تجريب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الشم مع الفحص Y-المتاهة

ملخص

نقدم اختبار الاختيار للكشف عن تأثير عطر على سلوك ذبابة الفاكهة باستخدام مقايسة Y-المتاهة.

الملخص

الكشف عن إشارات من البيئة أمر ضروري للحيوانات لضمان بقائها. لهذا الهدف، فإنها تستخدم الاشارات البيئية مثل الرؤية، mechanoreception، والسمع، وchemoperception من خلال الطعم، عن طريق الاتصال المباشر أو عن طريق الشم، والذي يمثل استجابة لجزيء متقلبة تعمل في مدى أطول. الجزيئات الكيميائية المتطايرة هي إشارات مهمة جدا بالنسبة لمعظم الحيوانات في الكشف عن الخطر، مصدرا للغذاء، أو للاتصال بين الأفراد. ذبابة الفاكهة السوداء البطن هي واحدة من النماذج البيولوجية الأكثر شيوعا للعلماء لاستكشاف أساس الخلوية والجزيئية من الشم. من أجل تسليط الضوء على قدرات الشم من هذه الحشرة الصغيرة، ونحن تصف بروتوكول خيار تعديل على أساس الاختبار Y-المتاهة المستخدمة تقليديا مع الفئران. البيانات التي تم الحصول عليها مع Y-متاهات تعطي معلومات قيمة لفهم أفضل لكيفية تعامل الحيوانات مع بيئتها المتغيرة على الدوام. ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لدراسةأثر عطر على ذبابة استجابة استكشافية باستخدام هذه Y-متاهة الفحص.

المقدمة

استقبال كيميائي من خلال الذوق أو الشم هي الطريقة الحسية الرئيسية لبقاء الحيوان. أنه يعطي اشارات الحيوية اللازمة للكشف عن خطر أو مصادر الغذاء، فضلا عن التفاعلات الاجتماعية. كما أنه يساعد الحيوانات في العثور على شريك الجنس الضرورية لتكاثرها. لأكثر من 20 عاما، والبحوث المكثفة، بما في ذلك جائزة نوبل الحائز على العمل من قبل ريتشارد أكسيل وليندا باك في عام 2004 "لاكتشافاتهم من مستقبلات الرائحة وتنظيم نظام حاسة الشم"، وقد نفذت للكشف عن الأسس الجزيئية والخلوية لل ^1،2 الشم.

واحدة من النماذج الحيوانية المفضلة للعلماء لتشريح تصور حاسة الشم هي D. البطن. تشترك هذه الحشرة استراتيجية الترميز رائحة الخلوية والجزيئية مماثلة مع الثدييات. يستخدم المجتمع العلمي النماذج السلوكية المختلفة لدراسة دور عطر في هذا ذبابة الفاكهة. وتشمل هذه الاختبارات فحوصات متعدد الوسائط مثل courtshiع الاختبارات المختلفة حيث طرائق الحسية، بما في ذلك الشم، هي مهمة لانتزاع الخطوبة الذكور ^3. كما وضعت فحوصات أخرى لمعالجة دور عطر بشكل أكثر تحديدا؛ وتشمل هذه T-متاهات، Y-متاهات، فخ المقايسات، الساحات أربعة الميدان والرياح والأنفاق ^{4،5،6،7،8.}

في هذه المقالة نقدم بسيطة تعديل مقايسة Y-المتاهة التي توفر الاستجابات حاسة الشم القوية باستخدام D. البطن. يستخدم لدينا مجموعة المتابعة نهاية النصائح في مخالفة للطريقة الموصوفة سابقا ^9. وبالتالي، لدينا Y-متاهة ميزتان. الأولى، فإنه يتجنب أي عودة في النظام مرة واحدة جعلت الطاير خيارها. الثانية، أنه يحد من تبادل عطر في جميع مناطق Y-المتاهة. هذه الميزة الأخيرة لها أهميتها لأن ذبابة الفاكهة هي حساسة جدا لتدفق الهواء التي كثيرا ما تستخدم لتجنب التشبع الرائحة. لضبط التجريبية مجموعة المتابعة مع تدفق الهواء من شأنه أن يكون الوقت والتكلفة المستهلكة. لذلك، لدينا فحص Y-المتاهة يمثل EFficient وطريقة سريعة لاختبار أداء حاسة الشم من ذبابة الفاكهة.

البروتوكول

1. قبل بدء

1. استخدام الأسهم المرجعية isogenized تحمل الظواهر السلوكية مستقرة وقوية. ليس هناك قاعدة عامة لاختيار هذا السهم، حيث أن جميع الضوابط المحتملة قد تحمل الأليلات الخلفية غير المتجانسة.
2. استخدام هذا التحكم لسلالة تزاوج تبادلي كل الأسهم الأخرى اللازمة لخطوات لاحقة. وعادة ما تمثل هذه الخطوة backcrossing لا يقل عن 5 تمريرات متتالية من الإناث البكر واحدة (للسماح ممكن عبور أكثر من بين الكروموزومات المتماثلة) إلى 2-3 الذكور إشارة إسوي ^5. هذه الخطوة مهمة لتجانس الخلفية الوراثية بين الأسهم ذبابة مختلفة.
3. تحتفظ بمخزونات ذبابة الفاكهة على الدقيق العادي الذرة (9٪)، والخميرة (10٪)، والمتوسطة أجار (1.5٪) تستكمل مع المضادات الحيوية (0.4٪ الميثيل الفقرة هيدروكسي بنزوات) في 12 ساعة ضوء / دورة الظلام في 25 ° C.
4. تحقيق التجارب حسي كيميائي في غرفة التحكم في درجة حرارته (25 درجة مئوية) تحت الضوء الأحمر حتى الآن(للقضاء على مساهمة الإشارات البصرية، والتركيز على إشارات حسي كيميائي). بانتظام تجديد الهواء من الغرفة لتهوية المنطقة الواقعة بين كل تجربة.

2. الاستجابة الشمية باستخدام الفحص Y-المتاهة

1. تجويع الذباب ل16-18 ساعة عند 25 درجة مئوية في أنابيب زجاجية تحتوي على منشفة ورقية مبللة قبل الاختبار.
2. الانضمام إلى موصل Y-شكل لاثنين من قوارير الزجاج وإلى قارورة بلاستيكية صغيرة (القارورة التحميل). استخدام 1 مل ماصة نصائح التي تمر عبر سدادات الرغوة لربط موصل إلى قارورة الثلاثة، والحصول على مغلقة بإحكام Y-المتاهة. قطع نهايات ضيقة من اثنين من نصائح ماصة (~ 2 مم، لتجنب أي عودة الطاير مرة واحدة جعلت من قرارها) لتشكيل اثنين من قارورة "فخ"، ونهاية واحدة كبيرة من طرف ماصة لتشكيل "تحميل" أنبوب (الشكل 1A).
3. فقط قبل توصيل قوارير "الفخ" (الشكل 1B)، ومكان واحد ~ 6 مم رقة الترشيح فيكل قنينة. إضافة 40 ميكرولتر من الحل الرائحة على الورق مرشح واحد، و 40 ميكرولتر من المذيب المقابل على ورقة الترشيح الثانية.
4. أعرض عشرة 4-9 الذباب بعمر يوم واحد في "تحميل" القارورة. لا تستخدم CO ₂ التخدير أثناء هذا النقل، لما لها من تأثير قوي على السلوك ^10. بدلا استخدام التبريد وجيزة على الجليد. التلاعب السليم من الذباب مخدرة المهم للحد من الضغط على المواضيع قدر الإمكان.
   1. إجراء سلسلة من الاختبارات Y-متاهة عند 25 درجة مئوية تحت ضوء بعيدة الحمراء (باستخدام لمبات LED للحد من مصدر التدفئة ممكن) لتجنب المثيرات البصرية إلى أقصى حد ممكن. كن حذرا بالتناوب توجهات Y-متاهات (الرائحة التي تحتوي على أنبوب على اليسار، أو على حق، وأنبوب التحميل في الجبهة أو في الظهر. الشكل 1C).
   2. تسمح عدة ساعات للذباب للدخول في فخ القارورة التي تحتوي على الرائحة أو المذيبات. عد الذباب بعد 24 ساعة إلى زيادة participatiعلى ما يصل إلى أكثر من 80٪ وتوفير أقصى قدر من القيمة الشمية مؤشر (Simonnet، اتصال شخصي).
   3. حساب مؤشر حاسة الشم الناتجة باستخدام الصيغة التالية: (الرقم في أنبوب رائحة - الرقم في أنبوب المذيبات) / العدد الكلي للذباب تحميلها.
5. غسل Y-متاهة انشاء النحو التالي: نقع تفكيك انشاء RBS في 35 MD بين عشية وضحاها. شطف جيدا خارجا مع مياه الحنفية. أخيرا شطف مع الماء منزوع الأيونات والسماح تجف.

3. التحليل الإحصائي للبيانات

1. إجراء اختبار ر، وANOVA في اتجاه واحد أو اتجاهين ANOVA اعتمادا على البيانات والمتغيرات.

النتائج

ويبين الشكل 1D ردين ممثل باستخدام هذه Y-متاهة الفحص. كانتون-S الذكور تجنب بقوة حامض الخليك 10٪ الواحد في الماء المقطر، في حين أنها لا تجنب بشكل ملحوظ حمض فينيل الخل 10٪. وتستند هذه المقايسات في 10 ذكرا لكل تكرار وضعها معا في قارورة التحميل. هذا البروتوكول يمكن أن تؤدي أحيانا إلى الخطأ المعياري كبير من الوسط. إذا لزم الأمر، فمن الممكن للحد من هذا العيب باستخدام 20 ذكرا لكل مكررات بدلا من 10 فقط. رياضيا، واختيار فرد واحد له وزن أقل على قيمة المؤشر لأكبر حجم العينة. ...

المناقشة

ويستند لدينا بروتوكول Y-متاهة على البروتوكول هو موضح سابقا ^9. ومع ذلك، ونحن نقدم اثنين من الاختلافات الرئيسية. الأولى، ونحن نستخدم نصائح ماصة ضيقة لمنع الذباب من العودة مرة واحدة قرروا دخول في قارورة تحتوي على مذيب أو المذيبات بالإضافة إلى الرائحة. هذه النصائح الضيقة هي أيضا مفيدة للحد من انتشار الرائحة في Y-المتاهة. الثانية، ونحن نستخدم أصغر قارورة التحميل لإجبار الذباب للدخول في Y-المتاهة. فمن المهم أن تكون هناك مشاركة عالية من هذه الذباب (80٪ الى 100٪ بعد 24 ساعة؛ Si...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ذبابة الفاكهة البوليسترين أنبوب	VWR أوروبا	734-2255	30 × 25 مم  Y-maze
ذبابة الفاكهة أنبوب البورسليكات	ديجون فير		95 × 25 مم Y-متاهة
سدادة رغوة	Dutscher	999038	Y-maze
موصل على شكل حرف	Y Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 & micro; l أطراف الماصة	Corning	4868	اربط أطراف الماصة التالية بالموصل على شكل حرف Y. قم بقص 2 من أطراف الماصة على بعد 65 مم من الطرف العريض ، وقم بتوصيل الطرف الضيق (باستخدام a ∼ فتح 2 مم) إلى 2 قارورة اختبار. ستحد هذه الفتحات من المنعطفات على شكل حرف U بمجرد دخول الذباب إلى الأنابيب التي تحتوي على الروائح. اقطع طرف ماصة واحد على بعد 35 مم من الطرف العريض ، وقم بتوصيله بقارورة التحميل. لمبة LED متاهة
Y-Far-Red	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 نانومتر
حمض الخليك	سيجما ألدريتش	45725
حمض فينيل أسيتيك	سيجما-ألدريتش	P16621
الخميرة	الحساسة ستراسبورغ	1018880464
دقيق الذرة	Eurogerm	Farine de maï s
أجار	كاليس	HP-697-25
ميثيل هيدروكسي 4 بنزوات	VWR 25605293

Y نكهات الدولية