق بنية القريب قرار نانومتر من العينات البيولوجية هو challen بدلاجينج ^7. أضرار الإشعاع والتباين المنخفض، الانحرافات الهيكلية فضلا عن القطع الأثرية مثل الجفاف كل تعيق عالية الدقة TEM التصوير ^3،8.

بين النهج TEM مختلفة، البرد EM هو وسيلة متقدمة وأحدث لتحقيق الهياكل قرار ذرية من الجزيئات الكبيرة متماثل للغاية في ظل الظروف الفسيولوجية بالقرب من ^9-12. يتم تحضير العينة البرد EM فلاش تجميد محلول العينة، تضمين الجزيئات في الجليد الزجاجي، الذي التقط لاحقا عند درجات الحرارة المبردة مثل النيتروجين أو الهليوم السائل درجات الحرارة ^13. البرد EM هو مفيد في تلك العينات وجود أي التحف وهم السكان الأصليون تقريبا في الهيكل ^8-12. البرد EM لديها سلبياته: ط) مطلوبة أجهزة إضافية ليتم تثبيتها أو شراؤها للترقية أداة TEM القياسية للقدرة البرد EM. وتشمل الأجهزة: مكافحة contaminator، البرد حامل، جرعة منخفضة من وضع برامج وجرعة منخفضة من سينسيTIVE CCD الكاميرا، على الرغم من أن أسعار هذه الأجهزة هي أقل بكثير من سعر الأداة TEM نفسه؛ ب) تحتاج عملية البرد EM قتا أطول من عملية NS. فحص عينة البرد EM غالبا ما يتطلب وقتا أطول لإعداد العينات وتشغيل أداة TEM من ذلك من NS بسبب البرد EM يتطلب معالجة صعوبات إضافية، بما في ذلك: درجة حرارة النيتروجين السائل العملية، عينة الشحن، والانحراف التصوير، والتدرجات درجة الحرارة، جرعة منخفضة تشغيل النموذج، الحساسيات الإشعاع عينة والقيود الجرعة. وهذه خطوات إضافية تبطئ من سرعة الحصول على بيانات مفيدة مقارنة الحصول على البيانات NS، على الرغم من أن عدد قليل من الصور البرد EM يمكن بالتأكيد الحصول في 1 ساعة أو أقل قبل خبراء البرد EM مع وثيقة أعدت في درجة حرارة التدرج متوازن. ج) للمستخدمين تتطلب تدريبا إضافيا، مثل التعامل مع النيتروجين السائل، وتجميد شبكات البرد EM، عملية جرعة منخفضة، قياس الجرعة، التعامل مع الشحن، والانجراف والمعرفة في بروك التصويرessing. د) عدم وجود التصوير تكرار لنفس العينة-البرد خلال جلسات TEM مختلفة. تلف العينات البرد EM بسهولة عن طريق تلوث الجليد خلال عينة التحميل والتفريغ إلى / من الصك TEM. هذا الضرر هو مصدر قلق خاصة عندما يصعب أن تكون معزولة العينات / تنقيته ^14؛ ت) بروتينات صغيرة (<200 كيلو دالتون الكتلة الجزيئية) يتحدون ليمكن تصوير بسبب تباين منخفضة؛ السادس) على النقيض منخفضة وضوضاء عالية من الصور البرد EM يقلل من قيمة عبر ارتباط بين الصور، لذلك، خفض دقة الشاملة في تحديد التوجهات البروتين، التشكل والتصنيفات، وخاصة بالنسبة البروتينات التي هي مرنة هيكليا وتتقلب بشكل طبيعي في حل ^4،5.

تلطيخ السلبية (NS) هو أسلوب نسبيا "القديم" والتاريخي الذي أي مختبر، مع أي نوع EM، يمكن الاستفادة لدراسة بنية البروتين. برينر وهورن أول من طور مفهوم سو تلطيخ السلبية قبل نصف قرن لفحص الفيروسات ^15. ويتم إنجاز NS من خلال طلاء العينة مع المتهمين أملاح المعادن الثقيلة. هذا المفهوم تأتي أصلا من المجهر الضوئي وممارسة دمج البكتيريا في حل وصمة عار توفير الظلام حول العينات، مما يتيح أعلى تباين الصورة عند عرض صورة سلبية ^16. منذ ايونات المعادن الثقيلة لديها قدرة أكبر على تفريق الإلكترونات مقارنة مع أقل كثافة الذرات في البروتينات ^17-20، وصمة عار طلاء المعادن الثقيلة يسمح وجود قيود جرعة أعلى مع تحسين التباين. يمكن أن توفر عينة NS صور عالية التباين ⁸ لتسهيل تحديد اتجاه الجسيمات وإعادة الإعمار 3D من الصور من البرد EM.

NS التقليدية، لسوء الحظ، يمكن ان تنتج القطع الأثرية الناجمة عن التفاعلات وصمة عار البروتين، مثل التجميع العام، التفكك الجزيئي، تسطيح والتراص ^8،21،22. لدهن المتعلقة المتواجدالإضافية، مثل البروتينات الدهنية ^16،23-30، ونتائج القطع الأثرية المشتركة في الجزيئات التي مكدسة ومعبأة معا في نضائد (الشكل 1) ^31-36. العديد من الدراسات البروتين الدهني، مثل nondenaturing التدرج الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد، البرد EM يدرس ^{13،29،37-40،} مطياف الكتلة ^39،41، والصغيرة بيانات حيود الأشعة السينية زاوية ⁴² جميع الجسيمات هي جسيمات البروتين الدهني تظهر معزولة بدلا من مكدسة بشكل طبيعي معا تشكيل نضائد ^{21،29،30،35،42-45.} ربما كان السبب في مراقبة تشكل النضائد التي كتبها NS التقليدية من خلال التفاعلات الدينامية بين البروتينات الدهنية تتكون من (APO) apolipoproteins والدهون الفوسفاتية التي تتسم بالمرونة هيكليا في حل ^{13،29،30،46-49} والحساسية للبروتوكول NS القياسية. للتعرف على هذه الأداة، استخدمت ئي E4 (apoE4) بالميتويل-oleoylphosphatidylcholine (POPC) البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) عينة كعينة اختبار وcryo-EM الصور لقطعة أثرية خالية مستوى ^29، وفحص العينات NS أعدت في إطار سلسلة من الشروط. بمقارنة أحجام الجسيمات والأشكال الحصول عليها من البرد وNS-EM، تم العثور على نوع معين من كاشف تلطيخ وتركيز الملح ليكون معلمتين الرئيسية مما تسبب في الظواهر النضائد معروفة. وبالتالي، أفيد بروتوكول الأمثل لتلطيخ السلبية (OpNS).

بواسطة OpNS، تم القضاء على ظاهرة النضائد معروفة من قبل OpNS apoE4 HDL (الشكل 2A). أظهر التحليل الإحصائي OpNS عوائد صور مماثلة جدا (أقل من 5٪ انحراف) في الحجم والشكل مقارنة مع تلك من البرد EM، ولكن تم القضاء على التباين. أجريت على التصديقات من OpNS عن طريق فحص القضاء على قطعة أثرية النضائد ما يقرب من جميع الطبقات أو الفئات الفرعية من عينات البروتين الدهني ^{6،29،30،50،51،} بما في ذلك برنامج عمل ألماتي-I 7.8 نانومتر (الشكل 2B)، 8.4 نانومتر (الشكل 2C) و 9.6 نانومتر دiscoidal أعيد HDL (rHDL) (الشكل 2D)، 9.3 نانومتر كروية rHDL (الشكل 2E)، البشري HDL البلازما (الشكل 2F)، الدهون مجانا برنامج عمل ألماتي-I (الشكل 2G)، HDL البلازما (الشكل 2H)، البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL ) (الشكل 2I)، البروتين الدهني المتوسطة الكثافة (IDL) (الشكل 2J)، البروتين الدهني منخفض الكثافة جدا (VLDL) (الشكل 2K)، وPOPC الحويصلية (الشكل 2L) ^30. أجريت التصديقات إضافية عن طريق التصوير بروتينات صغيرة وغير المتماثلة، بما في ذلك 53 كيلو دالتون البروتين نقل الكوليسترول استر (CETP) (الشكل 3A - C) ^6،29، ودرجة عالية من المرونة 160 كيلو دالتون مفتش الأضداد (الشكل 4A وباء) ^{4،5،29 (52 عاما)} واثنين من البروتينات الهيكلية المعروفة، GroEL وproteasome (الشكل 2M و N). لطلب أي التحقق من صحة إضافي من جolleagues، ونحن منفتحون على أي الاختبارات العمياء في هذه الطريقة OpNS.

OpNS كبروتوكول عالية الإنتاجية كما تم استخدامها لدراسة آلية البروتين عن طريق فحص مئات العينات من البروتينات الصغيرة، مثل CETP التي كانت ملزمة لبروتينات مختلفة في ظل الظروف سلسلة (بما في ذلك CETP التفاعل إلى 4 فئات من البروتينات الدهنية، معاد HDL، البلازما HDL، LDL وVLDL، مع / بدون 2 الأجسام المضادة، H300 وN13، تحت مرة 9 الحضانة، بما في ذلك 3 دقيقة، 20 دقيقة، 1 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعة، 8 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة و 72 ساعة، أقل من 4 نسب الضرس، أي 1: 0.5، 1: 1، 1: 2، 1: 4، و 3 التخفيفات، أي 0.1 ملغ / مل، 0.01 ملغ / مل و 0.001 ملغم / لتر، بالإضافة إلى عينات تحكم إضافية، بما في ذلك CETP وحده، وحده LDL، VLDL وحدها، مع اختبارات ثلاثية من التجارب المذكورة أعلاه من قبل أشخاص مختلفين) ^6،29. OpNS صور CETP قدمت الصور عالية التباين مع تفاصيل الهيكلية غرامة معقول. مما يسمح لنا لإعادة بناء بنجاح خريطة 3D كثافة 53 كيلو دالتون SMAليرة لبنانية البروتين CETP (الشكل 3D - F) من خلال إعادة الإعمار جسيم واحد. وعلاوة على ذلك، فإن التباين العالي OpNS الصور توفر لنا إشارة كافية من البروتين الفردية (الشكل 4A - C)، الأمر الذي سمح لنا لتحقيق قرار وسيطة (~ 1.5 نانومتر) من واحد (كائن واحد، أي المتوسط) هيكل مفتش الأضداد 3D عبر طريقة الفرد الجسيمات التصوير المقطعي الإلكترون (IPET) (الشكل 4E - J) ^5. تم الإبلاغ عن وصف مفصل لاستراتيجية IPET إعادة الإعمار، والمنهجية، خطوة بخطوة العمليات وتحليل التباين الهيكلي سابقا ^4. وكان فيلم عن إجراءات إعادة الإعمار IPET الأجسام المضادة، بما في ذلك الصور الخام والنتائج الوسيطة، خريطة كثافة 3D والالتحام الهيكلي أيضا متاحة للجمهور من خلال تحميلها على موقع يوتيوب ^5. مقارنة بين إعادة البناء 3D مختلفة من الأجسام المضادة الجزيئات الفردية يمكن أن تكشف ديناميات البروتين وجالتغييرات onformational خلال التفاعلات الكيميائية ^4،5.

وبالنظر إلى أن أكثر من 50٪ من البروتينات لها الكتلة الجزيئية التي تتراوح 40-200 كيلو دالتون ^1،2، يدل على نجاح في تصوير هذه البروتينات الصغيرة التي طريقة OpNS هو أداة مفيدة لدفع EM الحدود التقليدية تجاه قرارات هيكلية صغيرة وغير المتماثلة والاكتشافات آلية . وبالتالي، يتم توفير بروتوكول مفصلة على النحو التالي.

Protocol

1. إعداد سلبي الطازجة تلطيخ الحل عند 1٪ (ث / ت)

1. وضع 1 ملغ فورمات اليورانيل (UF) مسحوق في زجاجة تحتوي على 100 مل منزوع الأيونات الماء في غرفة مظلمة أو مربع.
2. تحريك الحل O / N في RT في غرفة / مربع مظلم. التفاف زجاجة حل مع رقائق الألومنيوم لمنع الضوء من ضرب الحل.
3. تصفية الحل شنت بلطف من خلال 0.2 ميكرون (حجم المسام) تصفية على حقنة 5 مل. تم جمع الحل تصفيتها إلى عدة رقائق الألومنيوم المغطاة أنابيب فالكون. ويجب أيضا أن تكون ملفوفة الحقنة فلتر مع رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء.
4. تصفية الحل مرة أخرى من خلال 0.02 ميكرون (حجم المسام) مرشح شنت على 1 مل حقنة. وقد تم جمع الحل تصفيتها وقسامة في قارورة 2 مل. المحاقن وقارورة يتم تغطيتها بورق الألمنيوم قبل استخدامها.
5. تجميد قارورة قسامة باستخدام ملقط التعامل معها منذ فترة طويلة غمر قارورة في النيتروجين السائل الحاويات شغل فورابعد أن تم تصفيتها الحل.
6. نقل القنينات المجمدة في الفريزر -80 درجة مئوية لتخزين واستخدام في المستقبل.

2. إعداد محطة العمل تلطيخ السلبية والحضانة محطة العمل

1. ذوبان الجليد قارورة من 1٪ UF حل في حمام مائي وضعت في RT. تأكد من أن رقائق الألومنيوم لا تزال ملفوفة حول القنينة لمنع التعرض للضوء.
2. تصفية الحل هو إذابة تماما بعد ذلك باستخدام رقائق الألومنيوم ملفوفة شنت 1 مل حقنة مع 0.02 ميكرون التصفية. جمع الحل تصفيتها في رقائق الألومنيوم الجديد ملفوفة قارورة، ووضعها على الجليد داخل سقف يغطيها الجليد مربع الانتظار للاستخدام.
3. جعل وحات الحل بواسطة الإصبع دفع ورقة Parafilm طويلة ~ 8 بوصة على سطح لوحة فارغة البروتين التبلور. فإنه سيتم إنشاء الصفوف لوحات دائرية بقطر 5 مم ~. جعل 6 لوحات في كل مكان التوالي لوحات Parafilm على سطح الجليد بالارض داخل الجليد تحتوي علىإيه الغطاء، كمحطة عمل تلطيخ.
4. ماصة ~ 35 ميكرولتر منزوع الأيونات الماء على كل من ترك ثلاث لوحات في كل صف، وماصة ~ 35 ميكرولتر تصفيتها حل UF إلى اليمين ثلاث لوحات في كل صف. تغطية محطة تلطيخ مع غطاء لمنع التعرض للضوء قبل تلطيخ البروتينات.
5. إعداد محطة حضانة شبكة EM عن طريق ملء مربع فارغ في منتصف الطريق مع الثلج، والالتزام بجانب الحظيرة التي يمكن تركيبها على قاعدة المساندة. وضع ملاقط العينة في الحظيرة، والذي نصائح ملاقط "هي بالقرب من سطح الجليد. تغطية نصف نصائح ملاقط من خلال ارتفاع مربع الشفة. مربع الجليد مثالية لجعل محطة حضانة يستخدم وعاء نصائح الماصة فارغة.

3. OpNS عملية

1. توهج في أداء رقيقة فيلم الكربون المغلفة 300 يتناغم شبكات النحاس EM لمدة 10 ثانية.
2. التقاط الشبكة مع ملاقط وملاقط ربط في الحظيرة عن طريق الحفاظ على الشبكة في 45 درجة الميل و1 بوصة فوق الجليدالسطح داخل محطة الحضانة.
3. تمييع عينة بروتين مع Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DBPS) في تركيز البروتين النهائي من 0.01 إلى ~ ~ 0.005 ملغ / مل. إيداع ~ 4 ميكرولتر المخفف عينة مباشرة بعد التخفيف على الجانب الكربون من EM الشبكة. (DPBS يمكن تغيير عازلة لآخر إذا كان البروتين حساس للDPBS)
4. احتضان العينة على شبكات EM ل~ 1 دقيقة داخل محطة الحضانة.
5. إزالة الزائد من خلال حل بسرعة لمس حافة الشبكة مع ورق الترشيح.
6. لمس الشبكة بسرعة لأول قطرة (~ 35 ميكرولتر) من سطح الماء النقي فوق ورقة Parafilm الحق بعد إزالة الحل الزائد على الشبكة EM. ثم إزالة الماء الزائد فورا مع ورق الترشيح.
7. كرر الخطوة 3.6 لآخر مرتين عن طريق غسل الشبكة EM على اثنين من قطرات الماء المتبقية على Parafilm (الخطوة 3.6 و 3.7 يمكن تخطي إذا كانت العينة حساسة للغاية في الماء).
8. تعويم GRI EMد مباشرة على سطح أول قطرة من UF حل مباشرة بعد الماء الزائد على الشبكة EM تم إزالتها. ثم احتضان لمدة 10 ثانية. تأكد لإنهاء إجراءات مياه الغسيل داخل 3 ثانية قبل العائمة الشبكة على سطح الحل UF. وأقصر وقت الغسيل، سيكون ذلك أفضل نوعية.
9. تنظيف ملاقط عن طريق اختراق النصائح في ورقة فلتر ل~ 2 - 3 مرات.
10. إزالة الحل الزائد على الشبكة من خلال الاتصال على حافة الشبكة مع ورقة الترشيح، ثم تطفو الشبكة على الهبوط الثاني من UF.
11. مواصلة فوق خطوة 3.10 على الحبرية الثانية.
12. تطفو الشبكة على الحبرية الثالثة من حل UF وتغطية محطة تلطيخ ل~ 1 دقيقة.
13. خطوة اختيارية: غسل الشبكة بسرعة على رأس الماء كما هو موضح في 3.6. وهذه خطوة إضافية يستفيد عينات تحتوي على أكثر من جزيئات الذهب المجانية المحملة أو الخلفية صمة عار.
14. إزالة الحل الزائد عن طريق لمس ورقة الترشيح إلى الالبريد كامل المؤخر شبكة (مقابل الجانب الكربون). تجف الشبكة تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين في RT الحق بعد مراقبة الحل لاستيعاب ورقة الترشيح.
15. وضع الشبكة على ورقة من ورق الترشيح داخل طبق بتري، وتغطي طبق جزئيا مع قبعة لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل تحت RT. بالنسبة لبعض العينات، ووضع شبكة في 40 ° C حاضنة الخبز لساعة.
16. تخزين الشبكة في مربع شبكة EM EM لفحص في المستقبل.

4. EM فحص

1. محاذاة TEM بشكل صحيح قبل EM فحص بروتينات صغيرة على الشبكة.
   1. مراجعة القرار من أعلى مرئية ثون الدائري الذي هو طيف الطاقة من فيلم الكربون غير متبلور لتحديد ما إذا كان TEM تم محاذاة بشكل صحيح. منذ يتم تقاسم TEM قبل العديد من المستخدمين مختلفة، وغالبا ما لا محاذاة TEM بشكل صحيح.
   2. التحقق بعناية من طيف الطاقة على المنطقة فيلم الكربون من العينة لضبط المحاذاة شرطان من الجهاز. أعلى مرئية ثون حلقات هي أفضل من القرار المستهدفة.
      ملاحظة: وكمثال على التوافق السليم من TEM LaB6 خيوط تعمل تحت 120 كيلو فولت التوتر الشديد، أكثر من 20 ثون حلقات يمكن تصور فيها، وقرار المقابل يمكن أن يكون أفضل من 5.0 Å. وقد تحقق هذا ثون الدائري عن طريق التحويل فورييه من فيلم الكربون غير متبلور تصويرها تحت يزيل التباؤر من ~ 1.6 ميكرون وجرعة من 20.4 ه / A2 (الشكل 5).
      ملاحظة: من مراقبة عالية الدقة ثون الدائري هو شرط ضروري، ولكنه ليس شرطا كافيا لالمحاذاة الصحيحة. لتحقيق الواقع صور عالية الدقة، والعديد من العوامل الأخرى مهمة أيضا، مثل نوعية العينة، وأضرار الإشعاع، شحن والانجراف وكذلك معدل الجرعة الإضاءة.
2. جلب يزيل التباؤر إلى شبه شيرتسر التركيز لتصوير البروتينات صغيرة على مساحة الملون بشكل مثالي.
3. البحث عن منطقة "جزئيا" لايماجه. عادة ما تقع منطقة ملطخة مثالي بالقرب من حافة منطقة صمة عار سمكا، والتي تبدو مثل منطقة "جزئيا" على الشبكة منذ سمك وصمة عار عادة يست موزعة بالتساوي على الشبكة المغلفة الكربون (الشكل 6). وعادة ما كان التكبير المنخفض (<100X) للمساعدة في العثور على هذه المناطق الغائمة أولا قبل التكبير للتصوير.

Results

تشمل تطبيقات OpNS الامتحانات الهيكلية والمورفولوجية لمختلف أنواع البروتين الدهني مثل: الوليد HDL المؤتلف (rHDL)، HDL المؤتلف كروية، HDL البلازما، LDL، VLDL IDL و(الشكل 2) ^30؛ وكذلك البروتينات الصغيرة مثل 53 كيلو دالتون CETP (من بين أصغر البروتينات بنجاح من خلال تصوير EM) (الشكل 3) ⁶ والأجسام المضادة مفتش 160kDa (واحد من البروتينات الأكثر ديناميكية وغير متجانسة) (الشكل 4) ^4،5،29،52 حتى 28 كيلو دالتون الدهون ئي مجانا A-1 (الشكل 2L)، وGroEL وProteasomes (الشكل 2M وN).

أمثلة أخرى من OpNS كوسيلة الإنتاجية العالية يدرسون البروتين البروتين التفاعلات لكشف آليات البروتين، مثل 53 كيلو دالتون CETP. كما هو موضح في المقدمة، كيف يتفاعل مع CETP فرعية مختلفة من البروتينات الدهنية كانت investigaتيد عبر فحص أكثر من 400 عينات EM ⁶ بقدر ما نعلم، لم يكن هناك أي قضية مثل هذه الدراسة البرد EM الذي ينطوي على فحص ما يقرب من مائة ظروف مختلفة.

يمكن OpNS توسيع حدود EM لدراسة صغيرة وغير المتناظر هيكل البروتين 3D وحتى تتوسع لتحقيق هيكل 3D تشكيل بروتين واحد والفردية (دون المتوسط). على سبيل المثال، مفتش الأضداد هو 160 كيلو دالتون جزيء مع بنية مرنة للغاية، فيه إعادة الإعمار 3D في قرار وسيط يمثل تحديا لتحقيقه. تم استخدام أسلوب OpNS إلى صورة الأجسام المضادة مفتش الفردية من سلسلة من زوايا إمالة (الشكل 4E وH). الصور معقول عالية الدقة والتباين العالي من البروتين OpNS يسمح لإعادة إعمار الناجح لبروتين واحد من الجسيمات الفردية المقطعي الإلكترون (IPET) (الشكل 4E - J) ^4،5. في إعادة الإعمار IPET 3D (الشكل 4F وG) ^4. من النهج نفسه، أعيد بناء مجمع الأضداد الببتيد واحد، والببتيد التي يسببها التغيير متعلق بتكوين المجال الداخلي لجسيم واحد تم اكتشاف الأجسام المضادة (الشكل 4I وJ، القرار ~ 16.6 Å) ^4،5. مقارنة اعادة البناء 3D من الجزيئات الفردية مختلفة، والتحليل البنيوي قد تسمح لنا لكشف البروتين التقلبات الحرارية، وحتى "المفاجئة شوت" المراحل المتوسطة من تفاعل كيميائي ^{4،5،29،53،54.}

وباختصار، فإن البروتينات مع الكتلة الجزيئية بين 40 كيلو دالتون - 200 كيلو دالتون تشكل تحديا للامتحانات الهيكلية EM القياسية واعادة البناء. وبالنظر إلى أن أكثر من 50٪من البروتينات لها الكتلة الجزيئية التي تتراوح 40-200 كيلو دالتون ^1،2، ونحن التقرير طريقة OpNS كأداة قوية وعالية الإنتاجية لدفع EM الحدود التقليدية تجاه قرارات هيكلية صغيرة وغير المتماثلة وحتى الدراسات الميكانيكية.

الرقم 1. رولو قطعة أثرية من البروتينات الدهنية بواسطة التقليدية تلطيخ السلبية (NS) EM. الميكروسكوب الالكتروني (فوق الألواح) والجسيمات مختارة (دون لوحات) تظهر البروتينات الدهنية المختلفة مع نضائد بعد NS مع حمض الفسفوتنغستيك (PTA) تحت الإجراء مزيج القياسية. (A) المعاد HDL (rHDL) مع ApoE4، (B) برنامج عمل ألماتي-I التي تحتوي على 9.6 نانومتر قرصي rHDL، (C) apoB تحتوي على LDL البلازما، (D) التي تحتوي على غير ئي-الليبوزومات POPC. القضبان: 50 نانومتر. حجم الإطار: A و C، 20 نم؛ B، 30 نانومتر. مجلة البحوث الدهن نشرت في البداية هذا العمل ^29،30. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم هيكل 2. البروتين بواسطة الأمثل تلطيخ السلبية الميكروسكوب (OpNS) EM الكترون تظهر مختلف البروتينات الدهنية والجسيمات الشحمية دون النضائد قطعة أثرية من OpNS (A) apoE4 التي تحتوي على rHDL؛ (B) 7.8 نانومتر rHDL، (ج) 8.4 نانومتر rHDL، ( D) 9.6 نانومتر rHDL، (E) 9.3 نانومتر كروية rHDL، (F) البلازما البشرية α-HDL، (G) البلازما HDL، (H) LDL البلازما البشرية؛ (I) IDL البلازما البشرية؛ (J) VLDL بلازما الإنسان؛ (L) من المادة الدهنية الحرة برنامج عمل ألماتي-I. وقد تم التحقق إضافية باستخدام (M) GroEL والعينات (N) Proteasome. الميكروسكوب (لوحات أعلاه) والجسيمات مختارة (دون لوحات). القضبان: 50 نانومتر. حجم الإطار: A - D، 20 نانومتر؛ E و F، 25 نانومتر؛ G، 20 نانومتر؛ H، 25 نانومتر؛ I، 50 نانومتر؛ J و K، 100 نانومتر؛ L، 80 نانومتر، باستثناء الدهون مجانا برنامج عمل ألماتي-I، GroEL وProteasome، وقد نشرت هذه الدراسة في الأصل في مجلة أبحاث الدهون ^29،30. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. الميكروسكوب OpNS الإلكترون من CETP. (A) مع نظرة مجهرية CETP (متقطع الدوائر) الموز على شكل جسيمات (B) Windoweد تحديد الجسيمات الأولية. (C) ثلاثة صور واحدة الجسيمات CETP الخام يظهر بوضوح أكبر وأثقل وأكبر طرف كروي بما في ذلك، أخف وزنا وأضيق طرف (اللوحة اليسرى) أصغر أخرى ومن أعلى تظهر المناطق الطرفية مماثلة مع أقل انحناء العام (وسط لوحة)، ونهاية عرض أسفل المحور الطويل من CETP (اللوحة اليمنى) (D) بتركيب التركيب البلوري (PDB: 2OBD) على هذه الصور الجسيمات CETP الخام، مباريات بشكل جيد في كل شكل وحجم نطاق الهيكلي تبين التوجه يمكن أن يكون ما يقرب من تعريفها مباشرة حتى دون مساعدة عن طريق الكمبيوتر (لوحات الموافق (C)). (E) مرجع متوسطات الدرجة 2D مجانية (عملية من أساسها لحساب التشابه (حساب عبر الارتباط) من هذه الجسيمات الموجهة بشكل عشوائي، وجود جزيئات تم تجميع التشابه عالية لبعضها البعض، ثم محاذاة المتوسط ​​للحد من الضوضاء في الخلفية وتعزيز الجسيمات صورة يخدعالنقيض. يتم حساب المتوسطات الدرجة 2D مجانا إشارة من قبل البرامج refine2D.py في حزمة EMAN، التي، لا أي إنسان جعل النموذج الأولي كان ضالعا في هذا المتوسط ​​الصف. المتوسطات فئة مرجع يمكن استخدامها كطريقة مستقلة للتحقق من صحة إعادة الإعمار 3D من إعادة الإعمار واحد الجسيمات). تظهر (F) اشارة مختارة متوسط ​​الدرجة 2D مجانا لنهاية البعيدة أكبر بالمقارنة مع غيرها. (G) لتركيب التركيب البلوري (PDB : 2OBD) بالمقارنة مع المتوسطات المجانية المرجعية، تراكب الصور تظهر نتيجة مثالية قرب بين الكريستال هيكل وخالية من إشارة الطبقة المتوسط ​​في كل من شكل هيكل وحجم المجال (لوحة منخفضة) (F) خريطة كثافة 3D من CETP في. أعيد بناؤها بقرار من Å 13 من 8،879 الجسيمات تصويرها بواسطة OpNS وطريقة إعادة الإعمار واحد الجسيمات (اللوحة العلوية) والجسم مخدد رست في هذا الإعمار واحد الجسيمات قبل التركيب البلوري (لوحة منخفضة). وديتونشرت المعلومات ailed إعادة الإعمار جسيم واحد، بما في ذلك صورة تجهيزها، النموذج الأولي، وإجراءات التحسين والتوزيع زاوية وفورييه شل الارتباط (FSC) في المقطع طريقة والمعلومات الداعمة للورقة الأصلية (H) مقارنة النهائية لإعادة الإعمار جسيم واحد ( فوق لوحة) وإضافية PDB تناسب المقارنة (اللوحة السفلية) ^6. القضبان: A، 50 نانومتر؛ B - D، 10 نانومتر؛ F، 3 نانومتر. ونشرت بعض من هذه الأرقام من قبل في علم الأحياء الطبيعة الكيميائية ^6. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. OpNS الصور وإعادة البناء من مفتش الإنسان جزيئات الجسم المضاد 1. (A) أكثر منعرض الصور من الإنسان IgG1 الضد OpNS. الجسيمات هو مبين في الدوائر البيضاء عرض بوضوح الجزيئات مع 3 نطاقات فرعية (B) صور مختارة الخام عالية الدقة من خمسة الجزيئات الفردية اللامقترن الأجسام المضادة و (C) صورا خفض الضوضاء المقابلة لها عن طريق الحد من الضوضاء المحيطة يدويا الخام حافة الجسيمات (بدون أي اتصال الكثافة داخل الجزيئات) لتصور بسهولة. (D) والتركيب البلوري (PDB دخول 1IGT) من IgG1 الأجسام المضادة التي كانت موجهة إلى عرض مشابه إلى الصور EM. مقارنة بين الصور المقابلة تظهر العديد من السمات المشتركة بين الصورة EM والتركيب البلوري، بما في ذلك المناصب نطاق والأشكال. (E) الإجراء خطوة إلى خطوة لإعادة الإعمار من أساسه 3D من واحد الأجسام المضادة IgG1 المثال (لا المتوسط، كائن واحد فرد) باستخدام الجسيمات الفردية المقطعي الإلكترون (IPET طريقة). (F) وإعادة الإعمار 3D النهائي من الاشتراكيةأظهر ngle الجسيمات الأجسام المضادة في حل 14.1 Å دونات على شكل ثلاثة مجالات تشكيل في شكل "Y". (G) الإرساء الهياكل المجالات وضوح الشمس في كل من المناظرة خرائط الكثافة نطاق التوالي، وتكرار الحلقات يدويا بين المجالات. (H) تم عرض الإجراء خطوة إلى خطوة إعادة الإعمار 3D من مجمع واحد مفتش الببتيد (أي المتوسط، كائن فرد واحد) من خلال IPET. (I) وإعادة الإعمار 3D النهائي للمجمع الببتيد مفتش في قرار من 16.6 Å أظهرت ثلاثة قضيب وأظهرت في كل الكثافات شكل قضيب ومطابقة سيئة مع هياكل الكريستال المجال يدل على أن تغيير متعلق بتكوين جزئي نطاق الداخلية: المجالات على شكل تشكيل في شكل "Y" (J) على التوالي، الالتحام التركيب البلوري كل المجالات مفتش الأضداد (1IGT دخول PDB). بعد الاقتران الببتيد. الإجراء مفصل، ووصف قرار التحليل والإحصاءات في الورقة الأصلية 4 والتقارير العلمية ^5. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم الطيف 5. الطاقة من فيلم الكربون غير متبلور تصوير تحت 1.6 ميكرون يزيل التباؤر من قبل زايس الميزان 120 LaB6 TEM. عالية الدقة التصوير يتطلب أدلة كافية لإظهار أن لديه EM محاذاة عالية الدقة والقدرة المناسبة. تحليل طيف الطاقة من منطقة قريبة الكربون على الشبكة وسيلة فعالة للتحقق من حالة تماسك شعاع قبل الحصول على البيانات. نقل فورييه للصورة لمنطقة الكربون غير متبلور تظهر وظيفة نقل النقيض أداة ذات الصلة (C TF)، ما يسمى ثون حلقات. تشكيلة المناسبة والتماسك يمكن أن تنعكس على عدد من حلقات مرئية ثون وأعلى دقة من حلقات ثون مرئية تحت شرط يزيل التباؤر عالية نسبيا. كمثال على قرب حالة المحاذاة الصحيحة للمختبر ₆ خيوط TEM مجهز، أكثر من 20 ~ ثون حلقات (~ 5 Å) يمكن أن تتولد من الكربون يتم تصوير الفيلم في 1.6 ميكرون يزيل التباؤر باستخدام جرعة 20.4 ه ^- / ^2. حلقات ثون تحقق من TEM المنخفضة نهاية لها مماثلة لتلك التي من الراقية TEM، مثل مدفع ميدان الانبعاثات (FEG) TEM تعزيز تعمل تحت شرط المحاذاة الصحيحة. هذا العمل نشرت في البداية في تقارير العلمي ^5. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

6highres.jpg "العرض =" 500 "/>
واستخدمت الشكل 6. الميكروسكوب مثال من المجالات "مثالية" لOpNS التصوير. ثلاث عينات البروتين، (A) GroEL (B) Proteasome (C) كروية HDL، كأمثلة للتدليل على OpNS مثالية للتصوير. منذ يتم توزيع البقع بشكل غير متساو في العينة، والتكبير منخفضة من العينة يظهر عادة "غائم" (أقصى اليسار لوحة). وتقع عادة في مناطق مثالية للتصوير في حدود هذه "الغيوم". مثال خطوة بخطوة التكبير في "غائم" وصمة عار منطقة واحدة (يسار لوحة الوسطى) عرض الصور عالية التكبير مع عرض عالية الدقة وعلى النقيض من الصور عالية من الجسيمات (لوحة المتوسطة اليمنى). صور مختارة من الجسيمات تظهر تفاصيل بنية البروتينات (لوحة أقصى اليمين). القضبان: 30nm الرجاء انقر هنا لمشاهدة كبيرةالنسخة R من هذا الرقم.

الرقم 7. رسم تخطيطي من الإجراءات OpNS. (A) محطة الشبكة EM الحضانة، محطة بسيطة لاحتضان محلول العينة على الشبكة يتوهج تفريغها. (B) تلطيخ محطة العمل، وتهدف إلى الحفاظ على مياه الغسيل قطرات وقطرات صمة عار فوق سرير الجليد، مع تقليل التعرض للضوء وصمة عار. (C) نظرة عامة حول الإجراء تلطيخ، موضحا: النشاف الاتجاه، الشطف بالماء بقوة 3x، 3X UF التعرض صمة عار، والحضانة تلطيخ مع مقلوب شبكة العينة على قطرات صمة عار، وعينة المؤخر النهائية التنشيف لضمان وجود طبقة رقيقة من العينة حل صمة ​​عار قبل التجفيف نيتروجين الهواء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من الهو الرقم.

الرقم 8. عالية - صور قرار من 53kDa بروتين صغير CETP كشفت من تعديل طريقة OpNS، البرد الإيجابي تلطيخ (البرد PS) خمسة اختيار عالية الدقة والشكل الدائري الصور الخام ملثمين من الجسيمات الناعمة CETP (مع تباين العكسي). وشكل الجسيمات ملثمين جسيمات الخام (خفض الضوضاء المحيطة يدويا حواف الصور الجسيمات الأولية "، ولكن من دون أي تعديل الكثافة داخل الجزيئات) لتصور بسهولة. كل ذرة والمقارنة هيكل الشريط الكريستال لملثمين الجسيمات الأولية الانحياز إلى توجهات مماثلة من كل الجسيمات إلى صور EM. تفاصيل عالية الدقة من المجالات الصورة الخام عرض بعض التشابه مع التركيب البلوري، في حين ليس كل ملامح التركيب البلوري يمكن حلها من البيانات الخام. Remarka بلاي، تظهر هذه الصور الخام التشابه في كل محطة ينتهي وجود ثقوب دائرية صغيرة في مكان قريب ينظر في خفض الضوضاء الصور يدويا (مثلثات). علاوة على ذلك، فإن فروع في مناطق C محطة داخل الصور الجسيمات تكمل التركيب البلوري β اوراق (الأسهم)، وأخيرا، جاحظ الحلقات على المنطقة CETP C-النهائية هي أقرب إلى في التركيب البلوري (الديناري). (A) خمسة حدد عالية الدقة والشكل الدائري الناعمة الصور ملثمين الخام من الجسيمات CETP (مع تباين العكسي). (B) قليلة تمرير ترشيح إلى 10A. (C) أعلى تمرير منخفض تصفية إلى 20A. (D) ملثمون يدويا خفض الضوضاء الصور. (E) الكريستال مقارنة هيكل من هيكل الشريط. (F) كريستال مقارنة هيكل بكل ذرة التمثيل. شريط: 5NM. وقد نشر جزء من هذا العمل في علم الأحياء الطبيعة الكيميائية ^6.نحيف "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9. الميكروسكوب الكترون من الجسيمات الشحمية تظهر تشكيل ROULEAU بواسطة بروتوكول NS التقليدي (PTA صمة عار) في ظل اختلاف الملوحة. (A) عالية الملوحة (~ 0.5 MNaCl). (B) الملوحة العادية (~ 0.25 M كلوريد الصوديوم). (C) منخفضة الملوحة (~ 0.1 M كلوريد الصوديوم). (D) الماء النقي. الميكروسكوب (فوق لوحة) وحدد جزيئات إطارات (أقل من لوحة) هو مبين. القضبان: 100 نانومتر. حجم الإطار: 80 نانومتر. مجلة البحوث الدهن نشرت أصلا هذا العمل ^30. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

بالمقارنة مع التقنيات التقليدية NS، يمكن OpNS منع التحف النضائد (الشكل 1 و 9)، وتوفير موثوقة ومعقولة دقة عالية (~ 1nm) التفاصيل الهيكلية للبروتينات صغيرة (الشكل 2). مقارنة البرد EM، OpNS يوفر طريقة إنتاجية عالية ويمكن دراسة مجموعة واسعة من البروتينات والبروتين البروتين التفاعلات ^6. ومع ذلك، لا يزال لديه OpNS سلبياته. مقارنة NS التقليدية، OpNS يستتبع: ط) خطوات أكثر تعقيدا في إعداد العينات. ب) باستخدام مادة مشعة، UF. ج) الحفاظ على وصمة عار جديدة بسبب قوة أقصر من وصمة عار UF بسبب حساسية الضوء فيها؛ د) لمنع هطول يجب تخزين الحل UF في -80 درجة مئوية، ويتطلب ذوبان الجليد قبل الاستخدام. ت) وأخيرا كل UF يجب أن يتم التعامل معها على أنها نفايات خطرة. مقارنة البرد EM، OpNS توفر صورا قرار أقل نسبيا ولا ضمان لأي قطعة أثرية لم تكتشف بعدفي المستقبل.

الآثار الإجرائية العملية NS على تكوين البروتين الدهني النضائد

NS بروتوكولات لإعداد البروتينات للفحص ^{16،29-36،55} يمكن تصنيفها إلى ثلاث مجموعات رئيسية من الأساليب ^{50: 55} الاختلاط، وانخفاض بنسبة انخفاض ^16، وإجراءات الغسيل ^29. ط) يتطلب بروتوكول خلط خلط الأولي للعينة وصمة عار والبروتين بنسبة معينة، ومن ثم تطبيق الحل مختلطة على الفيلم الكربون المغلفة على الشبكة، وإزالة أخيرا حل الزائد مع ورق الترشيح قبل التجفيف في الهواء لفحص EM ^55. ب) ويتضمن بروتوكول قطرة تلو قطرة تطبيق (~ 4 ميكرولتر) قطرة عينة مباشرة إلى شبكة EM الكربون المغلفة في السماح للاعتصام ~ 1 دقيقة، وإزالة الزائد في وقت لاحق محلول العينة قبل تطبيق قطرة (~ 4 ميكرولتر) من وصمة عار الحل على نفس الجانب من الشبكة. ~ بعد 1 دقيقة من الحضانة، وإزالة excesق وصمة عار من خلال الاتصال مع ورقة نظيفة التصفية، التي تقدم أخيرا لتجفيف الهواء ^16،56-58. ج) البروتوكول الغسيل (الشكل 7) تتطلب تطبيق محلول العينة إلى شبكة EM المغلفة في الكربون لمدة 1 دقيقة، ثم يغسل بالماء منزوع الأيونات ثلاث مرات مباشرة بعد إزالة حل الزائد في كل مرة بواسطة ورق الترشيح ^3،29،30. OpNS تم تعديل بروتوكول من هذا الإجراء الغسيل.

NS أنواع البقع والآثار على تشكيل البروتين الدهني النضائد

في NS، نثر الإلكترون أقوى بسبب البقع المعادن الثقيلة توفر النقيض من البروتينات ^17-20،59. يمكن أن عينات NS تعاني بالإضافة إلى المزيد من الجرعات الإشعاعية، وتعزيز الميزات البروتين تناقض أكثر حدة سلبي ^8،9،60. ويمكن تصنيف البقع من المعادن الثقيلة مثل: أنيوني، بما في ذلك حمض الفسفوتنغستيك (PTA) ^16، ميثيل تنغستات ¹⁴ و ⁶¹ السيليكون تنغستات. والموجبةجيم، مثل اليورانيل خلات (UA) ^62، UF ^3،29،30، ونترات اليورانيل (UN) ^63. واحدة من البقع NS أنيوني يستخدم الأكثر شيوعا هو PTA ^33،64-67. PTA هو حمض heteropoly، والتي عادة ما تستخدم حول درجة الحموضة 7،0-7،5. ويمكن أيضا أن تستخدم لمنطقة التجارة التفضيلية لتلطيخ إيجابي ^3،16،68. هذه الاتهامات السلبية لمنطقة التجارة التفضيلية قد توسط التفاعلات مع الدهون غير المشبعة كهرباء موجبة الشحنة مجموعات الرأس، مثل POPC، على كلا البروتين الدهني والحويصلية السطوح. قد يسبب PTA تشكل النضائد من خلال هذا التفاعل ^29،30 حتى ^29،30 عازلة تحت منتظم الملوحة (الشكل 1). البقع اليورانيل، مثل UA، UF والأمم المتحدة هي الخيارات البديلة للالموجبة البقع المعادن الثقيلة وUA على وجه الخصوص كثيرا ما يستخدم لNS مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية ^62،69،70. ووجدت التجارب UF يسبب أي نضائد من البروتينات الدهنية التي تحتوي على الدهون غير المشبعة حمض الدهون، مثل POPC. ومع ذلك، قد لا يزال UF لحث rouleتشكيل مدخل aux على البروتين الدهني التي تحتوي على الدهون المشبعة الأحماض الدهنية، مثل فسفاتيديل dimyristoyl (DMPC) و 1 hexadecanoyl-2-octadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (PSPC). آلية مفصلة لهذا التفاعل غير معروفة. يمكن UA / UF / الأمم المتحدة عن العمل في قيم الرقم الهيدروجيني أقل تتراوح 3،5-4،6. يجوز لهذه القيم الرقم الهيدروجيني أقل غير مناسب لبعض الجزيئات البيولوجية التي تعتبر حساسة لدرجة الحموضة ^14،71. ومن المثير للاهتمام، يمكن UA / UF إصلاح بنية البروتين داخل أجزاء قليلة من الثانية من خلال آلية غير معروفة ^72. خلافا لمنطقة التجارة التفضيلية، UA / UF هو أكثر مماثلة إلى الملح من الأحماض.

UF ورد يمكن أن توفر نتائج أفضل من UA ^73، والتي، UF والأمم المتحدة بقع ذات أحجام أصغر من الحبوب UA (UF: 0.3 نانومتر، الأمم المتحدة: ~ 0.5 نانومتر) ^3،74. مثال للاهتمام، والتفاصيل الثانوية مثل هيكل بروتين صغير (53 كيلو دالتون CETP) يمكن تصور مباشرة من الميكروسكوب الخام عندما كان يستخدم UF والسلبية وصمة عار كاشف باتباعذكرت في وقت سابق البرد الإيجابي تلطيخ (البرد PS) طريقة (الشكل 8) ^6. في البرد PS، كانت عينة ملطخة فلاش المجمدة باتباع البرد EM إجراءات إعداد العينات بدلا من إجراء التجفيف في OpNS البروتوكول الذي قد يتسبب في انهيار الهيكلية الثانوي. والبرد PS هي طريقة لعالية التباين والتصوير ذات الدقة العالية للبروتينات صغيرة ^75. منذ الصور البرد PS وقد عكس النقيض مقارنة بتلك التقارير من بروتوكول البرد NS ^22، ولكن لديها ثابت صورة النقيض من تلك التقليدية من الصور البرد EM، وبالتالي سميت الطريقة البرد PS. تظهر الصور البرد PS أن كاشف تلطيخ، فورمات اليورانيل، تخترق السطح الجزيئي، مما يشكل تحديا وجهة النظر التقليدية التي تلطيخ يمكن تصور فقط بنية السطح الخارجي. آلية لكيفية فورمات اليورانيل تخترق السطح الجزيئي غير معروف. واحد الاحتمالات هو أن الموجبة اليورانيل يربط المتاحة مجموعات الكربوكسيل البروتين، وبالتاليالمحيطة الجليد الزجاجي هو من كثافة أقل من تلطيخ من البروتين والجماعات اليورانيل، وبالتالي بوصفها وصمة عار إيجابية. طريقة البرد PS يشبه متعددة استبدال متشاكل (MIR) الأسلوب، الذي كان نهج مشترك لحل المشكلة في مرحلة البلورات بالأشعة السينية ^76-78. في MIR، هي غارقة عينات الكريستال مع حل ذرة الثقيلة، بما في ذلك اليورانيوم، للحصول على شكل تماثلية إلى شكله الأصلي. إضافة ذرة ثقيلة أحيانا لا يؤثر على تشكيل الكريستال أو وحدة أبعاد الخلية ولكن يوفر معلومات إضافية من الكريستال تحديد الهيكل ^76-78. من خلال الاستفادة من الحبوب صغيرة من UF، يمكن البرد PS يوفر التباين العالي وصورة عالية الدقة من بروتين واحد، وهو أمر مهم للدراسات بنية البروتين، خاصة عندما اعتبر أن ما يقرب من جميع البروتينات الحيوية بشكل طبيعي وغير المتجانسة في الحل. للتأكد من صحة هذه الطريقة البرد PS، نفتح لأي اختبار أعمى من الميدان EM. P>

آثار تركيز الملح على تشكل النضائد في البروتينات الدهنية

باستخدام PTA التقليدية تلطيخ السلبية الكاشف، تشكل النضائد احظ هو أكثر احتمالا المتعلقة التفاعلات الدهون بدلا من التفاعل البروتين. تصوير عينات من POPC الحويصلات الحويصلية أعدت تحت الملوحة كبيرة (0.5 M كلوريد الصوديوم)، والملوحة المعتدلة (0.25 M كلوريد الصوديوم)، ضعيفة نسبيا الملوحة (0.1M كلوريد الصوديوم)، والماء النقي (الشكل 9)، تظهر الميكروسكوب الإلكتروني كان تشكل النضائد المترابطة لتركيز الملح (الشكل 9A - D). باستخدام UF تلطيخ السلبية والكاشف، لم يلاحظ أي النضائد في POPC عينة الحويصلية حويصلة ³⁰ (الشكل 2L)، مما يشير إلى إجراء الغسيل لتقليل تركيز الملح بسرعة الحق قبل تلطيخ هو ضروري، ولكن ليس خطوة كافية بشكل مستقل لمنع النضائد في POPC ذات الصلة العينات.

"jove_content"> التصوير TEM بروتين صغير يتطلب حالة التركيز شبه شيرتسر.

التصوير TEM الناجح للبروتينات صغيرة في دقة أعلى يتطلب شرطين الحرجة، محاذاة شعاع المناسبة وشبه شيرتسر حالة اكتساب التركيز. ط) يمكن الحكم على تشكيلة شعاع المناسبة من خلال عدد من حلقات مرئية ثون (طيف الطاقة) على نقل فورييه لصورة الفيلم الكربون التي تحصل عليها بموجب يزيل التباؤر مرتفعة نسبيا. وأفضل حالة محاذاة شعاع، والمزيد من حلقات ثون يمكن تصور وقابلة للقياس .. ب) اكتساب صورة تحت القريب شيرتسر التركيز هو حالة حرجة أخرى. استراتيجية المعايير التقليدية لتصوير العينات البيولوجية يستخدم عادة يزيل التباؤر عالية (1 - 2 ميكرون وأكثر)، والتي يمكن أن تعزز عينة بيولوجية تباين الصورة ^79. هذه الاستراتيجية هي مهمة تختلف عن استراتيجية نموذجية لتصوير هيكل قرار الذري للمواد الصلبة، والتي غالبا مايستخدم التركيز شيرتسر القريب (~ 50 نانومتر يزيل التباؤر). على الرغم من، يمكن أن يزيل التباؤر أعلى تعزيز البيولوجي عينة المقابل، إشارات عالية الدقة سوف يتم القضاء جزئيا. ونتيجة لذلك، فإن تواطؤ عالية الدقة إشارة تكون أقل في حالة ارتفاع يزيل التباؤر التصوير. والسبب هو أن الصورة TEM هي التفاف هيكل العينة وCTF الصك. وCTF هو منحنى متذبذب ضد تردد، الذي منحنى متذبذب كثيرا عبور الصفر السعة في الترددات العالية. في كل مرة عندما CTF عبر الصفر، سيتم القضاء على إشارة الهيكلية عينة في هذه تردد معين (لن الصفر مرة أي عدد يكون صفرا). إشارة القضاء في هذا التردد لا يمكن استعادتها بواسطة أي خوارزمية تصحيح CTF (صفر مقسوما صفر يمكن أن يكون أي رقم عشوائي بدلا من إشارة الهيكلية الأصلية). تحت أعلى التصوير يزيل التباؤر، فإن CTF التأرجح أكثر صرامة، وبالتالي فإن CTF يعبر الصفر السعة على نحو أكثر تواترا، ونتيجة لذلك،سيتم القضاء على الإشارات الهيكلية في عدد أكبر من ترددات محددة. والمزيد من الإشارات التي يتم القضاء عليها، وأقل تواطؤ الصورة سيكون. وتجدر الإشارة إلى تواطؤ صورة لا يمكن استردادها أو تصحيح من قبل أي تصحيح CTF. ومع ذلك، فإن عددا من الصور غير المكتملة المكتسبة تحت defocuses مختلفة يمكن استخدامها لملء الفجوات لبعضها البعض لحصل على إشارة الهيكلية الانتهاء من الهيكل عينة عن طريق حساب المتوسط، والتي حتى قرار الذري يمكن أن يتحقق ^9-12.

طريقة المتوسط ​​هو نهج قوي لتحقيق بنية بعض البروتينات شديدة التماثل والبروتينات الجامدة المرتبطة هيكليا. ومع ذلك، فإنه لا يزال تحديا في الدراسة الهيكلية للبروتينات صغيرة وغير المتماثلة، خاصة بالنسبة للديناميات الهيكلية المرنة والبروتينات، مثل الأجسام المضادة وHDLs. ويستند المتوسط ​​على افتراض أن جزيئات البروتين متطابقة في هيكل والتشكل لكن ديfferent في التوجهات، ومن المعروف مع ذلك العديد من البروتينات للخضوع لتقلبات الحرارية في الحل. من خلال تطبيق طريقة المتوسط ​​دون أن يعرف سابقا البروتين تقلبات تقلبات الحرارية، وغالبا ما تتسبب في هيكل متوسط ​​المفقودين المجالات ^10،80 أو الاختلاف المحلي في القرار ⁸¹ في اعادة البناء البرد EM.

النجاح في تحقيق إعادة الإعمار 3D من بروتين صغير، مثل 53 كيلو دالتون CETP، وهيكل 3D من بروتين واحد، مثل 160 كيلو دالتون IgG1 الضد، والفوائد من استخدام شبه شيرتسر حالة التصوير التركيز تحت شرط المحاذاة الصحيحة. على الرغم من تباين الصورة يبدو منخفضا في شيرتسر-بالقرب من صور التركيز، على النقيض يمكن أن تعزز بسهولة ببساطة عن طريق تطبيق منخفضة تمرير تصفية للحد من الضوضاء عالية التردد في الخلفية. نحن نعتقد، وشبه التركيز شيرتسر الصور تحمل أقصى إشارات الهيكلية، ويمكن أن تزيد من دقة محاذاة الجسيمات وتعزيز ايفيciency في واحد الجسيمات 3D إعادة الإعمار وإعادة الإعمار الجسيمات الفردية المقطعي الإلكترون.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
وصمة عار: Uranyl Formate	قسم إمدادات SPI التابع لشركة Structure Probe، Inc.	02545-AA	http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
حقنة: 1 مل NORM-JECT	VWR	89174-491	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
مرشح الحقنة: 0.2 & mu; m	VWR	28145-487	مرشح حقنة https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
: 0.02 & mu ؛ مرشح م (Anotop 10)	Whatman	6809-1002	http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات	SIGMA-Aldrich	D8537	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US
Parafilm: 4 بوصة × 125 قدما.	VWR	470152-246	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
شبكة TEM مطلية بفيلم الكربون: 300 شبكة	Pacific Grid-Tech	Cu-300CN	http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
شبكة TEM مطلية بفيلم الكربون: 200 شبكة	EMS (علوم الفحص المجهري)	CF200-Cu	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
الملقط: Dumont Tweezer L5	EMS (علوم المجهر الكهربائي)	72882-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 نظام تنقية المياه عالي	EMD Millipore	Milli-Q Advantage A10 http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
ورق الترشيح: دوائر الصف 1	Whatman	1001-090	http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
رقائق			أي نوع
نصائح تصفية الأطراف: نصائح تصفية الهباء الجوي منخفضة الاحتفاظ ل 10 & L Pipettors	VWR	89174-520	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[header]
وحدة تفريغ التوهج	تيد بيلا	91000	http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
نصائح الفلتر: نصائح مرشح الهباء الجوي منخفضة الاحتفاظ ل 40 & مايكرو ؛ L Pipettors	VWR	89174-524	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
نصائح التصفية: VWR Signature 200 & micro ؛ L Pipet Tips	VWR	37001-528	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet	Pipetman	F161201 و F167300	http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx