مقالة منهجية

التصوير بالموجات فوق الصوتية الموجهة داخل القلب حقن لتطوير نموذج الفأر من الثدي الانبثاث سرطان الدماغ تلاه الطولية التصوير بالرنين المغناطيسي

18.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51146

⸱

مارس 6, 2014

 , 
1Radiology, University of Texas Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يتم تأسيس سرطان الدماغ الانبثاث نموذج الفأر الثدي مع الموجات فوق الصوتية الموجهة التصوير داخل القلب حقن الخلايا MDA-MB231/Br-GFP. وقد تم رصد تطور الانبثاث داخل الجمجمة متعددة البؤر طوليا باستخدام عالية الدقة 9.4 T التصوير بالرنين المغناطيسي.

الملخص

ورم خبيث في الدماغ سرطان الثدي، والتي تحدث في 30٪ من مرضى سرطان الثدي في المرحلة الرابعة، ويرتبط مع ارتفاع معدل الوفيات. بقاء وسيطة 6 أشهر فقط. فمن الأهمية بمكان أن يكون نماذج حيوانية مناسبة لمحاكاة انتشار الدورة الدموية للخلايا المنتشر في السيناريو السريرية. هنا، الذي نعرضه استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية صغيرة الحيوانية لتوجيه حقنة دقيقة من الدماغ خلايا سرطان الثدي الاستوائية إلى البطين الأيسر من الفئران عارية athymic. يستخدم التصوير بالرنين المغناطيسي لتقييم طولية داخل الجمجمة وبدء نمو الانبثاث الدماغ. الحقن داخل القلب بالموجات فوق الصوتية الموجهة يضمن ليس فقط حقنة دقيقة وبموجب هذا أعلى معدل ناجحة ولكن أيضا انخفضت بشكل ملحوظ معدل الوفيات، بالمقارنة مع دينا الإجراء اليدوي السابق. في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي عالية الدقة يسمح التصور من hyperintense آفات متعددة البؤر، صغيرة مثل 310 ميكرون في قطر على تي 2 الصور المرجحة في 3 أسابيع حقن آخر. فولو فوتبال شيث متابعة التصوير بالرنين المغناطيسي يكشف عن نمو الورم داخل القحف وزيادة عدد الانبثاث التي توزع في جميع أنحاء الدماغ كله.

المقدمة

ورم خبيث في الدماغ داخل الجمجمة هو الورم الخبيث الأكثر شيوعا لدى البالغين. والتكهن سيئة للغاية، مع بقاء متوسط ​​4-6 أشهر حتى مع العلاج المكثف. سرطان الثدي هو واحد من أكثر أنواع السرطان الأولية الرئيسية الثلاثة مع مراضة عالية من ورم خبيث في الدماغ 1-3. عدة أسطر سرطان الثدي الدماغ مدار قادرون على تطوير الانبثاث الدماغ بعد الحقن داخل القلب أو intracarotid 4. الحقن المباشر للخلايا السرطانية في البطين الأيسر يمكن تجاوز السرير الشعرية الرئة وبالتالي زيادة الإصابة تشكيل الانبثاث الدماغ مع التقليل الانبثاث الحشوية. خط MDA-MB231Br هي واحدة من الأكثر استخداما على نطاق واسع خطوط سرطان الثدي البشرية لتطوير ورم خبيث في الدماغ في نماذج القوارض 5،6.

مثل العديد من الدراسات الأخرى 4،7، وقد أجرينا إجراء الحقن داخل القلب دليل في دراساتنا السابقة. ومع ذلك، تم الحصول على معدل نجاح 50٪ فقط مع دليلتوفي وحقن جزء صغير من الفئران من الإجراءات الغازية تتكرر إذا فشلت التجارب السابقة. هنا، الذي نعرضه استخدام إجراء موجهة التصوير لتأمين حقن خلايا سرطان الثدي التي تسعى الدماغ إلى البطين الأيسر من الفئران athymic. يتم تطبيق طولية عالية الدقة التصوير بالرنين المغناطيسي لمتابعة التنمية داخل القحف الانبثاث الدماغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوان من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة تكساس جنوب غرب المركز الطبي.

