مقالة منهجية

توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

16.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51216

⸱

يناير 31, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

في هذه المقالة

ملخص

نحن تصف تصميم التجارب النهج التي يمكن استخدامها لتحديد ونمذجة تأثير العناصر التحوير التنظيمية والنمو والتنمية المعلمات النبات، وشروط الحضانة على التعبير عابرة من الاجسام المضادة والبروتينات مراسل في النباتات.

الملخص

توفر النباتات فوائد متعددة لإنتاج المستحضرات الصيدلانية البيولوجية بما في ذلك تكاليف منخفضة، والتدرجية، والسلامة. يقدم التعبير عابرة ميزة إضافية للتنمية قصيرة والأوقات الإنتاج، ولكن يمكن لمستويات التعبير تتفاوت تفاوتا كبيرا بين دفعات بالتالي مما أدى إلى مخاوف تنظيمية في سياق الممارسات التصنيعية الجيدة. استخدمنا تصميم التجارب (وزارة الطاقة) نهج لتحديد تأثير العوامل الرئيسية مثل العناصر التنظيمية في بناء التعبير ونمو النبات والمعلمات التنمية، وشروط الحضانة خلال التعبير، على تنوع التعبير بين دفعات. اختبرنا النباتات تعبر عن مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية الأضداد وحيدة النسيلة نموذج (2G12) والبروتين علامة فلوري (DsRed). نناقش الأساس المنطقي لاختيار خصائص معينة من النموذج وتحديد حدودها المحتملة. يمكن بسهولة نقل النهج العام إلى مشاكل أخرى لأن مبادئ نموذج لإعادة على نطاق واسع للتطبيق: القائم على المعرفة اختيار المعلمة، والحد من التعقيد عن طريق تقسيم المشكلة إلى وحدات أصغر الأولية، وإعداد برامج موجهة لمجموعات التجربة الأمثل وتصميم خطوة حكيمة تكبير. وبالتالي، فإن منهجية مفيد لوصف البروتين التعبير في النباتات ولكن أيضا للتحقيق في الأنظمة المعقدة الأخرى التي تفتقر إلى وصف الآلية ليس فقط. المعادلات التنبؤية واصفا الترابط بين المعلمات يمكن استخدامها لإنشاء نماذج الآلي لأنظمة معقدة أخرى.

المقدمة

إنتاج البروتينات الصيدلانية البيولوجية في النباتات هو مفيد لأن النباتات هي غير مكلفة لتنمو، ومنصة يمكن زيادتها فقط من خلال زراعة المزيد من النباتات، والكائنات الممرضة للإنسان غير قادر على تكرار 1،2. استراتيجيات التعبير عابرة تستند على سبيل المثال على التسلل من الأوراق مع الأجرعية المورمة يوفر فوائد إضافية لأن يتم تقليل الوقت بين نقطة التسليم الحمض النووي وتسليم منتج تنقيته من سنة إلى أقل من 2 شهور 3. يستخدم التعبير عابرة أيضا لتحليل وظيفي، على سبيل المثال لاختبار الجينات لقدرتها على استكمال الخسارة من وظيفة المسوخ أو للتحقيق تفاعلات البروتين 4-6. ومع ذلك، ومستويات التعبير عابرة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التخطيط لاستراتيجية وزارة الطاقة

  1. تحديد العوامل والاستجابات ذات الصلة لإدراجها في التصميم.
    1. تحديد واحد أو عدة استجابات للقياس. هنا، استخدمت 2G12 وDsRed مستويات التعبير (ميكروغرام / مل)، بما في ذلك الحد الأدنى للكشف الفرق تعتبر (10 و 20 ميكروغرام / لتر، على التوالي) ذات الصلة والقيمة التقريبية للانحراف المعياري المقدر للنظام (4 و 8 ميكروغرام / مل، على التوالي) على أساس التجارب السابقة.
    2. استخدام الأدب ال....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نموذج وصفي لتراكم DsRed خلال التعبير عابرة استخدام منشطات و5'UTRs مختلفة

وقد استخدم مضان DsRed في مقتطفات ورقة تشير إلى مستوى التعبير من البروتين المؤتلف وبالتالي تم استخدامه باعتباره استجابة في استراتيجية وزارة الطاقة. كان الفرق كشفها الحد الأدنى رأيناها ذات الصلة 20 ميكروغرام / مل وكان الانحراف المعياري المقدر للنظام 8 ميكروغرام / مل على أساس التجارب الأولية. وقد تم اختيار العوامل المدرجة ف.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كل تجربة يتطلب تخطيطا دقيقا لأن الموارد غالبا ما تكون نادرة وباهظة الثمن. هذا صحيح بصفة خاصة للاستراتيجيات وزارة الطاقة هذا بسبب أخطاء أثناء مرحلة التخطيط (على سبيل المثال اختيار نموذج القاعدة التي لا تغطي جميع التفاعلات عامل هام) يمكن أن يقلل بشكل كبير من القوة التنبؤية للنماذج الناتجة عنها، وبالتالي تقلل من قيمة التجربة برمتها. ومع ذلك، هذه الأخطاء يمكن تجنبها بسهولة من خلال اتباع الإجراءات الأساسية.

الاع.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وقد رعت رسوم النشر بصورة جزئية من قبل الشركات Statease، وشركة (الولايات المتحدة الأمريكية) وStatcon (ألمانيا)، والتي لم تشارك في المشاركة في إعداد المخطوط أو مسؤولة عن أي من محتوياته.

شكر وتقدير

المؤلفون ممتنون للدكتور توماس Rademacher عن توفير pPAM محطة ناقلات التعبير وإبراهيم أميدي للزراعة نباتات التبغ المستخدمة في هذه الدراسة. نود أن نشكر الدكتور ريتشارد م. Twyman لمساعدته في تحرير المخطوطة. كان في جزء منه تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأوروبي المتقدم غرانت "المستقبل-فارما"، اقتراح عدد 269110 وفراونهوفر Zukunftsstiftung (مؤسسة فراونهوفر المستقبل).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خبير التصميم (R) 8Stat-Ease، Inc.برنامجn.a.DoE
TryptoneCarl Roth GmbH8952.2مكون الوسائط
مستخلص الخميرةCarl Roth GmbH2363.2مكون الوسائط
كلوريد الصوديومCarl Roth GmbHP029.2مكون الوسائط
AmpicillinCarl Roth GmbHK029.2المضاد الحيوي
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2مكون الوسائط
الإشريكية القولونية< / i> K12 DH5aLife Technologies18263-012الكائنات الحية الدقيقة
pPAMGenBankAY027531ناقلات الاستنساخ / التعبير.  
NucleoSpin Plasmid MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250طقم عزل الحمض النووي البلازميد
NucleoSpin Gel و PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250طقم تنقية الحمض النووي البلازميد
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spectrophotometer
NcoINew England Biolabs Inc.R3193Lالتقييد endonuclease
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101Lالتقييد اندنوكلياز
AscIنيو إنجلاند Biolabs Inc.R0558Lالتقييدنوكلياز
الداخلي NEB 4New England Biolabs Inc.B7004Sالتقييد المخزن المؤقت للنوكلياز
الداخلي TRISCarl Roth GmbH4855.3مكون الوسائط
رباعي الصوديومكارل روث GmbH4403.3مكون الوسائط
EDTACarl Roth GmbH8040.2مكون الوسائط
AgaroseCarl Roth GmbH6352.4مكون الوسائط
Bromophenol أزرقCarl Roth GmbHA512.1مؤشر اللون
زيلين سيانولكارل روث GmbHA513.1مؤشر اللون
الجلسرينكارل روث GmbH7530.2مكون الوسائط
خلية صغيرة فرعية GT خليةBioRad170-4406غرفة الرحلان الكهربائي الهلام
Agrobacterium tumefaciens< / i> سلالة GV3101: pMP90RKDSMZ12365الكائنات الحية الدقيقة
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658Electroporator
مستخلص لحم البقرCarl Roth GmbHX975.2مكون الوسائط
PeptoneCarl Roth GmbH2365.2مكون الوسائط
السكروزCarl Roth GmbH4621.2مكون الوسائط
كبريتات المغنيسيومCarl Roth GmbH0261.3مكون
كاربينيسيلينكارل روث GmbH6344.2مضاد حيوي
كاناميسينكارل روث GmbHT832.3مضاد حيوي
ريفامبيسينكارل روث GmbH4163.2مضاد حيوي
FWD التمهيديEurofins MWG Operonn.A.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV التمهيديEurofins MWG OperonNACCA AAG CGA GTA CAC
AAC 2720 Thermal CyclerApplied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfold webserverجامعة فييناn.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072سماد
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cmGrodann.a.Rockwoolblock
Greenhousen.a.n.a.لزراعةالنباتات
PhytotronIlka Zelln.a.لزراعةالنباتات
Omnifix-F SoloB. Braun6064204حقنة
Murashige و Skoogأملاح DuchefaM 0222.0010مكون الوسائط
GlucoseCarl Roth GmbH6780.2مكون الوسائط
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GPhytohormon analogon
  مقياس الضوء الحيوي بالإضافة إلىEppendorf6132 000.008مقياس الضوء
Osram أبيض بارد 36 واطأوسرام4930440مصدر الضوء
فوسفات ثنائي الصوديومCarl Roth GmbH4984.3مكون الوسائط
جهاز طرد مركزي 5415DEppendorf5424 000.410جهاز طرد مركزي
Forma -86C ULT فريزرThermoFisher88400فريزر
قارئ الألواح الفلورية Synergy HTBioTekSIAFRT
جهاز Biacore T200GE HealthcareNASPR
بروتين ALife Technologies10-1006بروتين ربط الأجسام المضادة
HEPESCarl Roth GmbH9105.3مكون الوسائط
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3مكون الوسائط
2G12 الجسم المضادالمضاد المرجعيPolymunAB002
الوسائط الجسم

المراجع

  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة