حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي حبيبات الحمض النووي الريبي حشوية تحتوي على جزيئات بروتين نووي ريبوزي المتعثرة (RNPs)، والمهم في الاستجابة الخلوية لمختلف الضغوط. يمكن اتباعها ديناميات SGS في الخلايا الحية من خلال وضع تصور توطين عنصر الموسومة اس جي اس في الخلايا الأولية transfected بعد الإجهاد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
SGS يمكن تصور في الخلايا المناعية التي كتبها مكونات بروتين معين أو بوليا + mRNAs و. SGS هي ديناميكية للغاية ودراسة جمعيتهم ومصير المهم أن نفهم الاستجابة الخلوية للإجهاد. نقص في العوامل الرئيسية لمثل SGS G3BP (RasGAP SH3 مجال بروتين ملزمة) يؤدي إلى عيوب التنموية في الفئران والتعديلات في النظام العصبي المركزي. لدراسة ديناميات SGS في الخلايا من كائن حي، يمكن للمرء الخلايا الأولية الثقافة واتبع توطين عنصر الموسومة transfected من SGS. نحن تصف التجربة الوقت الفاصل بين لمراقبة SGS التي تحتوي على G3BP1 في الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة SGS التي تحتوي على الخلايا العصبية في G3BP الحية، وهو أمر حاسم كما تبين مؤخرا أن هذه SGS تتشكل في ظهور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر. يمكن تكييفها هذا النهج تجاه أي من مكونات أخرى من الجسم الخلوية والبروتينات الحبيبية، وأجرىمع الحيوانات المعدلة وراثيا، والسماح للدراسة حية من حبيبات ديناميات على سبيل المثال في حالة عدم وجود عامل معين من هذه الحبيبات.
المقدمة
حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي بؤر حشوية غير الغشائي شكلت كرد الخلوية واقية للإجهاد البيئي، مثل درجة حرارة مرتفعة، الاكسدة، نقص الأكسجة، صدمة التناضحي، الأشعة فوق البنفسجية، والحرمان من الجلوكوز، أو عدوى فيروسية 1. أنها يمكن أن يتسبب كيميائيا عن طريق العلاج مع مركبات مثل الزرنيخ الصوديوم، والذي يطلق الاكسدة. اس جي اس تتراكم المتوقفة ترجمة القبض رسول بروتين نووي ريبوزي (mRNPs) مجمعات 2، عزل من mRNAs والآلات متعدية، ويمكن أن تسبب التجمع من قبل الفسفرة من eIF2α (بدء حقيقية النواة عامل 2 α). SGS هي هياكل دينامية تبادل المكونات مع polysomes وحبيبات أخرى مثل الهيئات-P. أنها تشكل "مركز الفرز" حيث يتم فرز mRNAs ومعا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الإجراءات الحيوان في هذا البروتوكول في الالتزام الصارم للمبادئ التوجيهية توجيهات المجلس الجماعة الأوروبية في 24 نوفمبر 1986 (86-609/EEC). بيت الفئران في المجموعة، مما يسمح للطعام والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. المحافظة عليها في بيئة تسيطر عليها (22 ± 1 درجة مئوية، 55 ± 5٪ الرطوبة) مع 12 ساعة: 12 ساعة ضوء: دورة الظلام (الضوء على الساعة 7:00 صباحا).
1 ثقافة خلايا الفئران الابتدائية: الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFs)
- الأوتوكلاف ملقط رقيقة، وكذلك مل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تشكيل الإجهاد الحبيبية مهم في استجابة الخلايا للإجهاد، والسماح التكيف الخلوية مع الترجمة المتعثرة، حتى طهر الإجهاد، ويرتبط لمنع موت الخلايا المبرمج. تصاريح هذا الاختبار لدراسة SGS في الخلايا الأولية، وذلك باتباع توطين المكونات الرئيسية البروتين اس جي اس (الشكل 1). G3BP، عاملا رئيسيا من SGS التجمع، هو الحاضر بدلا diffusively في سيتوبلازم الخلايا العصبية MEFs مثقف أو (الشكل 2A ألف وجيم)، وموجودة بشكل واضح في حبيبات منفصلة تحت العلاج الزرنيخ في MEFs .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الأكثر أهمية في قلق بروتوكول ترنسفكأيشن وأكثر من ذلك وخاصة عمليات الاستحواذ الفاصل الزمني، والتي يجب مراقبتها بعناية من أجل خفض أسفل السمسة.
ثقافة الخلايا الأولية ليس الجزء الصعب، طالما يتم الحفاظ على ظروف معقمة ويتم أخذ الحذر من أجل منع الضرر أثناء تشريح والتفكك الخلية الخطوات. MEFs يمكن أن تظل مجمدة في الممرات في وقت مبكر. وقد تبين عصبون ترنسفكأيشن مع فوسفات الكالسيوم للعمل بشكل جيد وهذا البروتوكول
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه مونبلييه ريو التصوير (MRI) منصة حيث أجريت عمليات الاستحواذ. أنها أشكر إيزابيل كريستينا لوبيز ميخيا، الكسندرا ميتز، إيرينا Lassot، صولانج Desagher، فابيان Loustalot، وفيرجيني جورجيت لمساعدتهم في أجزاء مختلفة من البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بحوث صب لا MEDICALE (FRM) (إيكيب FRM 2011-N ° DEQ20111223745).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM / F12 | Gibco | 21331 | Prewarm عند 37 درجة ؛ C |
| بيروفات الصوديوم | Gibco | 11360 | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| قاع زجاجي B-35 | Greiner | 627860 / 627861 | معالج أم لا (معالج: يزيد من ارتباط الخلايا الملتصقة) |
| بولي إل ليسين | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Prewarm عند 37 درجة ؛ C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Prewarm عند 37 درجة ؛ C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| ملقط | Biotek | DU-110-A | رفيع جدا ، نصائح 0.1 مم (مفيد لإزالة السحايا) |
| ملقط منحني | Biotek | P-110-BUF | رفيع جدا ، نصائح 0.1 مم |
| مقص صغير | Biotek | CM-85-BS | يمكن أن يكون مفيدا لإزالة تعداء حصين |
| Polyplus كاشف JetPEI ؛ | تعداء Ozyme | 101-10 | MEFs ، اتبع البروتوكول الأمامي |
| مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المقلوب | Leica | SP5 |
المراجع
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and trans....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
