مقالة منهجية

رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

DOI:

10.3791/51217

⸱

ديسمبر 17, 2013

 ,  , 
1Genetics and Biochemistry Branch of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content">توضح هذه المقالة استخدام وضع العلامات الراديوية لمطاردة النبض جنبا إلى جنب مع الربط الضوئي الخاص بالموقع لمراقبة التفاعلات بين البروتين ذي الأهمية والعوامل الأخرى في الإشريكية القولونية. على عكس طرق الربط الكيميائي التقليدية ، يولد هذا النهج "لقطات" عالية الدقة لمسار تجميع منظم في خلية حية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة طريقة لاكتشاف وتحليل التفاعلات الديناميكية بين البروتين ذي الأهمية والعوامل الأخرى في الجسم الحي. تعتمد طريقتنا على تقنية قمع العنبر التي تم تطويرها في الأصل بواسطة Peter Schultzوزملاؤه 1. يتم إدخال طفرة كهرمانية لأول مرة في كودون معين من الجين الذي يشفر البروتين محل الاهتمام. ثم يتم التعبير عن طفرة العنبر في بكتريا قولونية مع الجينات التي تشفر الحمض النووي الريبي المثبط للكهرمان وسينثيتاز أميني acyl-tRNA المشتق من Methanococcus jannaschii. باستخدام هذا النظام ، يتم دمج الأحماض الأمينية القابلة للتنشيط الضوئية التناظرية p-benzoylphenylalanine (Bpa) في الكودون الكهرماني. ثم يتم تشعيع الخلايا بالأشعة فوق البنفسجية لربط بقايا Bpa بالبروتينات الموجودة في حدود 3-8 Å. يتم إجراء الربط المتقاطع الضوئي بالاشتراك مع وضع العلامات على مطاردة النبض والترسيب المناعي للبروتين محل الاهتمام من أجل مراقبة التغيرات في تفاعلات البروتين والبروتين التي تحدث على مدى فترة زمنية من ثوان إلى دقائق. لقد قمنا بتحسين الإجراء لدراسة تجميع عامل الفوعة البكتيرية الذي يتكون من مجالين مستقلين ، مجال مدمج في الغشاء الخارجي ومجال يتم نقله إلى الفضاء خارج الخلية ، ولكن يمكن استخدام الطريقة لدراسة العديد من عمليات التجميع المختلفة والمسارات البيولوجية في كل من الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة. من حيث المبدأ ، يمكن تحديد العوامل المتفاعلة وحتى المخلفات المحددة للعوامل المتفاعلة التي ترتبط ببروتين ذي أهمية عن طريق قياس الطيف الكتلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما يكون من الضروري تحديد وتوصيف التفاعلات بين البروتين ذي الأهمية والمكونات الخلوية الأخرى لتحديد دوره في مسار بيولوجي ، أو لفهم تجميعه ، أو لتوضيح آلية عمله. تستخدم مجموعة متنوعة من الأساليب بشكل شائع لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين ، ولكن جميعها لها حدودها. إن أبسط طريقة غير متحيزة لتحديد البروتينات التي ترتبط بالبروتين ذي الأهمية هي التنقية (أو الترسيب المناعي) ولكن هذا النهج يتطلب أن يظل مركب البروتين سليما أثناء إجراء التنقية. يمكن تثبيت تفاعلات البروتين الضعيفة أو العابرة من خلال الربط الكيميائي المتقاطع ، ولكن هذه الطريقة تتطلب عادة استخدام المركبات التي تربط البروتينات من خلال الأمينات الأولية المنتشرة على نطاق واسع في تسلسل البروتين. يمكن إنشاء أنماط الربط المتقاطع المعقدة التي يصعب تفسيرها ، خاصة عندما تكون البروتينات ذات الأهمية مكونات مجمعات متعددة البروتينات. علاوة على ذلك ، نظرا لأن أذرع الفاصل للروابط المتقاطعة الكيميائية تتجاوز عموما 10 Å في الطول ، يمكن تشكيل الروابط التساهمية مع البروتينات الموجودة بالقرب من البروتين محل الاهتمام ولكنها لا تتفاعل معه مباشرة. غالبا ما تكون طرق مثل كروماتوغرافيا التقارب والشاشات ثنائية الهجين مفيدة أيضا لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، يتطلب النهج الأول إعادة إنتاج الظروف التي تعزز التفاعلات ذات الأهمية الفسيولوجية ولا يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات الضعيفة. يتطلب النهج الأخير إمكانية تكرار تفاعلات الربط في الكائن الحي المضيف والحفاظ عليها عند وضع بروتين محل اهتمام وشركائه المرتبطين في سياق بروتين الاندماج. تميل الطرق الهجينة أيضا إلى توليد نتائج إيجابيةكاذبة 2. بمجرد إنشاء تفاعل البروتين والبروتين ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى عمل كبير لرسم خريطة لموقع التفاعل. ربما يكون العيب الأكثر أهمية في الأساليب التقليدية هو أنها لا توفر أي معلومات حول التسلسل الزمني للتفاعلات بين الجزيئات أو حركية الارتباط.

تصف هذه الورقة طريقة بسيطة تتغلب على بعض قيود الأساليب الأخرى المستخدمة لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين. في البداية ، يتم إدخال طفرة كهرمانية واحدة في الجين الذي يشفر بروتينا ذا أهمية. ثم يتم التعبير عن طفرة العنبر مع الحمض النووي الريبي المثبط للكهرمان وسينثيتاز أميني acyl-tRNA المشتق من Methanococcus jannaschii التي تم تصميمها لدمج الأحماض الأمينية القابلة للتنشيط الضوئي التناظرية p-benzoylphenylalanine (Bpa) فقط في كودونات العنبر3. ثم يسهل تشعيع الخلايا ذات الأشعة فوق البنفسجية ذات الطول الموجي الطويل (الأشعة فوق البنفسجية) (~ 365 نانومتر) تكوين رابطة تساهمية بين Bpa والبروتينات الموجودة في حدود ~ 3-8 Å4,5. في بعض السياقات التجريبية ، يمكن أيضا تكوين روابط متقاطعة بين Bpa المنشط والمكونات غير البروتينية للخلايا مثل الدهون والأحماض النووية6. يجب أن تكون الجزيئات التي يتم إنهاؤها عند الكودون الكهرماني قابلة للتمييز بسهولة عن البروتين كامل الطول على SDS-PAGE ولا يمكن ربطها بالبروتينات الأخرى. من خلال إخضاع الخلايا لوضع العلامات الراديوية لمطاردة النبض قبل الربط المتقاطع ثم الترسيب المناعي أو تنقية منتجات الربط المتقاطع ، يمكن تحديد تسلسل ومدة تفاعلات البروتين والبروتين. تعد القدرة على توليد معلومات زمنية حول التفاعلات بين الجزيئات ذات قيمة خاصة لدراسة تطور البروتين ذي الأهمية من خلال أي مسار تجميع أو اتجار أو إشارات متعدد الخطوات وتحديد وسيطات المسار. مثل الربط الكيميائي المتقاطع ، يكتشف الارتباط المتقاطع الخاص بالموقع تفاعلات البروتين والبروتين التي تحدث في ظل الظروف الفسيولوجية ، ولكن إدخال رابط متقاطع في موضع واحد يسهل تحليل التفاعلات بين الأجزاء الفردية من البروتين وعوامل أخرى. هذه الميزة الفريدة للربط المتبادل الخاص بالموقع مفيدة بشكل خاص عندما يحتوي البروتين محل الاهتمام على شرائح أو مجالات متعددة لديها القدرة على التفاعل مع شركاء ربط متميزين. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الربط المتبادل الخاص بالموقع مع طرق مثل قياس الطيف الكتلي لرسم خريطة للمخلفات التي تتوسط تفاعلات البروتين والبروتين بدقة. على الرغم من أن هذه الطريقة محسنة للاستخدام في بكتريا قولونية ، فقد تم الإبلاغ عن دمج نظائر الأحماض الأمينية القابلة للتنشيط في البروتينات عن طريق قمع العنبر في المتفطرة والخميرة وخلايا الثدييات7-11. وبالتالي ، من حيث المبدأ ، يمكن استخدام طريقتنا في أنظمة أخرى.

< p class = "jove_content">لقد استخدمنا هذه الطريقة على نطاق واسع لتحديد التفاعلات بين الجزيئات التي تسهل التكوين الحيوي ل EspP ، وهو بكتريا قولونية O157: عامل الفوعة H7. EspP هو عضو في عائلة فائقة من البروتينات تعرف باسم "الناقلات الآلية" التي تحتوي على مجال كبير خارج الخلية N ("مجال الركاب") ومجال طرفي AC ("المجال b") يطوى في هيكل أسطواني ب برميل ويثبت البروتين في الغشاء الخارجي (OM) 12. كانت الآلية التي يتم من خلالها نقل مجال الركاب عبر OM لغزا طويل الأمد. مثل جميع بروتينات سطح الخلية البكتيرية ، يجب نقل EspP عبر الغشاء الداخلي ، ونقله عبر المحيط (الفراغ بين الأغشية الداخلية والخارجية) ، واستهدافه إلى OM في سلسلة من الأحداث المرتبة. بعد انتقاله عبر OM ، يتم أيضا فصل مجال الركاب EspP عن المجال b بواسطة انقسام محلل للبروتين ويتم إطلاقه من سطح الخلية. من خلال الجمع بين الربط المتبادل الخاص بالموقع ووضع العلامات الإشعاعية لمطاردة النبض ، أظهرنا أن كلا المجالين من البروتين يتفاعلان في البداية مع المرافق الجزيئي Skp في المحيط6. بعد ذلك ، تتفاعل الأجزاء المنفصلة من المجال b بطريقة مجسمة محددة مع مكونات غير متجانسة تسمى مركب بام ، والتي تحفز تكامل بروتينات برميل b في OM البكتيري بواسطة آلية غير معروفة. ولعل الأمر الأكثر إثارة للاهتمام هو أننا وجدنا أن مجال الركاب على اتصال بإحدى الوحدات الفرعية لمجمع بام (BamA) أثناء عبوره OM13. لقد مكنتنا نتائجنا من بناء نموذج مفصل لتجميع النقلالآلي 14 وتورط مجمع بام في نقل مجال الركاب عبر OM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. بناء البلازميد

  1. بعد استنساخ الجين الذي يشفر بروتينا ذا أهمية في ناقل تعبير مناسب ، أدخل طفرات العنبر في المواقع المرغوبة باستخدام مجموعة طفرات موجهة إلى الموقع.
    ملاحظة: يمكن أن تكون المعلومات الهيكلية وتنبؤات التعرض السطحي بمثابة أدلة مفيدة لتحديد مواقع الطفرات. نظرا لأن كفاءة قمع العنبر والربط المتبادل يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ، يجب إدخال طفرات العنبر في مواضع متعددة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن Bpa هو نظير للتيروزين والفينيل ألانين ، فحاول إدخال طفرات كهرمانية في المواضع التي تشفر عادة الأحماض الأمينية الكبيرة الكارهة للماء لتقليل اضطرابات بنية البروتين ووظيفته. أخيرا ، عند اختيار ناقل التعبير ، ضع في اعتبارك أن الإفراط في إنتاج بروتين ذي أهمية على مستوى عال جدا قد يحد من كفاءة دمج Bpa.
< p class = "jove_title" >2. إعداد الثقافة

  1. استخدم التثقيب الكهربائي لتحويل سلالة الإشريكية القولونية المناسبة مع البلازميد الذي يشفر نظام قمع العنبر (pDULE-p Bpa ؛ انظر المرجع4) وبلازميد متوافق يشفر البروتين محل الاهتمام بطفرة كهرمانية.
  2. خلايا صفيحة على LB أجار تحتوي على مضادات حيوية مناسبة (استخدم 5 ميكروغرام / مل التتراسيكلين لاختيار pDULE-p Bpa). احتضان الألواح O / N عند 37 درجة مئوية.
  3. في اليوم التالي ، ابدأ مزارع O / N من مستعمرات مفردة في 3-5 مل M9 متوسط14 يحتوي على 0.2٪ جلسرين ، وجميع الأحماض الأمينية L باستثناء الميثيونين والسيستين (40 ميكروغرام / مل) والمضادات الحيوية. احتضان عند 37 درجة مئوية.
  4. في اليوم التالي ، تزرع أجهزة الطرد المركزي O / N عند 2,500 × جم لمدة 5 دقائق في RT لخلايا الحبيبات. أعد تعليق الخلايا في وسط M9 طازج سعة 5 مل وكرر الطرد المركزي.
    ملاحظة: تعد خطوة الغسيل هذه أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على البلازميدات التي تشفر مقاومة الأمبيسلين لأن الكميات الصغيرة من اللاكتاماز الب الموجودة في الوسط من مزارع O / N تتحلل الأمبيسلين المضاف حديثا قبل حدوث نمو كبير للخلايا.
  5. أعد تعليق الخلايا في وسط جديد سعة 2 مل وقياس تركيز الخلية في مقياس الطيف الضوئي (OD550).
  6. أضف الخلايا إلى قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل تحتوي على 50 مل M9 وسط ومضادات حيوية عند OD550 = 0.03. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مهتز.
< p class = "jove_title" >3. دمج Bpa والتحضير للربط المتقاطع للصور

ملاحظة: البروتوكول الموضح أدناه مخصص لعينة دورة زمنية تحتوي على ثلاث نقاط زمنية (0 و 1 و 5 دقائق). اضبط الأحجام وفقا لذلك إذا كان هناك عدد مختلف من النقاط الزمنية المطلوبة. موضح لمخطط الإجراء في الشكل 1.

  1. أثناء نمو الثقافات ، قم بإعداد محلول جديد 1 متر (1,000 ضعف) من Bpa في 1 M هيدروكسيد الصوديوم (27 مجم Bpa في 100 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم). استخدم أنبوبا داكنا الجدران للحفاظ على المحلول في الظلام.
  2. عندما تصل المزارع إلى مرحلة لوغاريتم مبكرة إلى منتصفة (OD550 = 0.2) ، أضف 50 ميكرولتر 1 M Bpa إلى كل ثقافة. أضف Bpa قطرة واحدة في كل مرة أثناء تحريك القارورة لتجنب هطول الأمطار. بعد ذلك ، أضف أي محفزات مطلوبة لدفع التعبير عن متحور الكهرمان. استمر في احتضان المزارع عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية.
  3. خلال فترة الحث التي تبلغ 30 دقيقة ، قم بتسمية ستة أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل يمكن التخلص منها مع النقطة الزمنية (0 دقيقة ، 1 دقيقة ، 5 دقائق) وإما "+ UV" أو "- UV". ضع الأنابيب على الجليد.
  4. املأ دلوا ثلجا ثانيا بالثلج وضع صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار فوق الثلج.
  5. قم بإذابة نشاط محدد عالي (1,000 ملي Ci / ملليمول) 35S-methionine و 35S-cysteine (أو خليط مسبق الصنع من المركبين) لوضع العلامات على النبض وإعداد (أو إذابة) محلول L-cysteine غير المشع و L-methionine (100 ملي مولار لكل منهما) للمطاردة.
  6. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية قبل خمس دقائق من وضع العلامات الراديوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون المصباح قابلا للتعديل بحيث يمكن وضعه ~ 3-4 سم من العينات الموجودة في اللوحة متعددة الآبار.
  7. أضف الثلج (~ 2 مل) إلى كل أنبوب يسمى "- UV" وإلى اثنين من الآبار في لوحة متعددة الآبار.
    ملاحظة: يجب إضافة الثلج إلى بئر ثالث مباشرة قبل النقطة الزمنية البالغة 5 دقائق. من الضروري وضع الثلج مباشرة في الأنابيب والآبار لإيقاف التفاعلات داخل الخلايا على الفور في كل نقطة زمنية وبالتالي الحصول على "لقطات" دقيقة لمسار كيميائي حيوي معين.
  8. في نهاية فترة الحث البالغة 30 دقيقة ، انقل 25 مل من المزرعة إلى قارورة Erlenmeyer المعززة مسبقا سعة 125 مل يمكن التخلص منها. ضع القارورة في حمام مائي مهتز 37 درجة مئوية.
فئة

4. وضع العلامات على مطاردة النبض والأشعة فوق البنفسجية

ملاحظة: يحتوي بروتوكول وضع العلامات على مطاردة النبض والإشعاع بالأشعة فوق البنفسجية على الكثير من الخطوات التي يجب إجراؤها في الوقت المناسب والتي تتطلب تنظيما كبيرا وإعدادا مسبقا. يجب أن تكون جميع الكواشف والأنابيب سهلة الوصول إليها. فيما يلي بروتوكول لتجربة تحتوي على نقاط زمنية 0 و1 و5 دقائق.

  1. في الوقت 0:00 (دقيقة: ثانية) ، انقل 25 مل من المزرعة إلى قارورة سعة 125 مل.
  2. في الوقت 0:30 أضف 30 ميكروCi / مل من الأحماض الأمينية المشعة ؛ قم بالتدوير بسرعة للخلط. ضع القارورة في حمام الماء المهتز 37 درجة مئوية.
  3. في الوقت 1:00 ، أضف 250 ميكرولتر من محلول 100 ملي مولار ميثيونين-سيستين ؛ قم بالدوران بسرعة للخلط.
    1. قم على الفور بوضع 4 مل من المزرعة في أحد آبار الصفيحة متعددة الآبار المبردة التي تحتوي على الثلج. ماصة ثانية 4 مل في أنبوب سعة 15 مل المسمى "0 دقيقة - الأشعة فوق البنفسجية". أعد القارورة إلى الحمام المائي.
  4. في الوقت 2:00 ، ضع ماصة 4 مل من المزرعة في البئر الثاني من الصفيحة متعددة الآبار المبردة التي تحتوي على الثلج. ضع ماصة أخرى بمقدار 4 مل في أنبوب سعة 15 مل المسمى "1 دقيقة - الأشعة فوق البنفسجية". أعد القارورة إلى الحمام المائي.
  5. في الوقت 6:00 ماصة 4 مل من المزرعة في البئر الثالث من الصفيحة متعددة الآبار المبردة التي تحتوي على الثلج. ماصة أخرى 4 مل في أنبوب سعة 15 مل المسمى "5 دقائق - الأشعة فوق البنفسجية".
  6. ضع دلو الثلج مع اللوحة متعددة الآبار أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المسخن مسبقا وقم بإشعاع كل عينة على حدة لمدة 4 دقائق < / > ملاحظة: في التجارب التي تكون فيها النقاط الزمنية متباعدة بمقدار 4 دقائق على الأقل ، يجب تشعيع كل عينة بمجرد وضعها في لوحة متعددة الآبار.
  7. انقل الخلايا إلى أنابيب مبردة سعة 15 مل تحمل علامة "0 دقيقة + UV" ، 1 دقيقة + UV" ، إلخ.
  8. خلايا الطرد المركزي عند 2,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. أعد تعليق كل عينة في 300 ميكرولتر M9 وسط أو PBS وأضف 33 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك البارد 100٪ (TCA) لترسيب البروتينات. جهاز طرد مركزي يترسب TCA في جهاز طرد صغير بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق ويزيل المادة الطافية. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين العينات عند - 20 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >5. الكشف عن الترسيب المناعي واكتشاف المنتجات المتشابكة

  1. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للذوبان (15٪ جلسرين ، 200 ملي Trisbase ، 15 ملي مولار EDTA ، 4٪ SDS ، 2 ملي PMSF) إلى كل عينة وقم بالتسخين مع التحريك عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإذابة البروتين المترسب.
  2. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي المشع (RIPA) (50 ملي مولار Tris pH 8.0 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.0٪ Igepal CA-630 ، 0.5٪ ديوكسيكولات ، 0.1٪ SDS) وقم بإجراء الترسبات المناعيةالقياسية 15 باستخدام خمس إلى نصف كل عينة.
    ملاحظة: يتم استخدام Igepal CA-630 (octylphenyl-polyethylene glycol) بدلا من NP-40 ، والذي لم يعد متاحا تجاريا. لا يمكن تمييز المركبين كيميائيا.
  3. حل البروتينات المترسبة المناعية بواسطة SDS-PAGE. تلطيخ ، وإزالة البقع ، والمواد الهلامية الجافة.
  4. قم بتعريض المواد الهلامية لشاشة الفوسفور O / N واكتشاف البروتينات المشعة (بما في ذلك منتجات التشابك) باستخدام الفوسفوريجر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمنا الربط الضوئي الخاص بالموقع لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع EspP أثناء رحلتها إلى OM. في التجارب الموضحة هنا ، تم استبدال كودونات فينيل ألانين في المخلفات 1113 و 1214 بكدونات كهرمانية. يقع كلا الموضعين في النطاق bالمجال ، والذي يندمج في OM ويعمل كمرساة غشائية. يوضح التركيب البلوري لمجال EspPβ16 أن البقايا موجودة على الجانب المحيط برازمي من البرميل b ولكن يتم فصلهما ب ~ 120 درجة (انظر الهيكل في الشكلين 2 و 3). بكتريا قولونية سلالة AD20217...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة طريقة تجمع بين الربط الضوئي الخاص بالموقع مع وضع العلامات على مطاردة النبض لفحص ديناميكيات التفاعلات بين البروتين ذي الاهتمام والمكونات الأخرى للخلية الحية. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة العمليات متعددة الخطوات التي يتفاعل فيها البروتين بالتتابع مع عوامل أخرى. على عكس مناهج الربط الكيميائي التقليدية ، يوفر الربط الضوئي الخاص بالموقع معلومات مفصلة حول حالة الأجزاء الفردية أو حتى المخلفات الفردية للبروتين ذي الأهمية. هذه المعلومات ذات قيمة خاصة في تحليل البروتينات التي لها مجالات أو وحدات مستقلة متعددة أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة الطفرات الموجهة بالموقع QuikChange IIAgilent200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)BachemF-2800
TRAsup35S-LABEL، كاشف وضع العلامات الأيضية (35< / sup>S-L-methionine و 35< / sup>S-L-cysteine، >1,000 Ci / mmol)MP Biomedicals51006
Spectroline SB-100P مصباح الأشعة فوق البنفسجية فائق الكثافة ، 365 نانومترSpectronics CorporationSB-110P
Spectroline Replacement Bulb 100SSpectronics Corporation11-992-15
Falcon Tissue Culture Plate ، 6 آبارBecton Dickinson Labware353046
يمكن التخلص منها 125 مل قارورة ErlenmeyerCorning430421
Innova 3100 حمام مائي يهزجديد برونزويك العلمي، n.a.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  2. von Mering, C., et al. Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417, 399-403 (2002).
  3. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. PNAS. 99, 11020-11024 (2002).
  4. Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).
  5. Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning. Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).
  6. Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain. PNAS. 108, 383-391 (2011).
  7. Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 5, (2010).
  8. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae. J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).
  9. Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris. Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).
  10. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).
  11. Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells. Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).
  12. Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).
  13. Ieva, R., Bernstein, H. D. Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane. PNAS. 106, 19120-19125 (2009).
  14. Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion. PNAS. 110, (2013).
  15. Harlow, D., Lane, D. Using antibodies: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
  16. Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes. Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).
  17. Akiyama, Y., Ito, K. SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE

مقالات ذات صلة