يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص

12K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51218

⸱

يناير 27, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

في هذه المقالة

ملخص

تنشيط دائم لG-البروتين يقترن مستقبلات نتائج المثبطة في توعية أدينيليل محلقة الإشارة. لتحديد المسارات الجزيئية الأساسية، ونهج nonbiased ضرورية، ولكن هذا يتطلب استراتيجية تطوير خلية مقرها قابلة المخيم توعية الفحص. هنا، نحن تصف مقايسة لتوعية جزيء صغير وسيرنا الفرز.

الملخص

وقد تورط توعية أدينيليل محلقة (AC) إشارات في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية بما في ذلك تعاطي المخدرات ومرض الشلل الرعاش. تفعيل الحاد في Gαi / المستقبلات المرتبطة س يثبط النشاط AC، بينما تنشيط دائم لهذه النتائج المستقبلات في توعية مغاير من AC وزيادة مستويات مخيم داخل الخلايا. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا تعزيز الاستجابة AC لوحظ سواء في المختبر والمجراة عقب تفعيل المزمن من عدة أنواع من المستقبلات Gαi / س مرتبطة بما في ذلك مد 2 الدوبامين وμ مستقبلات المواد الأفيونية. على الرغم من أن أفيد غيري من التوعية AC للمرة الأولى منذ أربعة عقود، آلية (ق) التي تكمن وراء هذه الظاهرة لا تزال مجهولة إلى حد كبير. عدم وجود بيانات الآلية يعكس يفترض أن التعقيد مع هذا الرد على التكيف، مما يشير إلى أن النهج nonbiased يمكن أن تساعد في تحديدجي المسارات الجزيئية المشاركة في توعية مغاير من AC. وقد تورط الدراسات السابقة كيناز وGbγ إشارات على أنها متداخلة المكونات التي تنظم توعية مغاير من AC. لتحديد أهداف إضافية فريدة ومتداخلة المرتبطة توعية AC، مطلوب تطوير والتحقق من صحة قابلة للمقايسة المخيم توعية لزيادة الإنتاجية. النهج السابقة لدراسة توعية عموما مرهقة تنطوي على خلية المستمر الصيانة الثقافة وكذلك منهجية معقدة لقياس تراكم المخيم الذي ينطوي على خطوات غسل متعددة. وبالتالي، فإن تطوير فحص خلية مقرها قوية والتي يمكن استخدامها لفحص إنتاجية عالية (HTS) في شكل جيد 384 تسهيل الدراسات المستقبلية. باستخدام اثنين من مستقبلات الدوبامين D 2 نماذج الخلوية (أي. CHO-D-2L وكلوة الجنين البشري AC6 / D 2L)، ونحن لدينا فحص وتحويلها توعية 48 جيدا (> 20 الخطوات 4-5 أيام) إلى خمسة لياليTEP، مقايسة يوم واحد في شكل 384 جيدا. هذا الشكل الجديد هو قابل للفحص جزيء صغير، وعلينا أن نبرهن على هذا التصميم الفحص يمكن أيضا أن تستخدم بسهولة لترنسفكأيشن سيرنا عكس تحسبا لاستهداف الفرز مكتبة سيرنا.

المقدمة

تم اكتشاف أدينيليل محلقة التكيفية (AC) إشارة استجابة المعروفة باسم مغاير أو فائقة توعية الأولى في مختبر الحائز على جائزة نوبل، والدكتور مارشال Nirenberg. اقترح الدكتور Nirenberg أن زيادة الاستجابة AC لاحظ التالية تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمنة كانت آلية المشاركة في التسامح الأفيونية والاعتماد 1. بالإضافة إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمن، يحدث هذا الرد neuroadaptive من AC يشير أيضا التالية تنشيط دائم لعدة Gαi / س يقترن مستقبلات أخرى 2. والجدير بالذكر أن العديد من هذه المستقبلات المقترنة مع الألم، والاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية، وتشمل المواد الأفيونية μ / κ، D 2/4 الدوبامين، 5HT 1A، وM 2/4 مستقبلات المسكارينية 2. بالإضافة إلى النتائج د. Nirenberg، ومجموعة كبيرة من الأدلة التي تربط موجود توعية AC يشير إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية المزمنة على حد سواء في المختبر والمجراة 3-7. كما تم المرتبطة توعية AC مع مجموعة متنوعة من الأمراض التي تنطوي على مستقبلات الدوبامين D 2 مثل بما في ذلك الفصام ومرض باركنسون (للمراجعة أنظر المرجع 2). على الرغم من الأهمية المحتملة للتوعية، وآلية دقيقة (ق) المرتبطة المستمرة Gαi / س يقترن تنشيط مستقبلات التي تؤدي إلى زيادة لا تزال مجهولة إلى حد كبير استجابة AC.

توفر هذه الدراسات الأساس المنطقي لدراسة آليات لتوعية أدينيليل محلقة كهدف مهم العصبية الحيوية. وبالمثل، ينبغي أيضا الاعتراف أهمية الفسيولوجية للAC إشارة 8 وأهمية أن عقد الأشكال الإسوية AC الفردية في هذه الاستجابة التكيفية 2،9،10. في سياق بحثنا، الملامح العامة المرتبطة توعية مغاير من الأشكال الإسوية المؤتلف من AC موازية تلك الخصائص قصرcribed لدراسة الأشكال الإسوية الذاتية للAC. على وجه التحديد، وقد وجدت الأبحاث السابقة أن تفعيل بروتينات Gαi / س ومفارز إطلاق اللاحقة / إعادة ترتيب βγ هي المتطلبات الهامة للمستقبلات التي يسببها توعية جميع الأشكال الإسوية AC. بالإضافة إلى ذلك، تشير العديد من الدراسات أن يشير من تحركات البروتينات ومفارز Gβγ يشاركون في التوعية 2،11-13. أيضا عرض التكييف الفردية أنماط فريدة من نوعها ومتميزة توعية 12. على سبيل المثال، يرتبط التعرض المستمر للمستقبلات D 2 لمنبهات مع توعية AC1 وAC8 لكا 2 + / كالمودولين التحفيز 14،15، في حين لم يتم توعيتهم على AC3 وثيقة الصلة 2. ترتبط AC2، AC4، وAC7 عن كثب، ومع ذلك، يتم توعيتهم فقط النشاط AC2 حفز PKC-بقوة بعد التعرض لفترة طويلة من مستقبلات D 2 إلى ناهضات 7،14،16،17. بالإضافة إلى ذلك، AC5 وAC6 تظهر درجة ملحوظة من شاذ؛ غير سويتوعية ologous إلى الغاز وحفز forskolin تراكم المخيم التالية تفعيل مستقبلات D 2 14،18-20، ولكن يبدو أن تختلف في ما يتطلبه Gβγ الوحيدات-AC التفاعلات 21. على الرغم من أن معظم الدراسات من AC توعية استخدمت خطوط الخلايا نموذج (مثل الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC الفردية)، يبدو أن هذه النتائج تترجم إلى نماذج الخلايا العصبية الأصلي 4،22. في الآونة الأخيرة، وآثار AC الإسوي مثبطات جزيء صغير المحددة في الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC يمكن أيضا أن تترجم إليها في الدراسات المجراة السلوكية 23.

من المرجح يعكس عدم وجود آلية الجزيئية التي تم تحديدها لتوعية مغاير تعقيد استجابة تكيفية وكذلك خصائص تنظيمية فريدة من نوعها للفرد AC الأشكال الإسوية 12. كشف هذه الدرجة من التعقيد يزداد تعقيدا من خلال استخدام منهجية مرهقة رقبعة محدودة المحققين الأكاديمية من استخدام نهج غير متحيز. على سبيل المثال، تشارك دراساتنا السابقة الآلي استخدام النماذج الخلوية مثقف باستمرار باستخدام 24 - و 48 جيدا زراعة الأنسجة شكل 15. وعادة ما نمت الخلايا المستزرعة لمدة 48 ساعة ثم تعرض لمعاملة المخدرات ناهض (2-18 ساعة)، يليه سلسلة من يغسل الخلايا وحضانات (الشكل 1). كان المخيم محددة بروتوكولات تراكم AC-الإسوي ثم يعمل تليها قياس تراكم المخيم باستخدام شاقة وتستغرق وقتا طويلا [3 H] المخيم منهجية 15،24 ملزمة. مدة من البداية الى النهاية لكل مقايسة مطلوب عموما ما مجموعه أربعة إلى خمسة أيام من الطلاء الخلية لتحليل البيانات (الشكل 1). وقد أدى تطبيق التكنولوجيات الجديدة والأتمتة إلى تحسينات ملحوظة للدراسات التوعية في الإعداد الصناعية ومركز HTS. على سبيل المثال، مجموعة العمل مع المركز الوطني للكيمىذكرت كال الجينوم اثنين يوم HTS إجراء فحص لتحديد جزيء صغير مثبطات مستقبلات المواد الأفيونية من μ يسببها التوعية في 1،536 جيدا شكل 25.

ويصف هذه المادة جهودنا لتطوير مقايسة HTS للدراسات توعية مغاير باستخدام التكنولوجيات المتوفرة في معظم المؤسسات البحثية الأكاديمية. تم إنجاز هذه الاستراتيجية من خلال دمج استخدام الخلايا cryopreserved من نماذج الخلايا معربا عن heterologously على مستقبلات الدوبامين D 2 في تركيبة مع الذاتية الفردية أو المؤتلف الأشكال الإسوية أدينيليل محلقة (CHO-D-2L أو كلوة الجنين البشري AC6 / D 2 L). لتحسين الإنتاجية لدينا، ونحن لدينا 48 إعادة تصميم جيدا مقايسة توعية (حوالي> 20 خطوات أكثر من 4-5 أيام) إلى خمس خطوات، مقايسة يوم واحد في شكل 384-جيدا أن كان أساسا "خلط وقراءة". يستخدم الشكل الجديد وقت متجانسة المتاحة تجاريا حل مضان (HTRF) فحص لقياس المخيم وفقumulation في خلايا سليمة مع لوحة متعددة وضع القارئ. مقايسة قوية وقابلة للفحص جزيء صغير، ويمكن تطبيقها على نحو فعال للكشف عن مثبطات للتوعية مغاير. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم البيانات التي يسمح استخدام هذا الاختبار مع ترنسفكأيشن عكس سيرنا لاستهداف أو الجينوم واسعة الفرز مكتبة سيرنا فقط مع تعديل طفيف على النهج العام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التوسع والحفظ بالتبريد من الخلايا الفحص جاهز

  1. ثقافة CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) الخلايا على طبق خلية ثقافة 15 سم 2 في وسائل الإعلام F12 هام لتستكمل مع 1.0 ميكرومتر L-الجلوتامين، 800 ميكروغرام / ميكرولتر G418، 300 ميكروغرام / هيغروميسين ميكرولتر، 100 ش / ميكرولتر البنسلين، 100 ميكروغرام / ميكرولتر الستربتوميسين، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 حتى الخلايا هي 90-95٪ متموجة. غسل الخلايا مع 10 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وحصاد الخلايا عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من العازلة تفارق خلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. resuspend الخلايا باستخدام 12 ميكرولتر من وسائل الإعلام والثقافة، والاعتماد استبعاد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق.
  3. الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 5 ميكرولتر من وسائل الإعلام تجميد (10٪ ميثيل سلفوكسيد، 90٪ FBS). تمييع تعليق خلية لتحقيق تركيز الخلية المطلوبة (على سبيل المثال 1-20 × 10 6 خلية / ميكرولتر).
  4. قسامة 1.0 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل cryovial. احتضان cryovials في حاوية تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية خلال الليل. نقل cryovials إلى السائل N 2 خزان للتخزين على المدى الطويل.

2. طلي الفحص خلايا جاهزة (وعكس ترنسفكأيشن الخيار)

  1. ذوبان الجليد بسرعة على cryovial المجمدة من الخلايا في 37 درجة مئوية حمام الماء. حالما يتم إذابة الخلايا، ونقل الخلايا إلى 15 ميكرولتر المخروطية أنبوب يحتوي على 9 ميكرولتر من غروب-MEM، وتخلط بواسطة قلب الأنبوب 3-5X.
  2. الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 1 ميكرولتر غروب MEM.
  3. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد لتحديد بقاء الخلية وتمييع الخلايا قادرة على البقاء عند الضرورة (على سبيل المثال. 3 × 10 5 خلية / تركيز ميكرولتر) فيالأمثل-MEM. لوحة 10 ميكرولتر / جيد من الخلايا في نسيج الثقافة تعامل وحة 384 جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
  4. جعل التخفيفات المسلسل من المخيم في غروب MEM لتوليد منحنى القياسية لتقدير الإنتاج المخيم من قبل خلايا (وفقا لتوصيات بتصنيع - انظر القسم 7). إضافة 10 ميكرولتر / جيد من معايير المخيم إلى لوحة ملاحظة: منحنى معيار واحد يمكن أن يكون مستعدا على لوحة منفصلة أو الآبار فارغة في واحدة من لوحات مقايسة.
  5. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.

3. عكس سيرنا ترنسفكأيشن الخيار *

هذا القسم هو اختياري وذات الصلة إلى الشكل 3.

  1. يعد حل سيرنا في DDH ريبونوكلياز خالية 2 O (على سبيل المثال 0.4 بمول / ميكرولتر). إضافة 5 ميكرولتر من الآبار الفردية لوحة 384 جيدا، وأجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 حد ذاتهج في درجة حرارة الغرفة.
  2. تمييع Lipofectamine عام 2000 في غروب MEM بمعامل 0.006 (على سبيل المثال إضافة 6 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 إلى 1،000 ميكرولتر من غروب-MEM)، ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  3. احتضان الحل Lipofectamine 2000/Opti-MEM لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 5 ميكرولتر من المخفف حل Lipofectamine 2000/Opti-MEM إلى الآبار الفردية لوحة 384 جيدا الذي يحتوي بالفعل سيرنا. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. لوحة فحص الخلايا على استعداد كما هو موضح أعلاه (القسم 2). أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  6. العودة إلى لوحة فحص حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2) ل48-96 ساعة كما هو محدد لاستهداف الجينات نهدم (انظر المناقشة).

4. فحص جزيء صغير

  1. يخفف من المخدرات من اهتمام (مثبطات على سبيل المثال. جزيء صغير) في غروب-MEM إلى 6X تركيزات النهائي المنشود. التخفيفات التسلسلي يمكن أن تكتمل باستخدام ماصات باليد أو محطة مناولة السائل.
  2. إضافة 2.5 ميكرولتر / جيد للمجمع اختبار أو العازلة التي تحتوي على المركبات (مثل DMSO) إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
  3. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة (الحضانة اختياري).

5. استمرار العلاج ناهض

  1. إعداد 600 نانومتر (أي 6 أضعاف التركيز النهائي المطلوب من 100 نانومتر) حل quinpirole في غروب MEM.
  2. إضافة 2.5 ميكرولتر / جيد من حل نانومتر 600 quinpirole إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
  3. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة.

6. التحفيز مخيم تراكم

  1. أثناء الحضانة 2 ساعة، وإعداد stimulatiعلى الحل في غروب MEM. ويتألف الحل التحفيز من 40 ميكرومتر forskolin، 2 ميكرومتر الاستيوفينون 3-1-methyxanthine (IBMX)، و 4 ميكرومتر سبيبيرون (جميع التركيزات في الخطوة 6 و4X تركيز النهائي المطلوب).
  2. إضافة 5 ميكرولتر / جيد من الحل التحفيز إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
  3. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.

7. تبريد وتقدير من المخيم تراكم

  1. يتم قياس الإنتاج من المخيم من قبل الخلايا باستخدام المخيم ديناميكية 2 عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لفترة وجيزة، إعادة المضادة للمعسكر ومعسكر cryptate-D2 في الماء المقطر. تجميد aliquots في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير.
  2. تمييع قسامة واحدة المضادة للمعسكر cryptate وقسامة واحدة من المخيم-D2 بشكل منفصل في تحلل العازلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لجعل حلول العمل.
  3. Aي 10 ميكرولتر / جيد من حل العاملة المضادة للمعسكر cryptate و 10 ميكرولتر / جيد من الحل العمل المخيم-D2 إلى لوحة 384 جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
  4. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  5. قراءة في لوحة قارئ لوحة مضان (إعداد مقياس للحساسية السيارات) باستخدام الإثارة من 337 نانومتر، وقياس الانبعاثات في 620 نانومتر و 665 نانومتر في المصنوعات التعليمات.
  6. تطبيق تحليل ratiometric لتقييم منحنى القياسية في المخيم بتصنيع التعليمات. باستخدام القيم الناتجة، استقراء تراكم المخيم المقدر في آبار اختبار باستخدام برمجيات تحليل البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الجزء الأول تطوير 384 التوعية مغاير كذلك فحص لتحديد مثبطات جزيء صغير باستخدام نموذج الخلية متاحة تجاريا.

لدراسة توعية مغاير في نموذج الخلية، التي قطعناها على أنفسنا عددا من التحسينات التي مكنتنا من تبسيط الفحص إلى "خلط وقراءة" تنسيق. ويسلط الضوء على العديد من التعديلات الرئيسية أدناه، ويتم وصفها بمزيد من التفصيل في المناقشة. الخطوة الرئيسية الأولى التي بتعديل زراعة الخلايا لدينا من الخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في محاولة لتسهيل الدراسات التوعية مغاير، ونحن قد عدلت على نطاق واسع لدينا وسيلة مبسطة السابقة تحقيق "مزيج وقراءة" شكل غير قابلة للتعديل لالفرز الفائق الإنتاجية وآلية الفحص العمل. التعديلات الرئيسية لبروتوكول لدينا يمكن تلخيصها على النحو التالي: 1) استخدام الخلايا cryopreserved كما الكواشف "مقايسة جاهزة"؛ 2) التصغير للمقايسة إلى تنسيق 384 جيدا، و 3) استخدام قياس HTRF من المخيم.

اعتماد الحفظ بال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أنوه السيد ريتشارد زنك وتود Wiernicki للتدريب والتوجيه المنهجي الفحص. نشكر أيضا يوحنا بولس سبنس لقراءة متأنية والاقتراحات التحرير. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة MH 060397، الدماغ والسلوك مؤسسة البحوث، وايلي ليللي وشركة من خلال برنامج جائزة بحوث ليللي (LRAP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CHO-K1-DRD2L< / sub> cellsDiscoveRx930579C2
Ham' s F12 mediaVWRSH30026fs
مصل الأبقار الجنينVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HygromycinFisher50-230-5556
البنسلين / الستربتومايسينلايف تكنولوجيز15070063
أطباق 15 سمBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
عازلة تفكك الخلاياLife Technologies13150016
تقنيات الحياة المالحة المخزنة بالفوسفات10010-049
CryovialsFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC المعالجة 384 بئراPerkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
(±)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapineSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S- (-) SulpirideSigmaS112
Lipofectamine 2000 كاشف التعداءInvitrogen11668019
Trypan blueLife تقنياتT10282
المياه ، DNase و RNaseخالية من MP Biomedicals821739
Gas< / sub> siRNADharmaconمخصص siRNA
غير المستهدف التحكم في siRNADharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02
لوحات

المراجع

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

cAMP 384 HTRF siRNA D2 Quinpirole
المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.