مقالة منهجية

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices في المختبر نموذج من السكتة الدماغية

DOI:

10.3791/51291

⸱

فبراير 4, 2014

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Hunter Medical Research Institute, The University of Newcastle, 2School of Health and Human Sciences, Southern Cross University, 3School of Medicine and Public Health, The University of Newcastle

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير نموذج شريحة الدماغ والتي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في إصابات الدماغ بوساطة التحفيز الزائدة. هذا الأسلوب يولد أنسجة المخ ناضجة قابلة للحياة، ويقلل من أعداد الحيوانات المطلوبة لإجراء التجارب، في حين الحفاظ على الدوائر العصبية، والتفاعلات الخلوية، ومقصورات بعد المشبكي سليمة جزئيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة الآليات الجزيئية المشاركة في ظروف نيوروباثولوغيكال، مثل السكتة الدماغية، ويمكن أن يكون من الصعب عند استخدام أنظمة الحيوان كله. على هذا النحو، أو الأولية 'مثل العصبية' نظم زراعة الخلايا تستخدم عادة. في حين أن هذه النظم هي سهلة نسبيا للعمل مع، وتكون نموذجا مفيدا في نظم فيه مختلف النتائج الفنية (مثل موت الخلايا) يمكن أن يكون كميا بسهولة، ونتائج فحص والممرات في الخلايا العصبية غير ناضج مثقف (مثل مسارات موت الخلايا بوساطة التحفيز الزائدة) ليست بالضرورة هي نفس تلك التي لوحظت في الدماغ ناضجة، أو في أنسجة سليمة. وبالتالي، هناك حاجة لتطوير نماذج التي الآليات الخلوية في الأنسجة العصبية الناضجة يمكن فحصها. قمنا بتطوير تقنية في المختبر والتي يمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة من المسارات الجزيئية في النسيج العصبي سليمة. تقنية الموضحة في هذه الوثيقة تستخدم الأنسجة القشرية الفئران، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها لاستخدام الأنسجةمن مجموعة متنوعة من الأنواع (مثل الماوس، الأرنب، خنزير غينيا، والدجاج) أو مناطق الدماغ (على سبيل المثال، الحصين، المخطط، الخ). بالإضافة إلى ذلك، مجموعة متنوعة من التحفيز / العلاجات يمكن استخدامها (على سبيل المثال، excitotoxic المواد، وإدارة مثبطات، الخ). في الختام، ونموذج شريحة الدماغ الموصوفة هنا يمكن استخدامها لدراسة مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية المشاركة في إصابات الدماغ بوساطة التحفيز الزائدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية هي السكتة الدماغية، والذي يحدث عندما تصبح الأوعية الدموية الدماغية المغطي. ونقص تروية الأنسجة التي تنتج عن توقف تدفق الدم يسبب الاستقطاب على نطاق واسع من الأغشية، والإفراج عن الناقلات العصبية مثير، والارتفاع المطرد من الكالسيوم داخل الخلايا، مما يؤدي إلى تفعيل مسارات موت الخلايا 1. وقد أطلق على هذه العملية "التحفيز الزائدة '، وهو الطريق الشائع متورطة في قتل الخلايا العصبية التي تنتجها مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك السكتة الدماغية 2. تثبيط مسارات الإشارات المشاركة في التحفيز الزائدة وغيرها من أجهزة الطرد المركزي موت الخلايا العصبية هو نهج جذابة للحد من الأضرار العصبية التالية السكتة الدماغية.

يمكن تحديد الآليات الجزيئية الدقيقة التي تدخل في التحفيز الزائدة والسكتة الدماغية يكون من الصعب عند استخدام أنظمة الحيوان كله. على هذا النحو، الجنينية الأولية و'مثل العصبية' (على سبيل المثال neuroblastoأماه وغدية خطوط خلد) وغالبا ما تستخدم أنظمة خلية ثقافة. المزايا الرئيسية لهذه النماذج هي أنها سهلة للتلاعب، نسبيا فعالة من حيث التكلفة، وموت الخلايا يمكن قياسه بسهولة وquantitated. ومع ذلك، مسارات إشارات يمكن تغييرها بسبب الظروف زراعة المستخدمة 3،4، والخلايا العصبية غير ناضجة وخلد يمكن التعبير عن مستقبلات خطوط مختلفة والجزيئات مما يشير إلى أن تنضج عند مقارنة الدماغ 5-8. علاوة على ذلك، تسمح فقط الخلايا العصبية مثقف دراسة نوع خلية واحدة (أو اثنين، إذا تم استخدام نظام coculture)، في حين أن أنسجة المخ سليمة غير المتجانسة، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التي تتفاعل مع بعضها البعض. كما تستخدم نظم عضوي النمط ثقافة شريحة (إإكسبلنتس رقيقة من أنسجة المخ)، وهذه النماذج تسمح دراسة السكان غير متجانسة من الخلايا كما وجدوا في الجسم الحي. ومع ذلك، فقط كمية محدودة من الأنسجة يمكن الحصول عليها من كل حيوان عند استخدام هذه التقنية، يمكن أن شرائحلا يمكن تربيتها لطالما خطوط الخلايا خلد، والمتوسطة لثقافة على المدى الطويل يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في مسارات الإشارات والمستقبلات في شرائح. في حين الدماغ ناضجة يمكن استخدامها لتوليد شرائح عضوي النمط، وشرائح من الدماغ غير ناضجة هي أكثر استعدادا للثقافة، وتستخدم أكثر شيوعا. وبالتالي هناك حاجة لتطوير نماذج التي تحاكي أو تمثل الدماغ ناضجة سليمة، والتي هي سهلة الاستخدام، والتي مسارات الإشارات العصبية يمكن فحصها.

هنا، يوصف في المختبر تقنية تنطوي على الأنسجة العصبية سليمة والتي يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية المشاركة في موت الخلايا التالية إهانة excitotoxic المواد أو الدماغية. هذا الأسلوب يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لإجراء التجربة، هو استنساخه، ويولد أنسجة قابلة للحياة أن يتصرف بطريقة مماثلة لعملية الأيض شرائح عضوي النمط أكبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن الدوائر العصبية والتفاعلات الخلوية، وشارك بعد المشبكييبقى mpartment سليمة جزئيا. المخزن المؤقت الفسيولوجية تستخدم يسمح أغشية الخلايا إلى 'إعادة الختم "، وتمكن خلايا للتعافي الأصلية مقاومة الغشاء 9. هذا النموذج شريحة الدماغ قادر على تقليد بأمانة الردود احظ التالية التحفيز الزائدة بوساطة إصابات الدماغ 10، ويمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في السكتة الدماغية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنفيذ كافة الإجراءات بموافقة من جامعة نيوكاسل رعاية الحيوان وجنة الأخلاقيات، وكذلك وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة، بما في ذلك قانون نيو ساوث ويلز بحوث الحيوان، والحيوان اللائحة بحوث نيو ساوث ويلز، وقانون الأسترالي الممارسة ل رعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية.

1. تشريح أنسجة المخ

  1. التضحية الفئران الذكور اثني عشر الاسبوع القديمة عن طريق قطع الرأس. الفئران يمكن أن تكون إما من خلال التضحية مذهلة وقطع الرأس، أو يمكن تخدير الأولى مع isoflurane و(5٪ الاستقراء، صيانة 1.5-2٪) في 70٪ N 2 و 30٪ O 2، ثم مقطوعة الرأس.
  2. إزالة الدماغ من الجمجمة بأسرع وقت ممكن (من الناحية المثالية، ينبغي أن يؤديها في أقل من 2 دقيقة).
  3. إزالة القشرة باليد خالية من تشريح. يجب أن يتم تنفيذ تشريح في الدنيا وقت ممكن، مع أقل قدر الضرر في الدماغ ممكن وذلك إلى maintain سلامة الشرائح.
  4. من أجل إزالة أي الجلد المتبقية، والفراء، والدم، وما إلى ذلك، تزج الدماغ في كمية صغيرة (3-5 مل) من 37 درجة مئوية كريبس العازلة (118 ملي كلوريد الصوديوم، 4.7 ملي كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 1.3 ملي، 1.2 ملي البوتاسيوم هيدروجين فوسفات، 1.2 ملي كبريتات المغنيسيوم وكربونات الصوديوم 25 ملي الهيدروجين، 11.7 ملي الجلوكوز، 0.03 ملي الصوديوم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، معايرتها مع 95٪ أكسجين / ثاني أكسيد الكربون 5٪ (كربوجين)، ودرجة الحموضة 7.4).

2. إعداد Microslices

  1. وضع الدماغ على مرحلة من مراحل المروحية McIlwain التي وضعت شريحتين من ورق الترشيح ومبلل مع العازلة كريبس الدافئة. الحفاظ على الدماغ ورقة الترشيح مبلل مع العازلة كريبس الحارة، ولكن ليس الرطب حتى لا يكون هناك السائل الحرة على سطح الورق التي يمكن أن تسبب الدماغ إلى الشريحة حولها.
  2. شريحة الدماغ إلى 250 ميكرومتر المقاطع الاكليلية. والمواد الغذائية والأكسجين، ومواد النفايات الفي يتم تبادلها عادة يتم تبادلها مع وصول الدم مع السائل الذي يحيط الأنسجة في الأنسجة العصبية معزولة، ينبغي أن حجم شرائح لا يكون أكثر من 400 ميكرون في سمك للسماح كافية الأوكسجين والمغذيات الصرف تحدث.
  3. تحويل المرحلة McIlwain 90 درجة.
  4. شريحة العقول إلى 250 ميكرومتر شرائح السهمي. هنا، هذه أقسام الدماغ (250 ميكرومتر X 250 ميكرون شرائح من طول متغير تبعا لسماكة الأنسجة) ويشار إليها باسم microslices.
  5. وضع microslices في أنبوب أسفل مستديرة مع 10-15 مل 37 ° C العازلة كريبس (كمية العازلة كريبس استخدامها سوف يعتمد على كمية الأنسجة).

3. موازنة من Microslices

  1. تستنهض الهمم بلطف حتى يتم تعليق microslices الفردية، ومن ثم تسمح لهم لتسوية في إطار الجاذبية.
  2. إزالة بعناية طاف، والتي ستكون غائم مع وقف التنفيذ بسبب الحطام الخلية، وإضافة 10 مل الطازجة 37 ° Cكريبس العازلة للأنبوب.
  3. كرر هذا الإجراء غسل أربع مرات، الأمر الذي سيؤدي في إزالة معظم الأنقاض.
  4. وفي أعقاب ذلك، تتوازن microslices عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف / انقلاب وتغيير كريبس العازلة كل 15 دقيقة لمدة 1 ساعة في المجموع.
  5. في هذا الوقت، إضافة 2 مل الطازجة العازلة 37 ° C كريبس، ونقل 15-20 microslices (150 ميكرولتر من تعليق microslice) لالبوليسترين مسطحة القاع 5 مل أنابيب باستخدام اضافية واسعة تحمل ماصة مع حواف ممهدة (والتي يمكن إنشاؤها من قبل قطع ~ 2 ملم من نهاية تلميح P1000). نشر microslices بالتساوي على قاعدة الأنبوب في طبقة واحدة، بحيث يكون لكل microslice ليس أبعد من بضعة ملليمترات من الغلاف الجوي الاوكسيجين.

4. تحفيز excitotoxic المواد

  1. احتضان microslices عند 37 درجة مئوية، وتمرير باستمرار كربوجين على سطح تعليق 150 ميكرولتر microslice، وذلك باستخدام خط الغاز الذي هو موقفإد فقط فوق سطح التعليق microslice (لتجنب انقطاع الميكانيكية).
  2. علاج microslices مع 150 ميكرولتر إما 5 ملي الغلوتامات + 100 ميكرومتر الجلايسين في المخزن كريبس (التحفيز excitotoxic المواد: تركيز النهائي 2.5 ملم الغلوتامات + 50 ميكرومتر الجلايسين) أو 150 ميكرولتر العازلة كريبس وحده (التحكم nonstimulated). مجموعة متنوعة من المحفزات يمكن استخدامها في هذه الخطوة (بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، أمبا، NMDA + الجلايسين، بوكل الاستقطاب، والحرمان الأوكسجين / الجلوكوز).
  3. إزالة الحل الحضانة في أوقات مختلفة بعد التحفيز (0، 30، 60، 90، 120، و 300 ثانية)، واستبدالها 300 ميكرولتر من الجليد الباردة التجانس العازلة (30 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 1 ملم جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic، 4 ملي EDTA، و 100 ميكرومتر كربونات الأمونيوم، 5 ملي بيروفوسفات الصوديوم، 25 ملي فلوريد الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، 1 ملم phenylmethanesulfonylfluoride، كاملة كوكتيل مثبط البروتياز).
  4. التجانس microslices على الجليد، وذلك باستخدام الزجاج تفلون الخالط Dounce(20 السكتات الدماغية؛ 700 دورة في الدقيقة).
  5. متجر الخليط في -80 درجة مئوية، ومختلف الجزيئات يشير الى جزيئات الموت، وما يمكن أن تقاس طخة غربية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microslices إنشاؤها باستخدام هذا الإجراء هي قابلة للحياة، ومجموعة متنوعة من الأنواع (على سبيل المثال، الفئران، والماوس، والدجاج) يمكن استخدامها لإنتاج microslices. وقد تم استخدام ثلاثة تدابير مستقلة عن جدوى: معدل التنفس (الشكل 1)، ونسب الأدينين النوكليوتيدات (الشكل 2)، ومحتوى البوتاسيوم الأنسجة (الشكل 3). باستخدام هذه التدابير، فقد ثبت أن microslices تبقى قابلة للحياة لمدة 2 ساعة على الأقل آخر جيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يوصف في المختبر تقنية لتوليد microslices التي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في التحفيز الزائدة وموت الخلايا بوساطة نقص التروية في أنسجة المخ سليمة ناضجة. هذه التقنية تنتج أنسجة قابلة للحياة (أرقام 1-3)، مشابهة لعملية الأيض شرائح عضوي النمط أكبر 15. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج microslice يتوافق بشكل وثيق لوحظ استجابة التالية التحفيز الزائدة بوساطة إصابات الدماغ في الجسم الحي 10. A 90 ثانية في المخت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أن لديهم أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بأي من الأعمال التي تجري داخل هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل عن طريق تمويل البحوث من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا، ومعهد البحوث الطبية هنتر، وجامعة نيوكاسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المقصلةالمستخدمة لقطع رأس
الجراحية للحيواناتالملقط ، المقص ، الملقط ، etc.< / em> ، لإزالة الدماغ وتشريح
مروحية McIlwainيتم تصنيعها / توزيعها من قبل مجموعة من الشركات بما في ذلك Mickle Engineering و Harvard Apparatus و Campden Instruments و Ted Pella.تستخدم لتوليد 100-400 &# 181 ؛ م أقسام الدماغ.
أنابيب بلاستيكية مستديرة القاعGreiner
حمامللحفاظ على الأنسجة عند 37 درجة ؛ جهاز
الترطيب / التهويةيستخدم للحفاظ على الشرائح الدقيقة في بيئة رطبة مؤكسجة
أنابيب البوليسترين ذات القاع المسطحNunc
Dounce Homogenizer
المعدات مائي C

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
  2. Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
  3. Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
  4. Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
  5. Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
  6. Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
  7. Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
  8. Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
  9. McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , Churchill Livingstone. London. (1975).
  10. Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
  11. Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
  12. Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
  13. Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
  14. Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
  15. Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
  16. Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AMPA Carbogen

مقالات ذات صلة