خلايا DNabT نادرة بين خلايا T الطرفية؛ ومع ذلك، فهي وفيرة في بعض الأنسجة اللمفاوية غير. صعوبة عزل خلايا T DN من الأنسجة اللمفاوية غير يعيق تحليلاتهم الفنية على الرغم من تزايد الاعتراف بأهمية الفسيولوجية المرضية. نحن تصف الرواية بروتوكول لعزل خلايا T DN العالية النقاء من الكلى الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
لا يوجد حاليا أي بروتوكول قياسي لعزل خلايا T DN من الأنسجة اللمفاوية غير على الرغم من مشاركتهم ذكرت على نحو متزايد في مختلف الاستجابات المناعية. خلايا T DN هي نوع من الخلايا المناعية الفريدة التي تورطت في تنظيم الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية والتسامح لallotransplants 1-6. خلايا T DN، ولكن، نادر في الدم المحيطي والأجهزة اللمفاوية الثانوية (الطحال والغدد الليمفاوية)، ولكن هم من سكان كبرى في الكلى طبيعية. القليل جدا هو المعروف عن وظيفتها الفسيولوجية المرضية 7 بسبب ندرة في الهامش. وصفنا مؤخرا تحليلا المظهري وظيفية شاملة لهذه الفئة من السكان في الكلى 8 في حالة مستقرة وخلال نقص التروية إصابة ضخه. تحليل DN T وظيفة الخلية سوف تتعزز بشكل كبير عن طريق وضع بروتوكول لعزلتهم من الكلى.
هنا، نحن تصف بروتوكول الرواية التي يسمح isolatioن من أساسها CD4 + CD8 + T خلايا نقي للغاية وخلايا T DN من الكلى الفئران. لفترة وجيزة، ونحن هضم أنسجة الكلى باستخدام كولاجيناز وعزل الخلايا وحيدات النوى الكلى (KMNC) من خلال الكثافة التدرج. ويتبع هذا من قبل اثنين من الخطوات لإثراء خلايا T المكونة للدم من 3٪ إلى 70٪ من KMNC. تتكون الخطوة الأولى من مجموعة مختارة إيجابية من الخلايا المكونة للدم باستخدام CD45 + عدة عزلة. في الخطوة الثانية، يتم عزل الخلايا T DN سلبا عن طريق إزالة الخلايا غير المرغوب باستخدام CD4، CD8، وMHC الدرجة الثانية الاجسام المضادة وCD1d α-galcer tetramer. هذه الاستراتيجية يؤدي إلى عدد سكانها أكثر من 90٪ نقية خلايا T DN. يستخدم تلطيخ السطح مع الأضداد المذكورة أعلاه يليها تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتأكيد نقاء.
المقدمة
الطرفية αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - المزدوج السلبية وتنقسم الخلايا (DN) T إلى مجموعات فرعية مختلفة الظواهر التي تمتلك وظائف متميزة 1-4. فهم خلايا T DN سيئة ولكن على نحو متزايد بالتورط في الاستجابات المناعية المرضية في جسم المريض في نماذج الأمراض المختلفة 4-6.
خلايا T DN هي نوع من الخلايا المناعية الفريد الذي تورط على نحو متزايد في تنظيم مختلف الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية والتشكيل التسامح allotransplant. 4-6، 9 فهي نادرة في الدم المحيطي والأجهزة اللمفاوية الثانوية (الطحال والغدد الليمفاوية ). ومع ذلك، فهي سكان كبرى من الكلى والأمعاء الطبيعي الظهارة 10-12. القليل جدا هو المعروف عن وظيفتها 7 في الكلى في حالة مستقرة وتحت الظروف المرضية مثل إصابة الكلى الحاد (آكي) المرتبطة transpl الكلىالنمل.
بسبب أدوار معقدة من الخلايا المناعية المختلفة في تنظيم الاستجابات المناعية بما في ذلك alloresponses، وتحديد دور كل لاعب هو حاسم في فهم alloresponses وتصميم علاجات جديدة. نظرا لأعداد كبيرة من الخلايا T DN الحاضر في ظل ظروف مرض الكلى والفسيولوجية المختلفة، من المرجح أن تلعب دورا حاسما في تنظيم الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية في الفئران والبشر، وalloresponses في متلقي زرع خلايا T DN. على الرغم من تراكم الأدلة لا تزال متناثرة تورط خلايا T DN في كل المهام المسببة للأمراض والمثبطة للمناعة ولكن من المفهوم لماذا وكيف يعرضون وظيفة الضارة أو قمعية محددة وكيف يؤثر على البيئة لهم انها سيئة.
بسبب وفرة منخفضة في الكلى، وطرق تحسين العزلة ضرورية.
لا يوجد حاليا أي بروتوكول قياسي لعزل خلايا T من DN رانه الأنسجة اللمفاوية غير. يصف بروتوكول لدينا طريقة جديدة لعزل خلايا T DN من الكلى؛ ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لمختلف الأنسجة اللمفاوية غير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد أدوات والثقافة وسائل الإعلام والكواشف
- الأدوات: إعداد الكواشف تحت ظروف معقمة واستخدام تحت غطاء تدفق الصفحي.
- تحضير 1 لتر من RPMI زراعة الأنسجة المتوسطة، إضافة 5٪ من مصل بقري جنيني، 2.1 غرام من بيكربونات، 10 مل الغلوتامات 100X، 10 ملغ من HEPES، 1 ملغ البيروفات الصوديوم و 10 مل من 100X البنسلين / الستربتوميسين.
ملاحظة: الموصى بها الأنسجة مستنبت، RPMI، يرادف DMEM. - إعداد 5٪ كولاجيناز "D" الحل (5 مل من كولاجيناز "D" إلى 9 مل من زراعة الأنسجة متوسطة).
- جعل الحل Percoll في ثلاثة تركيزات مختلفة: 100٪، 80٪ و 40٪. يتم حساب التركيزات التالية: 1 العينة. الحفاظ على حلول في درجة حرارة الغرفة.
- الحل Percoll: إضافة 9 مل من مخفف Percoll (من محلول المخزون)؛ إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 10X.
- الحل Percoll: إضافة 8 مل من Percoll 100٪؛ إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
- الحل Percoll:إضافة 4 مل من Percoll 80٪؛ إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
- جعل 1 L من الخلايا مضان تنشيط الفرز (FACS) العازلة؛ إضافة 5 مل 10٪ BSA (0.1٪ BSA)، 1 مل 10٪ أزيد الصوديوم (0.1٪)، 2 مل EDTA وكيل، وجعل ما يصل إلى 1،000 مل مع برنامج تلفزيوني 1X.
2. إعداد الكلى الهضم
- بعد أن حصلت أي موافقة المؤسسية اللازمة، تضحية ويستنزف الفئران مع الأساليب القياسية واللوائح الحالية في أعقاب المبادئ التوجيهية ورعاية الحيوان.
- تخدير الفأر مع بنتوباربيتال (0.07 ملغ / كلغ).
- انتقل إلى استنزاف.
- ضع الماوس في موقف ضعيف على طاولة الجراحة.
- رش منطقة البطن مع الايثانول 70٪.
- إضافة 10 مل من كولاجيناز D الحل على طبق بيتري.
- إزالة وdecapsulate كلا الكليتين من كل فأر.
- فتح تجويف abdomimal من خلال جعل شق خط الوسط من خلال الجلد في البطن والصفاق من القص لالعانة.
- فضح الكلية اليسرى عن طريق تحريك الأمعاء أفقيا إلى الجانب.
- فصل بعناية الكبسولة غادر مع ملقط.
ملاحظة: يظهر كبسولة باعتبارها طبقة شفافة المحيطة الكلى ومغطاة جزئيا الأنسجة الدهنية حول الكلية. - إزالة الكلية اليسرى عن طريق خفض السفن عنيق باستخدام مقص جراحي.