1. إعداد خلايا MDA-MB231/Br-GFP

  1. استرداد والثقافة الخلايا MDA-MB231/Br-GFP (شريطة تفضلت الدكاترة. بالمييري وSteeg، NCI) في DMEM المتوسط ​​تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ و 1٪ الجلوتامين البنسلين / الستربتوميسين.
  2. مراقبة حالة الخلايا ولون متوسطة، واستبدال المتوسطة كل 2-3 أيام.
  3. يعرض للتريبسين وجمع الخلايا عندما يتم التوصل إلى 80٪ التقاء على النحو المبين في الخطوات 1.3.1-1.3.5:
    1. إزالة المتوسطة القديمة تماما، وإضافة 5 مل PBS (1X) لغسل الخلايا بلطف. إزالة برنامج تلفزيوني من الطبق.
    2. إضافة 1.5 مل التربسين في صحن؛ إمالة طبق بلطف لضمان تغطية جميع الخلايا بواسطة التربسين. وضع الطبق مرة أخرى إلى الخلية الحاضنة وابقائه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. ياخذ الطبق من الحاضنة ومراقبةالخلايا تحت المجهر الضوئي لضمان فصل الخلايا من الطبق.
    4. إضافة 3 مل المتوسطة لوقف تأثير التربسين. جمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
    5. إزالة بعناية والمتوسطة resuspend الخلايا في 5 مل مصل المتوسطة مجانا حتى متجانسة.
  4. عد عدد مناسب من الخلايا و resuspend لهم في مصل المتوسطة DMEM الحرة مع تركيز النهائي من 1.75 × 10 5 خلايا في حجم 100 ميكرولتر.
    1. تأخذ 50 ميكرولتر خليط الخلايا وإضافة 50 ميكرولتر التريبان الأزرق. بعد الاختلاط، ويستغرق 10 ميكرولتر خليط وبعناية إضافة إلى الشريحة العد الخلية. استخدام عينات متعددة لضمان دقة تقدير عدد الخلايا.
    2. عصا في الشريحة العد الخلية، نهاية واحدة في وقت والعداد الخلية يبدأ العد تلقائيا. تأخذ متوسط ​​جميع نتائج العد وحساب عدد الخلايا الإجمالي.
    3. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى و resuspend لهم فيحجم المناسبة من المصل المتوسطة حرة أن يؤدي إلى تركيز النهائي من 1.75 × 10 5 cells/100 ميكرولتر حجم.
  5. الخلايا مكان على الجليد قبل الحقن داخل القلب.

2. التصوير بالموجات فوق الصوتية الموجهة داخل القلب حقن

  1. استخدام الفئران عارية الإناث (BALB / ج نو / نو) بين 6-8 أسابيع من العمر.
  2. تسجيل في نظام التصوير. تهيئة محول 704 (40 ميغاهيرتز).
  3. بدء دراسة جديدة وملء المعلومات.
  4. تخدير (3٪ isoflurane/100٪ O 2 في غرفة الاستقراء) والمحافظة على الحيوانات مع isoflurane و(2٪) في 100٪ O 2 (1 دسم 3 / دقيقة) خلال الإجراء بأكمله عبر مخروط الأنف. تأكيد التخدير عندما يتم احترام أي منعكس الانسحاب مع قرصة أخمص قدميه.
  5. ضبط درجة الحرارة من الجدول التصوير إلى 37 درجة مئوية. الشريط الماوس تخدير إلى طاولة التصوير ساخنة في موقف ضعيف.
  6. الحفاظ على هلام الموجات فوق الصوتية عند 37 درجة مئوية قبل ايمالشيخوخة. تطبيق الجل على الصدر من الفأرة.
  7. تركيب محول في حامل. خفض محول حتى يتم الوصول إلى عمق التصوير المطلوب. نقل المرحلة حتى يتم التعرف على البطين الأيسر مع الشريان الأبهر الصاعد باعتبارها معلما (الشكل 1A). قفل المرحلة التي تصور رؤية واضحة من البطين الأيسر.
  8. رسم 100 ميكرولتر من خليط الخلية إلى حقنة 1 مل مع إبرة G 22. وضع وإصلاح حقنة حقنة على جبل.
  9. نقل حقنة قدما نحو الصدر الماوس وتحريكه بعناية جنبا إلى جنب حتى غيض الإبرة في مجال التصوير نظر (قبل دخول الماوس).
  10. ضبط ارتفاع إبرة وزاوية لهدف أسفل البطين الأيسر.
  11. اختراق إبرة حقنة في الفضاء إينتيركواستال على وجه السرعة من خلال طبقات الجلد والعضلات في البطين الأيسر بتوجيه من التصوير بالموجات فوق الصوتية.
    مؤشرا الإدراج الناجح لإبرة في ventri اليساركلي هو ارتجاع الدم الشرياني الطازجة (لونه وردي وعلى النقيض من الظلام الدم الوريدي الحمراء) في حقنة
  12. حقن خليط الخلية ببطء (الشكل 1B).
  13. عند الانتهاء، سحب الإبرة، وترفع من محول، وتنظيف هلام الموجات فوق الصوتية مع شاش مبللة وإزالة الشريط.
  14. إعداد قفص نظيفة مع وسادة مسخن.
  15. وضع الحيوان على وسادة ومراقبة الحيوان حتى الشفاء التام.
  16. مراقبة سلوك الحيوان كل 24 ساعة لمدة يومين.
  17. ويتم رصد الشروط العامة وعلامات عصبية من مضاعفات في فئران التجارب بشكل روتيني.

3. رصد التصوير بالرنين المغناطيسي التنمية ورم داخل القحف

  1. استخدام 9.4 تسلا المغناطيس لرصد التنمية داخل القحف الانبثاث الدماغ.
  2. بدء التصوير بالرنين المغناطيسي بعد أسبوعين الورم زرع وكرر مرة واحدة في الأسبوع لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع.
  3. رزين الحيوانات مع 3٪ isoflurane والمحافظة عليها وتحت الجينالتخدير راؤول (1.5٪ isoflurane و).
  4. رصد والحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان والتنفس المستمر في كافة مراحل التجربة.
  5. قرار ملتسلس عالية (14 شرائح مع 1 مم، وجود فجوة) T 1 - وT 2 المرجحة الصور الاكليلية، الذي يغطي المنطقة من الفص الجبهي إلى الحفرة الخلفية، يتم الحصول مع المعلمات التالية: T-1 المرجحة الصور: تدور صدى شريحة متعددة (SEMS)، TR / TE = 400 ميللي ثانية msec/20، مصفوفة: 256 × 256، فوف 20 × 20 مم، في تحليل المستوى: 78 × 78 ميكرون 2. T 2 الصور المرجحة: تدور بسرعة صدى شريحة متعددة (FSEMS) متواليات، TR / TE = 2500 ميللي ثانية msec/48، 8 قطارات صدى، مصفوفة: 256 × 256، فوف 20 × 20 مم، في تحليل المستوى: 78 × 78 ميكرون 28،9.
    تظهر الآفات السرطانية أكثر إشراقا من أنسجة المخ العادي على تي 2 الصور المرجحة.
  6. يتم تحديد حجم الورم على T-2 الصور الوزني بنسبة تحدد enhan يدوياالوراثة جزء من كتلة على كل صورة باستخدام برامج MATLAB كتبه لنا 8.
    نظرا معظم الورم أقطار أصغر من سماكة شريحة (1 مم)، يتم تقديم حجم الورم كما هو الحال في منطقة الطائرة بدلا من وحدة التخزين.

4. H & E تلطيخ تأكيد الانبثاث

  1. التضحية الفئران مباشرة بعد مسح MR الماضي، تشريح أدمغة الحاملة للورم وتضمين ذلك في أكتوبر المتوسطة والمجمدة في -80 درجة مئوية.
  2. القسم سلسلة من 10 الدماغ الاكليلية ميكرون سميكة العينات مع ناظم البرد.
  3. أداء H & E تلطيخ على أقسام الدماغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مع قرار مكانية عالية من التصوير بالرنين المغناطيسي (78 ميكرومتر في القرار الطائرة)، ويمكن تحديد الآفات hyperintense صغيرة مثل 310 ميكرون في القطر (الشكل 2). منذ الانبثاث في هذه الدراسة صغيرة جدا وتطوير نخر وذمة هو الحد الأدنى، الآفة hyperintense على تي 2 الصور المرجحة ممثلة حقا كتلة الورم.

دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي تسمح طولية في تقييم موسع المجراة من نمو الورم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، لقد أثبتنا أن الموجات فوق الصوتية الموجهة التصوير حقن البطين الأيسر يضمن دقة بحيث لوحظ كل حيوان في هذه الدراسة وضعت الانبثاث الدماغ وليس الموت الحيوان. جمال حقن موجهة الصورة هو أن مسار اختراق الإبرة من الجلد وأخيرا في البطين الأيسر يمكن رصدها وتعديلها تحت الصورة، والذي يختلف من الإجراء اليدوي تتطلب المعالم التشريحية صارمة لمتابعة.

وتستند التفاهمات الحالية للتنمية داخل القحف الانبثاث الدماغ إلى حد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لالدكاترة. ديان بالمييري وباتريشيا Steeg من لجنة التحقيق الوطنية لتزويدنا الخلايا MDA-MB231Br. نشكر الدكتور رالف ماسون، السيد جيسون Reneau والسيدة رامونا لوبيز لتقديم الدعم التقني والزمالة. وأيد هذا العمل في جزء من وزارة الدفاع جوائز IDEA W81XWH-08-1-0583 وW81XWH-12-1-0317. أجريت تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي في مركز متقدم التصوير بحوث، منشأة NIH BTRP # P41-RR02584، وأجريت الموجهة بالأمواج فوق الصوتية حقن داخل القلب مع VisualSonics VEVO 770 تحت 1S10RR02564801.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMHyCloneSH30022.01 
TrypsinMediatech25-051-C1 
عداد الخلايا الأوتوماتيكيBioRadTC10& nbsp ؛
شركة إيزوفلورانباكستر الدولية1001936060 
التصوير عالي الدقة VisualSonics Vevo 770  شركة Visual Sonics Inc. 
مغناطيس التجويف الأفقي 9.4 T مع نظام Varian INOVA Unity   ؛Agilent 
O.C.T COMPOUNDساكورا فينيتك الولايات المتحدة الأمريكية4583 
نظام

المراجع

  1. Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
  2. Lin, N. U., et al. CNS metastases in breast cancer. J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).
  3. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
  4. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
  5. Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
  6. Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
  7. Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
  8. Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
  9. Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
  10. Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
  11. Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
  12. Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة