مقالة منهجية

الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

DOI:

10.3791/51294

⸱

يونيو 10, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Stemorgan Inc., 3Institute of Advanced Study, Technical University of Munich, 4Institute of Virology, School of Medicine, Wuhan University, 5Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute, 6Research Institute for Biomedical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأساليب المذكورة في هذه الورقة تبين كيفية تحويل طابعة نافثة للحبر التجارية في وقت واحد مع bioprinter البلمرة الأشعة فوق البنفسجية. الطابعة قادرة على بناء هيكل الأنسجة 3D مع الخلايا والحيوية. أظهرت الدراسة هنا شيدت neocartilage 3D.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioprinting، الذي يقوم على أساس الحرارية الطباعة النافثة للحبر، هي واحدة من التكنولوجيات التمكينية الأكثر جاذبية في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي. مع خلايا التحكم الرقمي، السقالات، وعوامل النمو يمكن أن تودع على وجه التحديد إلى المطلوب ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثي الأبعاد (3D) مواقع بسرعة. وبالتالي، فإن هذه التكنولوجيا هو النهج المثالي لصنع أنسجة محاكاة الهياكل التشريحية الأصلية الخاصة بهم. من أجل مهندس الغضروف مع منظمة الأم مناطقية، وتكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والخواص الميكانيكية، قمنا بتطوير منصة bioprinting باستخدام طابعة نافثة للحبر التجارية مع بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد قادر على 3D غضروف هندسة الأنسجة. طبعت غضروفية الإنسان معلقة في بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) ل 3D البناء neocartilage عبر طبقة تلو طبقة التجمع. تم إصلاح الخلايا المطبوعة على مواقع المودعة الأصلية، بدعم من surroاوندينج السقالة في بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد. كانت الخواص الميكانيكية للأنسجة مطبوعات مماثلة إلى الغضروف الأصلي. بالمقارنة مع تصنيع الأنسجة التقليدية، الأمر الذي يتطلب وقتا أطول من التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وكان بقاء الخلايا المطبوعة مع بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد أعلى بكثير. أظهرت neocartilage المطبوعة جلايكان ممتاز (GAG) وإنتاج الكولاجين نوع الثاني، وهو ما يتسق مع التعبير الجيني. وبالتالي، هذه المنصة مثالية للتوزيع الخلية دقيقة والترتيب لهندسة الأنسجة التشريحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioprinting استنادا الحرارية الطباعة النافثة للحبر هي واحدة من التقنيات تمكن الواعدة في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي. مع التحكم الرقمي وإنتاجية عالية رؤوس الطباعة العوامل الخلايا، السقالات، والنمو يمكن أن تودع على وجه التحديد إلى المطلوب ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثي الأبعاد (3D) مواقف بسرعة. وقد تم تحقيق العديد من التطبيقات الناجحة في استخدام هذه التكنولوجيا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي 1-9. في هذه الورقة، تم إنشاء منصة bioprinting مع تعديل هيوليت باكارد (HP) منضدية 500 طابعة نافثة للحبر الحرارية ونظام بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد. وقد أظهرت الهلاميات المائية الاصطناعية وضعت من بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) قدرة الحفاظ على استمرارية خلية غضروفية وتشجيع الإنتاج ECM مكون للغضروف 10،11. بالإضافة إلى ذلك، photocrosslinkable PEG قابل للذوبان في الماء بدرجة كبيرة مع اللزوجة المنخفضة، مما يجعلها مثالية لالبوليمر في وقت واحدrization خلال 3D bioprinting. في هذه الورقة، غضروفية الإنسان معلقة في بولي (الاثيلين) diacrylate غليكول (PEGDA؛ ميغاواط 3،400) وطبعت على وجه التحديد لبناء neocartilage طبقة تلو طبقة مع 1،400 نقطة في البوصة القرار في 3D. ولوحظ توزيع متجانس من الخلايا المودعة في سقالة 3D، والتي ولدت الأنسجة الغضروف مع خصائص ميكانيكية ممتازة وتعزيز الإنتاج ECM. على النقيض من ذلك، في تلفيق دليل الخلايا المتراكمة في الجزء السفلي من هلام بدلا من مواقفها المودعة في البداية بسبب تباطؤ البلمرة السقالة، مما أدى إلى تكوين الغضاريف غير متجانسة بعد 2،3 الثقافة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنشاء منصة Bioprinting

واستند التعديل الطابعة على طابعة HP Deskjet 500 الحرارية طابعة نافثة للحبر وHP 51626A خرطوشة الحبر الأسود.

  1. إزالة الغطاء البلاستيك العلوي من الطابعة وفصل بعناية لوحة التحكم من الغطاء.
  2. فصل توصيلات الكابلات 3 بين أعلى جزء الطابعة والقاعدة. إزالة جزء أعلى الطابعة من القاعدة.
  3. على الجزء العلوي الطابعة، وإزالة البلاستيك الصغيرة والاكسسوارات المطاط (نظام تنظيف رأس الطباعة) في الجهة اليمنى تحت خرطوشة الحبر.
  4. إزالة قاعدة درج الورق مع الينابيع.
  5. إزالة لوحة معدنية تغطي شريط التغذية ورقة من البلاستيك.
  6. قطع شريط التغذية ورقة من البلاستيك في موقف عجلة التغذية المتوسطة باستخدام منشار اليد أو غيرها من أدوات القطع.
  7. إزالة العجلات تغذية الورق 2 يتعرض بعد الخطوة السابقة. البلاستيك عجلة من الصعب جدا والإلكترونيةورأى أن تكون مفيدة.
  8. تنظيف الغبار والحطام باستخدام مناديل الهواء والإيثانول المعلبة.
  9. نعلق أعلى جزء الطابعة إلى القاعدة.
  10. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الطابعة تعديل لا يقل عن 2 ساعة في غطاء تدفق الصفحي قبل استخدام.
  11. قطع الغطاء من خرطوشة الحبر 51626A HP باستخدام منشار اليد أو غيرها من أدوات القطع.
  12. إفراغ الحبر وإزالة عامل التصفية التي تغطي الخزان جيدا السفلي من الغضروف.
  13. شطف جيدا باستخدام خرطوشة تشغيل ماء الصنبور.
  14. Ultrasonicate خرطوشة في غير المتأينة (DI) الماء لمدة 10 دقيقة لإزالة الحبر المتبقية.
  15. فحص خرطوشة للتأكد من تمت إزالة جميع الحبر. شطف أو رذاذ خرطوشة تماما مع الايثانول 70٪ لتعقيم، تليها تعقيم المياه DI.
  16. انشاء مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة الإفراط في منصة الطباعة لتوفير القدرة بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد.
  17. قياس كثافة الأشعة فوق البنفسجية في منصة الطباعة باستخدام الأشعة فوق البنفسجيةمتر. ضبط المسافة بين مصباح الأشعة فوق البنفسجية ومنصة الطابعة بحيث كثافة في موضوع الطباعة ما بين 4-8 ميغاواط / سم 2 (حوالي 25 سم من مصباح إلى منصة الطابعة).

2. إعداد Bioink

  1. التوسع أحادي الطبقة خلية غضروفية
    1. لوحة 5 ملايين غضروفية الإنسان في كل T175 الأنسجة قارورة الثقافة للتوسع خلية في Dulbeccos التعديل النسور متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل و 1X البنسلين الستربتوميسين-الجلوتامين (باريس سان جيرمان). خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية مع ترطيب الهواء تحتوي على 5٪ CO 2. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام حتى القارورة هي 85٪ التقاء. استخدام خلايا من نفس الممر.
  2. حل PEGDA في برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 10٪ ث / ضد إضافة photoinitiator I-2959 لتركيز النهائي من 0.05٪ ث / ضد تصفية تعقيم الحل.
  3. تعليق غضروفية الإنسان المثقف في حل PEGDA أعدت في 5 × 10 6 خلية / مل.

3. الأنسجة الغضروف الطباعة

  1. تشغيل الطابعة والكمبيوتر المحمول.
  2. خلق نمط الطباعة دائرة متينة مع 4 مم وقطرها باستخدام Microsoft Word أو أدوبي فوتوشوب.
    1. ضبط الموقف من نمط وتأكد من أنه سيتم طباعة بالضبط في قالب من البلاستيك.
    2. حساب عدد من المطبوعات اللازمة للوصول إلى سمك المطلوب من السقالة. لمدة 4 مم في الارتفاع، ويطلب 220 يطبع لإنشاء سقالة المطلوب.
  3. تحميل bioink في خرطوشة الحبر. تغطية خرطوشة مع رقائق الألومنيوم للحماية من التعرض للأشعة فوق البنفسجية مباشرة أثناء الطباعة.
  4. إرسال أمر طباعة إلى الطابعة. سحب ورقة الاستشعار عند بدء تشغيل الطابعة لطباعة. عملية الطباعة بأكملها ينبغي أن تأخذ أقل من 4 دقائق لالسقالة مع 4 مم وقطرها 4 مم في الارتفاع.
  5. نقل المطبوعة neocartilage إلى 24 لوحة جيدا وإضافة 1.5 مل مستنبت إلى كل بئر.

ق = "jove_title"> 4. بقاء الخلية التقييم في 3D سقالة

  1. احتضان neocartilage المطبوعة في لايف / الميت الجدوى / السمسة الحل تعمل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام.
  2. قطع هيدروجيل خلية لادن في النصف والتقاط صور الفلورسنت من منطقة القطع.
  3. عد حي (الخضراء) والخلايا الميتة (الحمراء) من قبل مراقب أعمى في خمسة الصور التي التقطت بشكل عشوائي. حساب بقاء الخلية عن طريق قسمة عدد من الخلايا الحية من العدد الكلي للخلايا الحية والميتة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان طابعة نافثة للحبر الحرارية قادرة على تعديل الخلايا وترسب السقالة في إنتاجية عالية وبقاء الخلية ممتازة. الجمع مع بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد والحيوية للضوء، وهذه التكنولوجيا قادرة على إصلاح الخلايا والمواد المطبوعة الأخرى إلى مواقع المودعة في البداية. وفقا لخصائص الطابعة النافثة للحبر الحرارية تعديل، وكان القرار 300 نقطة في البوصة الطباعة 2D مع حجم قطرة الحبر واحد من 130 رر. هناك 50 فتحات إطلاق النار في كل رأس الطباعة مع تردد 3.6 كيلو هرتز اطلاق 12،13. وبالتالي لب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا النظام bioprinting 3D مع القدرة بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد يوفر دقة أكبر بكثير من الطباعة أفضل طريقة ذكرت سابقا الطباعة الموضع من العيوب العظمية الغضروفية باستخدام حقنة مقذوف من الجينات الخلوية هيدروجيل 16 في. قرار الطباعة أعلى أمر بالغ الأهمية ولا سيما بالنسبة للغضروف هندسة الأنسجة لاستعادة الغضروف تنظيم منطقتين التشريحية. بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد خلال طبقة تلو طبقة التجمع أمر بالغ الأهمية للحفاظ على ترسب الدقيق للخلايا والسقالات مادة بي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم مصلحة مالية في هذه الدراسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من نيويورك منطقة العاصمة التحالف بحوث غرانت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

توقفت طابعة مجموعة

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نفث الحبر الحرارية HP Deskjet 500Hewlett-PackardC2106a. تم شراؤها تم تجديدها من بائع الإنترنت.
خرطوشة الحبر الأسود HPHewlett-Packard51626a
مصباح الأشعة فوق البنفسجيةUVPB-100AP
مقياس ضوء الأشعة فوق البنفسجيةأدوات عامةUV513AB
Zeiss LSM 510 مجهر المسح الضوئي بالليزرCarl ZeissLSM 510
Dulbeccos النسور المعدلة المتوسطة (DMEM)Mediatech10-013
البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين (PSG)إنفيتروجين10378-016
كاشف تفكك خلايا AccutaseInvitrogenA11105-01
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Invitrogen10010-023
البقاء / السمية الخلوية الحية / الميتةInvitrogenL-3224
بولي (إيثيلين جلايكول) دياكريلات (PEGDA) أنظمةحيوية جليكوسانGS700
Irgacure 2959Ciba Specialty ChemicalsI-2959
الخلايا الغضروفية المفصلية البشريةLonzaCC-2550

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
  2. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
  3. Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
  4. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
  5. Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
  6. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
  7. Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
  8. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
  9. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  10. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
  11. Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
  12. Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
  13. Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
  14. Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
  15. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
  16. Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PEGDA

مقالات ذات صلة