مقالة منهجية

الطباعة المغمورة من خلايا على سطح معدلة باستخدام التدفق المستمر Microspotter

DOI:

10.3791/51273

⸱

أبريل 22, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wasatch Microfluidics, 2Department of Mechanical Engineering, University of Utah

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقوم تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد بطباعة مصفوفات من الخلايا على الأسطح المغمورة. نصف كيف يتم تسليم مصفوفات الخلايا ميكروسوائل في خلايا التدفق ثلاثية الأبعاد على الأسطح المغمورة. من خلال الطباعة على الأسطح المغمورة ، تم إنتاج المصفوفات الدقيقة للخلايا التي تسمح بفحص الأدوية وتقييم السمية الخلوية في العديد من المناطق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمتلك طباعة الخلايا لتطبيقات المصفوفات الدقيقة تحديات كبيرة بما في ذلك مشكلة الحفاظ على النمط الظاهري للخلية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية بعد الطباعة ، وسوء تنظيم الخلايا المرغوبة وتوزيعها ، وعدم القدرة على توصيل الأدوية و / أو العناصر الغذائية إلى المناطق المستهدفة في المصفوفة. إن تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد للموائع الدقيقة قادرة بشكل فريد على ختم وطباعة مصفوفات الخلايا على الأسطح المغمورة بطريقة آلية ومتعددة الإرسال. يتيح تصميم مجموعة السوائل ثلاثية الأبعاد لمجموعة الخلايا الدقيقة (MFCA) إنزال طرف رأس الطباعة إلى بئر أو طبق مملوء بالسائل وضغطه على سطح لتشكيل مانع للتغلب. يتصرف طرف السيليكون الناعم لرأس الطباعة مثل الحشية وهو قادر على تشكيل ختم قابل للانعكاس عن طريق الضغط أو التراجع. تقنيات طباعة الخلايا الأخرى مثل الطابعات ذات الدبوس أو الطابعات النافثة للحبر غير قادرة على الطباعة في التطبيقات المغمورة. تعد الطباعة السطحية المغمورة ضرورية للحفاظ على الأنماط الظاهرية للخلايا ومراقبة هذه الخلايا على السطح دون الإخلال بخصائص سطح المادة. من خلال الطباعة على الأسطح المغمورة ، يتم إنتاج المصفوفات الدقيقة للخلايا التي تسمح بفحص الأدوية وتقييم السمية الخلوية في العديد من المجالات بما في ذلك السرطان والسكري والالتهابات والالتهابات وأمراض القلب والأوعية الدموية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أدت التطورات الحديثة في مجال الصناعات الدوائية لزيادة الاهتمام باستخدام ميكروأرس الخلوية في عملية اكتشاف العقاقير لفحص المخدرات وتحليل cytotoxicological 1،2،3. ان تطوير في المختبر فحوصات عالية الإنتاجية وأساليب الفحص باستخدام ميكروأرس خلية تسهيل التنمية السريعة والفعالة من حيث التكلفة من المرشحين المخدرات فضلا عن تعزيز فهم الأساسية للخلية 1،4. النهج التقليدي لفحص مع الخلايا التقليدية يستخدم منصات جيدا لوحة؛ ولكن هذا النهج محدودة بسبب التكلفة العالية، الإنتاجية محدودة، وقدرة محدودة للحصول على معلومات كمية عن وظيفة الخلية 1،5. بسبب هذه القيود، والبحوث في مجال تكنولوجيات ميكروأري الخلوية المتزايد على التوصيف الجزيئي البيولوجي، هندسة الأنسجة، والفحص 1،6 المخدرات. وتشمل مزايا ميكروأرس الخلوية أصغر استخدام عينة، وآثار ضئيلة منالنمط الظاهري الخلوية التجانس اخفاء المعلومات، والأهم من ذلك القدرة على أتمتة المقايسات لمزيد من التطبيقات الإنتاجية العالية 1،7،8.

يستخدم حاليا صناعة الأدوية عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا فحوصات الفرز مع 2D الثقافات أحادي الطبقة خلية لفحص المخدرات في لوحات عيار مكروي جيدا 9. الخلايا المتنوعة في آبار وحات microtiter يوفر إمكانية إنتاجية أعلى مع خيارات التجريب فريدة من نوعها. علاوة على ذلك، التقنيات الحالية لميكروأرس الخلوية تسمح للخلايا لتجف الذي يمكن أن يغير بشكل كبير من النمط الظاهري للخلايا في الجسم الحي من 10،11. من أجل التغلب على هذه المشاكل، تم هندستها لMFCA ويظهر في الشكل 1. تصميم FLUIDICS MFCA 3D تمكن غيض رأس الطباعة في الشكل 1 أن يكون خفضت في حمام وضغطها على سطح على شكل خاتم. غيض السيليكون لينة من رأس الطباعة يتصرف مثلوتشكل طوقا ختم عكسها. هي مناسبة التكنولوجيا MFCA فريد على التفاعل مع الأسطح المغمورة، وهو مطلوب لكلا مزارع الخلايا والأنسجة أنظمة شريحة، ومن الصعب أو المستحيل مع معظم المناهج الأخرى. سوف دبابيس أو الطباعة بالحبر النفاث لا تعمل، وعدم تناسب الأجهزة ميكروفلويديك 2D لترسب أو التواصل مع صفائف كبيرة من بقع منفصلة. علاوة على ذلك، عن طريق التصغير وإضفاء الطابع المحلي على التجربة - ميكروأري الخلوية - وMFCA يتغلب على المشاكل الرئيسية المرتبطة عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا فحوصات الفرز.

يستخدم CFM شبكات قناة 3D لدورة صغيرة عينات السائل حجم البقعة على مواقع المجهرية على سطح 12،13. عن طريق طباعة مع التدفق، ويتم الاحتفاظ الجزيئات الحيوية، والخلايا، والكواشف الأخرى في البيئة السائلة في جميع مراحل عملية الطباعة، وتمكن من الطباعة من الجزيئات الحيوية الحساسة والخلايا دون التعرض للهواء، مما يعوق تقنيات الطباعة الخلية الحالية. ومن الممكن أيضا لطباعة مباشرة من المواد الخام مثل هجين أو supernatants المقدمة هناك آلية القبض على السطح مجموعة. الهدف من هذا المخطوط هو شرح بالتفصيل الطباعة المغمور من أنواع الخلايا اثنين على سطح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الخلية تحضير الثقافة

  1. تخزين مخزون الخلية NIH/3T3 في النيتروجين السائل حتى جاهزة للاستخدام.
  2. إعداد وسائل الإعلام كاملة للخلايا باستخدام NIH/3T3 Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 10 ملي HEPES العازلة، 50 وحدة / مل البنسلين، و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين.
  3. ذوبان الجليد الخلايا لمدة 2-3 دقيقة في حمام مائي تهتز عند 37 درجة مئوية.
  4. خلايا resuspend في 5 مل من وسائل الإعلام كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 3 دقائق.
  5. إزالة طاف الخلية دون الإخلال بيليه الخلية.
  6. resuspend الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    1. إزالة 10 ميكرولتر من تعليق خلية ووضعه في أنبوب microcentrifuge 0.5 مل.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لتعليق الخلية ويحرك مع غيض من ماصة.
    3. ماصة 10 ميكرولتر من الخلايا الملون في غرفة عدادة الكريات.
    4. عد الخلايا في عدادة الكريات في 10Xالتكبير.
      1. عد الخلايا الحية (وكرات بيضاء صغيرة) لمدة 4 من 9 مربعات كبيرة. الاعتماد فقط على الخلايا الحية التي لا تظهر زرقاء داكنة من وصمة عار التريبان الأزرق.
      2. حساب متوسط ​​عدد الخلايا في مربع كبير، مما أدى إلى عدد من الخلايا × 10 4 خلية / مل في خلايا التعليق الأصلي.
      3. خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من 1 X10 5 خلية / مل مع ما مجموعه 5 مل في كل قارورة T25.
    5. خلايا الثقافة إلى ما بين 70٪ و 80٪ confluency قبل بداية التجارب. تحديث وسائل الاعلام كل 2-3 أيام أو حسب الحاجة.

2. الطباعة تحضير السطح

  1. علامة مستطيل مع علامة على الجزء السفلي من على بعد المعالجة زراعة الأنسجة البوليسترين (TCTPS) 12 لوحة جيدا حجم رأس الطباعة (7 ملم × 19 ملم).
  2. ماصة 50 ميكرولتر من مصل بقري جنيني في منطقة مستطيلة وانتشاره على كامل المنطقة مع طرف.
  3. يترك طبق بيتريفي العقيمة السلامة الأحيائية هود O / N للسماح للبقعة الدم لتجف تماما. وينبغي إعداد هذه اللوحات لا يزيد عن 2 أيام قبل الاستخدام.

3. الطباعة الغارقة

  1. شطف رأس الطباعة بالماء المقطر.
    1. ملء 60 مم طبق بيتري مع الماء المقطر وإرساء رأس الطباعة على السطح.
    2. تدفق الماء المقطر من خلال كل من خطوط لمدة 2 دقيقة في 150 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة تعمل بالهواء المضغوط.
    3. تجاهل المياه من طبق بيتري وملئه بالماء النظيف.
    4. تحريك رأس الطباعة صعودا وهبوطا في الماء 3 مرات.
  2. إرساء مركز رأس الطباعة على الفور المغلفة المصل في معدة سلفا 12 لوحة جيدا.
  3. رئيس رأس الطباعة مع وسائل الإعلام كاملة قبل تحسنت، 300 ميكرولتر لكل قناة.
  4. طباعة الخلايا علقت في تركيز 50،000 خلية / مل على سطح و 60 ميكرولتر / دقيقة، و 100 ميكرولتر لكل قناة.
  5. وضع رأس الطباعة، غادر رست ضدالسطح، ومتعددة في حاضنة الثقافة خلية لتعيين 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  6. بعد حضانة 2 ساعة، وإزالة رأس الطباعة ووضع غطاء على طبق الثقافة. ويعتبر الوقت الذي رأس الطباعة إزالة نقطة زمنية 0 ساعة.

4. الثقافة الخلية القياسية

  1. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام قبل تحسنت إلى واحد من لوحة TCTPS 12 جيدا المصل رصدت أعدت في الخطوة 2.
  2. تأخذ 1 مل من تعليق خلية المتبقية من الخطوة 2 وماصة في بئر واحدة من 12 لوحة جيدا TCTPS. هذا وسوف تنتج الثقافة التي تحتوي على 50،000 الخلايا في الطبق.
  3. وضع لوحة الثقافة خلية في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  4. بعد حضانة 2 ساعة توقيت البدء؛ من أجل التناسق بين العينات المطبوعة والبذر، ويعتبر هذا نقطة الوقت 0 ساعة.

5. التصور الثقافة

  1. بعد 0، 2، 24، و 48 ساعة من الخلايا تأخذ كل واحدة من طريقتين دescribed أعلاه والصورة باستخدام مجهر مقلوب القياسية.
    1. وصمة عار على الخلايا باستخدام يوديد propidium، وصمة عار أحمر فلوري أن يتم تضمينها فقط في نواة الخلايا الميتة.
      1. شطف بلطف الخلايا 3 مرات مع 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة مع الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS + +) لإزالة أي حطام.
      2. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل تحسنت + + إلى كل سفينة الثقافة.
      3. إضافة 1 ميكرولتر من محلول يوديد propidium الأسهم (1 ملغ / مل) لكل سفينة الثقافة.
      4. احتضان الخلايا ملطخة يوديد propidium عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. صورة الخلايا باستخدام مجهر مقلوب في 10X 40X والتكبير.
  2. تجاهل الخلايا في وعاء واقية مناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طبعت الخلايا NIH/3T3 خط الخلية الليفية أو المصنفة على سطح المغمورة. وقد نمت الخلايا إلى كثافة 5 X 10 4 خلية لكل مل. وكانت المصنفة الخلايا باستخدام تقنيات زراعة الخلايا التقليدية. طبعت الخلايا باستخدام-شكل كبير، واثني عشر تدفق رأس الطباعة الخلية حيث القنوات هي أكبر (~ 500 ميكرون) من CFM المستخدمة للبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى. طبعت الخلايا أو المصنفة على سطح المصل المغلفة. يظهر عملية الطباعة في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكنولوجيا الطباعة 3D ميكروفلويديك الموصوفة هنا هو قادر فريد من صفائف الطباعة microfluidically من الخلايا في السائل شغلها جيدا، أي سطح المغمورة. عن طريق طباعة على الأسطح المغمورة، ميكروأرس الخلية يمكن أن تنتج التي تحافظ على النمط الظاهري الخلوية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للخلايا وكذلك القدرة على معدد الخلايا في الجزء السفلي من بئر واحدة الشكل 4. نتائج هذه الدراسة تظهر أن microfluidically طباعة النتائج في الخلايا مرفق الخلية مع خلية التشكل للمقارنة و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين والموظفين والمساهمين وستش الموائع الدقيقة التي تنتج الكواشف و / أو الأدوات المستخدمة في هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أنوه كريس مورو للحصول على المساعدة الفنية. تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة SBIR (R43) منح 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
التدفق المستمر microspotterWasatch Microfluidics
خلايا NIH / 3T3ATCCCRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle MediumInvitrogen11965-092الوسائط الأساسية للخلايا
HEPES BufferInvitrogen15630-080مضافة لوسائط الخلية (التحكم في درجة الحموضة)
بيروفات الصوديومInvitrogen11360-070مادة مضافة للوسائط
الخلوية بنسلين ستربتومايسين مادة مضافة وسائط خليةInvitrogen
Trypan blueInvitrogen15250-061خلية وصمة عار لعد
مقياس الدمفيشر267110غرفة الخلية لعد الخلايا
نيكون كسوف TS100نيكونتستخدم للتحقق من الخلايا
نيكون كسوف TE2000-Uنيكونتستخدم لجمع الصور
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (مع الكالسيوم والمغنيسيوم)Invitrogen14040-133شطف الخلايا قبل المرور وقبل تلطيخها باستخدام PI
TrypLE Express & nbsp ؛InvitrogenA12177-01يستخدم لإزالة الخلايا من السطح
مادة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
  3. Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
  4. Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
  5. Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
  6. Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
  7. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
  8. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  9. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
  10. Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
  11. Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. , Springer. (2008).
  12. Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
  13. Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
  14. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
  15. Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
  16. Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107(1993).
  17. Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
  18. Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
  19. Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
  20. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
  21. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
  22. Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
  23. Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Submerged Cell PrintingContinuous Flow MicrospotterCell MicroarrayFluorescence MicroscopyPropidium Iodide StainNIH 3T3 FibroblastsSerum Coated SurfaceCell Viability AssessmentDrug Screening ApplicationCell Density Analysis

مقالات ذات صلة