يصف هذا البروتوكول طريقة تقطيع الميكانيكية الرواية التي تسمح للتوسع كروية العصبية الجذعية والخلية السلف المجاميع دون التفكك إلى تعليق خلية واحدة. الحفاظ على الاتصال خلية / خلية يسمح النمو السريع والمستقر لأكثر من 40 المقاطع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وهناك طريقة توسيع المركب-ينطبق على مجاميع من العصبية الجذعية البشرية والخلايا المشتقة من الخلايا السلف الجذعية المحفزة أو الجنين أنسجة المخ
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
ومن شأن التوسع تقنية خلية لجمع أعداد كبيرة من الخلايا من عينة واحدة لتجارب البحوث والتجارب السريرية تستفيد كثيرا المجتمع الخلايا الجذعية. العديد من وسائل التوسع الحالية هي شاقة ومكلفة، وتلك التي تنطوي على التفكك الكامل قد يسبب العديد من أنواع الخلايا الجذعية والسلف للخضوع لتمايز أو الشيخوخة المبكرة. للتغلب على هذه المشاكل، وقد وضعنا طريقة الركض الميكانيكية الآلية المشار إليها باسم "تقطيع" التي هي بسيطة وغير مكلفة. هذا الأسلوب يتجنب التفكك الكيميائية أو الإنزيمية في الخلايا واحد ويسمح لتوسيع نطاق واسع من علق، كروي الثقافات التي تحافظ على اتصال مستمر خلية / خلية بدلا من ذلك. وقد استخدمت في المقام الأول طريقة تقطيع للخلايا الجنينية المستمدة من الدماغ العصبية السلف أو neurospheres، ومؤخرا تم نشرها للاستخدام مع الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة الجنينية والتي يسببها. ويضم هذا الإجراءوفاق بذر neurospheres على طبق بتري زراعة الأنسجة ويمر بعد ذلك حاد، شفرة معقمة من خلال أتمتة الخلايا بشكل فعال في عملية شاقة من الانفصال يدويا ميكانيكيا كل مجال. تعليق الخلايا في الثقافة يوفر سطح نسبة مواتية المنطقة إلى حجم؛ كما أكثر من 500،000 الخلايا يمكن زراعتها داخل neurosphere واحد من أقل من 0.5 ملم في القطر. في واحدة قارورة T175، يمكن أن أكثر من 50 مليون تنمو الخلايا في الثقافات تعليق مقارنة ب 15 مليون فقط في الثقافات ملتصقة. الأهم من ذلك، وقد استخدم هذا الإجراء في إطار تقطيع الممارسات التصنيعية الجيدة الحالية (المركب)، والسماح إنتاج كمية الشامل من المنتجات الخلية السريرية الصف.
المقدمة
هناك تاريخ طويل من توسيع الخلايا الجذعية العصبية في الثقافة القوارض إما أحادي الطبقة 1-3 أو 4-7 neurospheres الكلي. بالإضافة إلى ذلك، تم توسيع الخلايا الاصلية العصبية البشرية (hNPCs) المعزولة من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي النامية في المختبر 8-17. هذه الخلايا هي ثنائية قوية، وقادرة على التفريق في كل من الخلايا النجمية والخلايا العصبية، وكانت أداة مفيدة جدا في دراسة التنمية العصبية وأمراض 18،19 20،21 آلية. كما تم زرع hNPCs في العديد من نماذج حيوانية مختلفة من أمراض الجهاز العصبي المركزي مع مستويات متفاوتة من التكامل والبقاء والآثار الفنية 22-24.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. بيان الأخلاقية والسلامة
- ينطوي هذا الإجراء على استخدام منتجات خلية ثقافة المستمدة من البشر أو الحيوانات. يجب الموافقة على جميع الأنسجة المشتقة قبل استخدامها من قبل المجلس المختص المراجعة المؤسساتي (ق) و / أو لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (ق).
- يجب التخلص من جميع النفايات الحيوية الخطرة وفقا للوائح السلامة التي قررها المؤسسة المعنية. معرفة ومتابعة كل إرشادات السلامة والتخلص منها في محله في جميع أنحاء هذا الإجراء.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أرقام الخلية رقم 5. البيانات الممثل ألف) المتوقعة من hNPCs المجمدة في P19، ثم إذابة وتوسعت باعتبارها أحادي الطبقة ملتصقة باستخدام تفارق الأنزيمية مقارنة neurospheres passaged عبر أسلوب التقطيع. 0 اليوم يمثل عندما تم إذابة الخلايا في P20. B) وصور الممثل من المجالات قبل ختم، 10X. C) و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الرقم 6. تقطيع تخطيطي. توسيع الخلايا الجذعية كروي / السلف في الثقافة باستخدام طريقة تقطيع الميكانيكية.
خطوات حاسمة
يتم عرض لمحة عامة عن نموذج التوسع تقطيع في الشكل 6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور Soshana سفندسن لمراجعة نقدية وتحرير هذا التقرير. وقد ساهم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS 1U24NS078370-01 وCIRM DR2A-05320.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| دورق ، 50 مل | Fisherbrand | FB-100-50 | العديد من المصنعين / الموردين |
| خزانة السلامة الحيوية ، الفئة الثانية | بيكر | SG-603A | 4 أقدام أو 6 أقدام نموذج. ؛ يوصى بنموذج 6 أقدام ؛ العديد من المصنعين / الموردين |
| شفرات ، مزدوجة الحافة الإعدادية | Personna | 74-0002 | العديد من المصنعين / الموردين. تنبيه: |
| تجميد الخلايا | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | DMSO ، |
| جهاز طرد مركزي خال من المصل ، دلو متأرجح مع إدراج 15 مل | Eppendorf | 5810 R | العديد من المصنعين / الموردين |
| أنابيب مخروطية ، 15 مل | Fisherbrand | S50712 | مصنعين / موردين متعددين |
| أنابيب مخروطية ، 50 مل | BD Falcon | 352074 | مصنعين متعددين / الموردين |
| مسوي الفريزر بمعدل التحكم | Kryo 750 | العديد من المصنعين / الموردين | |
| Cryovials ، 2 مل | Corning | 430488 | العديد من المصنعين / الموردين |
| قارورة الثقافة ، Neated ، T12.5 | BD Falcon | 353107 | العديد من المصنعين / الموردين قارورة |
| الثقافة ، Vented ، T25 | BD Falcon | 353081 | العديد من المصنعين / الموردين |
| قارورة ثقافة, تنفيس, T175 | BD Falcon | 353045 | العديد من الشركات المصنعة / الموردين |
| قارورة ثقافة, تنفيس, T75 | BD Falcon | 353110 | العديد من المصنعين / الموردين |
| تصفية ، 0.22 & م ، كوب مرفق ، 1 لتر | ميليبور | SCGPU11RE | العديد من المصنعين / الموردين |
| مرشح ، 0.22 ومايكرو ؛ م ، كوب مرفق ، 150 مل | ميليبور | SCGVU01RE | العديد من المصنعين / الموردين |
| فلتر ، 0.22 ومايكرو ؛ م ، كوب مرفق ، 500 مل | ميليبور | SCGPU05RE | العديد من المصنعين / الموردين |
| فلتر ، 0.22 ومايكرو ؛ م ، كوب مرفق ، 50 مل | Millipore | SCGP00525 | العديد من المصنعين / الموردين |
| ورق الترشيح ، دوائر 8.5 سم Whatman | / GE | 1001-085 | |
| ملقط ، نمط قياسي - مسنن / منحني / 18 سم | أدوات العلوم الدقيقة | 11001-18 | |
| غرفة التجميد ، كحول الأيزوبروبيل | Nalgene | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| حاضنة ، 37 درجة ؛ C / 5٪ CO2< / sub> | Forma | 370 | متعددة المصنعين / الموردين مقياس |
| الدم ، المرحلة | Hausser Scientific | 1475 | مصنعين / موردين متعددين |
| McIlwain Tissue Chopper | Lafayette Instruments | TC752-PD | & nbsp ؛ مطلوب تعديل طبق بتري. تحذير: تتحرك ، شفرة حادة. |
| ماصات دقيقة ، 1-10 مو ؛ ل | جيلسون | F144562 | العديد من المصنعين / الموردين |
| Micropipettor ، 100-1،000 مو ؛ ل (طقم بداية) | جيلسون | F167700 | العديد من المصنعين / الموردين |
| Micropipettor ، 2-20 & mu ؛ ل (طقم بداية) | جيلسون | F167700 | العديد من المصنعين / الموردين |
| Micropipettor ، 20-200 مو ؛ ل (طقم بداية) | جيلسون | F167700 | العديد من المصنعين / الموردين |
| Nutdriver ، قابل للتعقيم ، 5/16 " | Steritool | 10302 | |
| Pasteur Pipets ، | Fisherbrand | 13-678-8B | الموصولة بالكهرباء / الموردين العديد من المصنعين / الموردين |
| طبق بتري ، زجاج ، كورنينج قابل للتعقيم | 3160-100 | ||
| Pipet Aid | Drummond | 4-000-101 | العديد من المصنعين / الموردين |
| الرقائق قرص | McMaster-Carr | VARIABLE | العديد من المصنعين / الموردين |
| نصائح ماصة حاجز معقمة ، 10 & مو ؛ ل | AvantGuard | AV10R-H | العديد من المصنعين / الموردين |
| نصائح ماصة حاجز معقم ، 1,000 مو ؛ ل | AvantGuard | AV1000 | العديد من المصنعين / الموردين |
| نصائح ماصة حاجز معقمة ، 20 مو ؛ ل | AvantGuard | AV20-H | العديد من المصنعين / الموردين |
| نصائح ماصة حاجز معقمة ، 200 مو ؛ ل | AvantGuard | AV200-H | العديد من المصنعين / الموردين |
| ماصات معقمة يمكن التخلص منها ، غلاف بلاستيكي بالكامل ، 10 مل | Fisherbrand | 13-676-10J | مصنعين / موردين متعددين |
| ماصات معقمة يمكن التخلص منها ، غلاف بلاستيكي بالكامل ، 2 مل | Fisherbrand | 13-675-3C | مصنعين / موردين متعددين |
| ماصات معقمة يمكن التخلص منها ، غلاف بلاستيكي بالكامل ، 25 مل | Fisherbrand | 13-676-10K | العديد من المصنعين / الموردين |
| ماصات معقمة يمكن التخلص منها ، غلاف بلاستيكي بالكامل ، 5 مل | Fisherbrand | 13-676-10H | العديد من المصنعين / الموردين |
| أكياس التعقيم ، 19 × 33 سم | Crosstex | SCL | متعددة المصنعين / الموردين |
| مصفاة ، 40 وميكرو ؛ أطباق زراعة الأنسجة m | BD Falcon | 352340 | |
| رفوف أنبوبية BD Falcon 351007 مقاس 60 مم ، متشابكة رباعية الاتجاهات | Fisherbrand | 03-448-17 | |
| وسيط التمدد (Stemline) | Sigma-Aldrich | S3194-500ML | من المهم استخدام عامل نمو البشرة البشرية المؤتلف للعلامة التجارية Stemline |
| (EGF) | Millipore | GF316 | العديد من المصنعين / الموردين عامل |
| مثبط سرطان الدم البشري المؤتلف (LIF) | Millipore | LIF1010 | العديد من المصنعين / الموردين |
| Trypan Blue (0.4٪) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | العديد من المصنعين / الموردين |
| TrypLE Select (1x) | Life Technologies | 12563-011 |
المراجع
- Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cel....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.
A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley
to:
Clive Svendsen