- كرر نفس الإجراء في الكلى اليمنى.
ملاحظة: الكلية اليمنى أكثر الجمجمة وأقرب إلى خط الوسط (pedicels هي أقصر).
- وضع الكلى في طبق بتري.
- قطع نسيج الكلى الى قطع صغيرة (1-2 ملم في البعد) باستخدام شفرة لتشكيل المعادن العادية ووضع القطع في حل كولاجيناز لمدة 30-45 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (الشكل 1).
3. إعداد خلايا الكلى وحيدات النوى (KMNC) من الهضم الكلى
- الحصول على تعليق خلية في الكلىالهضم عن طريق تعطيل ميكانيكيا الأنسجة باستخدام مصفاة (70 ميكرون) و resuspend في 25 مل من زراعة الأنسجة المتوسطة والمزيج.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير تعليق الخلية.
- إعادة تعليق بيليه في 4 مل من 40٪ Percoll حل وبلطف تراكب على 4 مل من 80٪ Percoll حل مع ماصة نقل البلاستيك، ببطء شديد وبعناية. وهذا يؤدي إلى مرحلتين يفصل بوضوح من خلال طبقة شفافة. على الجزء العلوي سوف يكون طبقة صفراء المقابلة لنسبة الدهون.
- أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد المركزي في الفرامل تشغيل الوضع.
- إزالة بواسطة طموح الطبقة العليا الأصفر وسميكة (حوالي 1-2 مل).
- جمع فقط طبقة شفافة بيضاء طفيف من واجهة من مرحلتين مع ماصة نقل. نقل بعناية جدا هذا التعليق في أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على 2 مل من زراعة الأنسجة المتوسطة ثم قم بإضافة 13 مل من المتوسط لجعل الحجم الكلي لل15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- resuspend والعينات في 1 مل من المتوسط.
- حساب عدد KMNC باستخدام الاستبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات والتعبير عن النتائج على النحو أعداد KMNC لكل مل في الكلى.
- يغسل مرة واحدة على النحو الوارد أعلاه.
4. عزل المكونة للدم (CD45 +) الخلايا من KMNC (الخطوة الأولى)
- resuspend الخلايا تصل إلى 10 7 في 90 ميكرولتر من العازلة على التوالي.
- إضافة 10 ميكرولتر من بلي CD45 واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إضافة 1 مل من المخزن المؤقت تشغيل لوقف رد الفعل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية وresuspend في 500 ميكرولتر من العازلة على التوالي.
- إعداد العمود المغناطيسي عن طريق وضع في المغناطيس وشطف مع 3 مل من العازلة على التوالي.
- تمرير تعليق الخلية من خلال العمود المغناطيسي وجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع 3 مل من runnالعازلة جي. ثم جمع النفايات السائلة.
- إزالة عمود من الفاصل وماصة 5 مل من العازلة على التوالي على الأعمدة وطرد جزء المسمى فورا. هذا جزء يحتوي على CD45 + الخلايا. عد الخلايا.
- لحساب العدد المطلق للخلايا T مجموعات فرعية مختلفة في الكلى مضاعفة العدد الإجمالي للKMNC من النسبة المئوية للخلايا إيجابية يحددها التدفق الخلوي (الشكل 2).
5. عزل DN T خلية CD45 + من إعداد حسب التحديد السلبية (الخطوة الثانية)
- إضافة 2.5 ميكرولتر (0.5 ملغ / مل، 1.25 ميكروغرام) من كل من الأجسام المضادة البيروكسيديز التالية: مكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة التيسير مستقبلات (CD16/32)، ومكافحة MHC من الدرجة الثانية (IA ب)، ومكافحة CD1d PBS-57 tetramer لكل 10 خلايا المكونة للدم 7.
- احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في غرفة باردة.
- إضافة 1 مل بلي مكافحة البيوتين.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في غرفة باردة.
- وضع أنبوب في رانه مغناطيس، والشروع في استنزاف.
- عد خلايا قابلة للحياة لتحديد العدد الكلي للخلايا T DN في جزء السلبية باستخدام عدادة الكريات.
- تحقق النقاء من الخلايا T DN مع التدفق الخلوي عن طريق اتباع هذه الاستراتيجية النابضة: أول بوابة CD45 +، البوابة الثانية TCRαβ +. استبعاد CD1d + الخلايا. مؤامرة CD4 + CD8 + مقابل لتحديد الخلايا DN T (الشكل 3).
- مضاعفة العدد الإجمالي بالنسبة المئوية المحددة في النقاء.
ملاحظة: استخدام هذه النتائج في بروتوكول يبلغ عدد سكانها أكثر من 90٪ نقية خلايا T DN.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
النوع البري C57BL / 6 (B6) الكلى يحتوي على حوالي 1،5-2،1 × 10 6 خلايا وحيدات النوى في الكلى. حوالي أقل من 10٪ هي المكونة للدم CD45 + الخلايا. لإعداد الخلايا وحيدات النوى الكلى (KMNC)، يتم قطع الكلى الى قطع صغيرة كما هو مبين في الشكل 1 متبوعا الهضم باستخدام 5٪ كولاجيناز.
ويعقب ذلك إجراء التدرج الكثافة الطرد المركزي لجمع KMNC طبقة (الشكل 2، اللوحة اليسرى). KMN...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وهناك اهتمام متزايد في خلايا T DN لأنها تورطه في ظروف مرضية مختلفة مثل اضطرابات المناعة الذاتية والسرطان والكسب غير المشروع والتسامح، وأمراض الكلى الأولية بما في ذلك إصابة الكلى الحاد (آكي)، التهاب كبيبات الكلى 8، 13. وبالتالي، هناك حاجة إلى فهم أفضل وتوصيف الوظائف الفسيولوجية المرضية للخلايا T DN. ولكن، حاليا هناك نقص في فهم وظيفة هذه الخلايا بالمقارنة مع CD4 والخلايا التائية CD8. وهناك سبب رئيسي هو قلة خلايا T DN في الأجهزة اللمفاوية الثانوية وصعوبة في الحصول على خلاي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في برنامج تلفزيوني (R21 AI095484). نشكر NHI مرفق الأساسية tetramer لCD1d tetramer.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| غطاء التدفق الصفيحي | شركة بيكر أو | ما يعادلها من المعدات | |
| جهاز طرد مركزي | Beckman Coulter | أو ما يعادلها من المعدات | |
| علوم المجهر | الإلكتروني لمقياس الدم | 63514-11 | |
| حاضنة التحكم في الغلاف الجوي | فيشر العلمية | ( 37 درجة ؛ C مع 5٪ CO2< / sub>) مقياس | |
| التدفق الخلوي | التحليلي LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| مصل الأبقار الجنينية | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1٪ أزيد الصوديوم (NaN3< / sub>) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات العازلة (PBS) Corning | Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | أعمدة Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45 + microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| ميكروبيدات البيوتين | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| مضاد ل CD45 (استنساخ: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (استنساخ: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| مضاد ل TCR Pacific Blue (سلسلة ab ، استنساخ: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated ؛ (استنساخ 53-6.7) | BD | 553029 | |
| مضاد لمعقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية (I-A b) | BD | 553609 | |
| AutoMACS - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL / 6J الفئران | جاكسون لابس | 000664 | الكلى - الغدد الليمفاوية |
| طبق بتري | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 &# 956; مرشح M | فيشر 22363548 | ||
| Plunger | أو ما يعادلها من المعدات | ||
| GeneMate 50 مل | Bioexpress | C-3394-3 | أو ما يعادلها من المعدات |
| GeneMate 15 مل | Bioexpress | C-3394-1 | أو ما يعادلها من المعدات |
| CD1d α-galcer tetramer | NHI |
المراجع
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
