التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية

ملخص

تطوير البروتينات الانصهار biotinylatable لديها العديد من التطبيقات المحتملة في مختلف مجالات البحث العلمي. المؤتلف الهندسة البروتين هو إجراء على التوالي إلى الأمام التي هي فعالة من حيث التكلفة، وتوفير عوائد عالية من البروتينات مصمم خصيصا.

الملخص

وقد استخدمت المؤتلف هندسة البروتينات القولونية (E. كولاي) نظم التعبير عن ما يقرب من 4 عقود، واليوم E. كولاي لا يزال الكائن المضيف الأكثر استخداما على نطاق واسع. مرونة النظام يسمح لإضافة الأنصاف مثل علامة البيوتين (للتفاعل streptavidin) والبروتينات وظيفية أكبر مثل بروتين الفلورية الخضراء أو الكرز الأحمر البروتين. أيضا، وقد مكن دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية مثل chelators أيون الفلز، المجموعات الوظيفية على رد الفعل فقط، تحقيقات الطيفية، والجزيئات نقل التعديلات بعد متعدية التلاعب أفضل من خصائص البروتين وظائف. ونتيجة لهذا الأسلوب يخلق البروتينات الانصهار للتخصيص التي تقدم فائدة كبيرة لمختلف مجالات البحث العلمي. وبشكل أكثر تحديدا، قد أدرجت تسلسل البروتين biotinylatable في العديد من البروتينات المستهدفة بسبب تفاعل عالية تقارب بين البيوتين مع أفيدين وstreptavidin. وقد ساعد هذا في تعزيز بالإضافة إلى ذلك كشف وتنقية البروتينات الموسومة فضلا عن فتح المجال لتطبيقات الثانوية مثل الفرز الخلية. وبالتالي، تظهر جزيئات البيوتين المسمى تأثير متزايد وعلى نطاق واسع في مجالات الطب الحيوي وbioindustrial. لغرض بحثنا قمنا هندسة البروتينات الانصهار المؤتلف البيروكسيديز تحتوي على عامل النمو العصبي (NGF) وsemaphorin3A (SEMA3A) مناطق وظيفية. لقد ذكرت سابقا كيف أن هذه البروتينات الانصهار البيروكسيديز، جنبا إلى جنب مع غيرها من تسلسل البروتين النشط، يمكن المربوطة إلى الحيوية لهندسة الأنسجة وأغراض التجدد. يحدد هذا البروتوكول أساسيات الهندسة biotinylatable البروتينات في نطاق مليغرام، وذلك باستخدام T7 لاك محرض النواقل وE. المضيفين التعبير القولونية، بدءا من التحول لتوسيع نطاق المتابعة وتنقيتها.

المقدمة

البروتينات تغطي مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية التي هي المسؤولة عن العديد من الوظائف البيولوجية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل الأنسجة السليمة والمنظمة. هذه الجزيئات بدء الآلاف من مسارات الإشارات التي تتحكم يصل التنظيم و / أو أسفل تنظيم الجينات والبروتينات الأخرى، والحفاظ على التوازن داخل الجسم البشري. تعطيل بروتين واحد يؤثر هذا على شبكة الإنترنت بأكملها من الإشارات، التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور اضطرابات مدمرة أو الأمراض. هندسة البروتينات الفردية في المختبر يقدم حلا واحدا لمكافحة هذه الآثار الضارة ويوفر بديلا للأدوية جزيء صغير. في عام 1977، وكان الجينات ترميز التسلسل السوماتوستاتين 14 حمض أميني واحد من البروتينية المهندسة الأولى التي تم إنشاؤها باستخدام E. القولونية ^1. بعد فترة وجيزة في عام 1979، تم استنساخ الأنسولين في البلازميد pBR322، حولت، أعرب، وتنقيته ^2. منذ ذلك الحين، توسعت البروتينات المؤتلف نفوذهم لحقول متعددة من الدقةearch مثل المواد الحيوية، تسليم المخدرات، وهندسة الأنسجة، المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، والزراعة، والانزيمات الصناعية والوقود الحيوي وغيرها (للاستعراضات انظر المراجع ^3-8). ويرجع إلى حد كبير إلى براعة أن التقنية تقدم عن طريق إضافة الأنصاف تطبيق معين الكيميائية أو تسلسل البروتين لأغراض بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، وتحديد البروتين الهدف وتحقيق الاستقرار وتنقية هذا.

عبر تقنية الحمض النووي المؤتلف، والبروتينات المؤتلف يمكن التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنظمة المضيف حقيقية النواة وبدائية النواة بما فيها الثدييات، النباتات، الحشرات، الخميرة، والفطريات، أو البكتيريا. يقدم كل مضيف مزايا مختلفة وعادة ما يتم تحديد أفضل نظام قائم على وظيفة البروتين، والغلة، والاستقرار، والتكلفة الإجمالية، وتطويره. وغالبا ما تفتقر خلايا البكتيريا آليات التعديل بعد متعدية التي توفر المضيفين حقيقية النواة (أي ارتباط بالغليكوزيل، ثاني كبريتيد سد، ه ح.) ^5. ونتيجة لذلك، تؤدي أنظمة الثدييات والحشرات عادة في أفضل التوافق والتعبير عن البروتينات حقيقية النواة، ولكن هذه المضيفين وعادة ما تكون أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا ^9. لذا، E. القولونية هو المضيف يفضل لنظام التعبير لدينا لأن الخلايا التوسع بسرعة في ظروف النمو غير مكلفة وآليات التعبير الجيني مفهومة جيدا ^5،9. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام من السهل أن حجم المتابعة لأغراض الإنتاج والنتائج في البروتينات وظيفية على الرغم من عدم وجود تعديلات ما بعد متعدية ^10. وE. يتم اختيار سلالة القولونية K12 في هذا البروتوكول لاستنساخ لأن هذه السلالة يقدم عوائد البلازميد ممتازة على أساس الكفاءة التحول عالية. بالإضافة إلى ذلك، E. ويستخدم سلالة القولونية BL21 للتعبير لأن هذه السلالة المضيف يحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 الجين الذي يوفر البروتين التعبير للرقابة والاستقرار ^11.

خيمة "> بعد اختيار المضيف، يجب اتخاذ مزيد من الحذر في اختيار ناقلات التعبير المثالي لتسهيل اختيارها والتحكم التعبير البروتين. توليف البروتينات المؤتلف يبدأ مع تسلسل الحمض النووي المستهدف أن يتم استنساخ بتوجيه من البكتيريا T7 النسخ وإشارات الترجمة، و هو فعل التعبير في الخلايا المضيفة التي تحتوي على نسخ الكروموسومات من الجين T7 الحمض النووي الريبي بوليميراز ^12. هذه النواقل، والمستمدة من pBR322 ناقلات البلازميد (للمراجعة أنظر المرجع ^13)، وتخضع لرقابة مشددة من قبل المروج T7 وضعت في البداية من قبل الدارس وزملاؤه ¹⁴ وتوفير إضافية التحكم من خلال إدراج المشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي وأمريكا اللاتينية والكاريبي كاظمة (lac1) ^15،16. للالمؤتلف هندسة البروتينات، وهذا النظام التعبير يوفر القدرة على تصميم تسلسل الأحماض الأمينية معينة من البروتين المطلوب عن طريق إدخال مختلفة تسلسل الحمض النووي المستهدف أو لإنشاء البروتينات الانصهار تتكون من المجال جنبا إلى جنبق من البروتينات واحدة. بالإضافة إلى ذلك، بعض النواقل سلسلة تشمل الببتيد علامة تعديلات على وضعها على N C أو محطة. لأغراض التصميم لدينا، تمت إضافة الحامض الاميني (صاحب) علامة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لتنقية وأدرج تسلسل biotinylatable 15 الأحماض الأمينية لbiotinylation ^17،18. في هذا البروتوكول البلازميد التي تحتوي على الجينات المقاومة الأمبيسلين، تم اختياره لتحمل لنا الانصهار biotinylatable تسلسل البروتين. يتم التحكم في هذا التعبير ناقلات عبر T7 المروج أمريكا اللاتينية والكاريبي والتي يسببها بسهولة مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).

وتستخدم تعبيرات اختبار (الثقافات على نطاق صغير) لتحديد وجود والذوبان من البروتين المستهدفة، والتي يمكن التعبير عنها في أي شكل قابل للذوبان أو غير قابلة للذوبان في صياغة إجراءات التنقية. وهناك البروتين للذوبان أعرب داخل الخلية البكتيريا الخضوع للطي التلقائي للحفاظ على الهيكل الأصلي لها ^19. عادة الأمبنية مواتية الديناميكا الحرارية. في كثير من الحالات النشاط الأيضي للمضيف لا يفضي إلى البروتين الهدف، ووضع الضغط على النظام الذي يؤدي إلى إنتاج بروتين غير قابلة للذوبان وتشكيل الهيئات إدراج تتألف من المجاميع البروتين غير قابلة للذوبان. وبالتالي فإن البروتين الهدف يبدل طبيعة، جعلها غير نشطة بيولوجيا عموما ^20. يتم تحجيم المتابعة كلا التعبيرين الاختبار، ويتم تحديد إجراءات العزل عن طريق ذوبان البروتين الهدف. مطلوب استعادة الطبيعة إضافية أو طوي ثانية خطوة للبروتينات قابلة للذوبان. البروتينات المؤتلف الناتجة يمكن تنقيته باستخدام مزيد من حجم الاستبعاد اللوني.

في البيت يوفر إنتاج البروتين المؤتلف مزايا التكلفة على المنتجات التجارية منذ ملليغرام من البروتين الهدف يمكن أن تكون معزولة للتر الواحد من الثقافة الرئيسية. معظم المعدات المطلوبة متاحة في مختبر البيولوجية أو الكيميائية التقليدية. الهندسة البروتين يسمح لخلقالبروتينات الانصهار مخصصة مع وظائف المضافة التي ليست دائما متاحة تجاريا. الشكل 1 يصور الإجراءات الرئيسية التي تشارك في البروتينات المؤتلف الهندسة. مع هذا النظام التعبير أنشأنا العديد من البروتينات biotinylatable، مثل انترفيرون غاما، عامل النمو المشتق من الصفيحات، وعظم تخلقية البروتين ^21-23، ولكن سوف نركز على اثنين من البروتينات التي قمنا بتصميم لتوجيهات محوار، NGF (29 كيلو دالتون ) وSEMA3A (91 كيلو دالتون) ¹⁰ (للمراجعة أنظر المرجع ^24). Biotinylation هو أسلوب شائع لتحديد الهوية، وتجميد وعزل البروتينات المسماة باستخدام المعروفة البيوتين streptavidin التفاعل ^25-27. تحقيقات الفيزيائية الحيوية ^{28،29، 30} أجهزة الاستشعار، ونقاط الكم ³¹ بعض الأمثلة من النظم التي تستخدم تقارب عالية من البيوتين streptavidin اقتران مع _د K بناء على أمر من 10 ^-15 M ^27. وE. الحيوي القولونيةيغاز القصدير، البيرة، يساعد في المرفق التساهمية من البيوتين إلى جانب سلسلة يسين وجدت داخل البيوتين الموسومة تسلسل ^18،32. وقد أنتجت الربط البيوتين على المواد والجزيئات الحيوية تسليم مستمرة من عوامل النمو إلى الخلية لعدة تطبيقات هندسة الأنسجة ^21،33-35. وبالتالي، هندسة هذه البروتينات مصمم خصيصا biotinylatable هو أداة قوية يمكن أن تتجاوز الاهتمامات البحثية متعددة.

البروتوكول

1. تصميم البروتين المستهدف

1. باستخدام المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية موقع (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) الحصول على تسلسل الأمينية للبروتين الهدف مع الأخذ في الاعتبار نوع من الفائدة والمتغيرات أي لصق. تحديد تسلسل الأحماض الأمينية الذي يتوافق مع المنطقة النشطة من الفائدة من البروتين.
   ملاحظة: للحصول على SEMA3A، وقد تم اختيار الأحماض الأمينية 21-747. تم تصميم البروتين الانصهار مع NGF حيث تسلسل barstar، الأحماض الأمينية 1-90، وأضيف إلى الأحماض الأمينية NGF 122-241.
2. إلى N-محطة إضافة تسلسل التالي: علامة 6X-صاحب لتنقية (HHHHHH)، التبغ إحفر الفيروسات (TEV) البروتيني خفض الموقع لإزالة علامة صاحب (ENLYFQG)، البيوتين الموسومة تسلسل لbiotinylation من البروتين في K (GLNDIFEAQKIEWHE) والمفصلي مرنة مع وجود ثغرات من شأنها أن تسمح للغرفة المناسبة البروتين طوي ثانية (EFPKPSTPPGSSGGAP).
   ملاحظة: يمكن لهذه متواليات تختلف اعتمادا على الانصهار البروتوكول الاضافي المطلوبعين.
3. إرسال كاملة تسلسل الأحماض الأمينية لشركة لجين تصميم / الأمثل للأنواع المضيفة المطلوب والتوليف. Subclone في ناقلات من خيار استخدام الموقع BamHI-NOTI استخدام عدة أو من خلال الاستفادة من الخدمات التجارية.

2. صنع لوحات أجار

ملاحظة: من المهم جدا أن جميع المخزونات من المضادات الحيوية، لوحات، ومخازن، الخ يتم تخزينها بشكل صحيح (درجة الحرارة والمدة) وتظل خالية من البروتياز (تعقيمها).

1. تزن من أجار بنحو 1.5٪ بالوزن ومرق استذابة (LB) في 20 جرام / لتر ووضعه في زجاجة وسائل الإعلام الزجاج. زجاجة مل 500 يجعل حوالي 15 لوحات.
2. Volumetrically إضافة الماء عالى النقاء، وتخلط جيدا، والأوتوكلاف.
3. دعونا زجاجة بارد لمسة وإضافة المضادات الحيوية المناسبة. تجنب التصلب المبكرة للأجار، ولكن إذا زجاجة يبرد كثيرا والحل يبدأ تحجر، يسخن في الميكروويف.
   ملاحظة: لدينا البلازميد يحتوي على المقاومة الأمبيسلين جنراله. لذلك، يجب أن يحتوي على جميع الخطوات الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل. وE. كولاي سلالة الاستنساخ K12 يتطلب التتراسيكلين (12.5 ميكروغرام / مل) للمضادات الحيوية. BL21 خلايا البكتيريا لا تحتاج إلى أي مضاد حيوي إضافية.
4. صب 25-30 مل من محلول إلى 90 ملم أطباق بتري وإتاحة الوقت لتجف.
5. طبق التسمية مع المضادات الحيوية المناسبة وتخزين رأسا على عقب في 4 درجات مئوية، مع parafilm أو في كيس الأغلاق.
   ملاحظة: لوحات جيدة لمدة شهر واحد.

3. الاستنساخ من البيوتين معلم البلازميد

ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.

1. تدور باستمرار ناقلات البلازميد في 6،000 x ج لمدة 3 دقائق لبيليه، وإضافة 10 ميكرولتر من تعقيم الماء عالى النقاء.
2. إزالة 50 ميكرولتر من E. المختصة كيميائيا الخلايا عالية الكفاءة التحول القولونية من -80 درجة مئوية، وعلى الفور وضع على الجليد لمدة 5-10 دقيقة.
3. إضافة 1 ميكرولتر من الحل في ناقلات 0.5-1 ng/50خلايا لتر إلى 50 ميكرولتر هاء؛ 56 القولونية الخلايا ووضع البلازميد المتبقية في -80 درجة مئوية.
4. وضع خلايا البكتيريا التي تحتوي على ناقلات على الجليد لمدة 5 دقائق.
5. الصدمة الحرارية الخلية وخليط ناقلات لل30-45 ثانية في 42 ° C حمام الماء ومكان الخلايا مرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة.
6. إضافة 250 ميكرولتر من مرق السوبر الأمثل مع القمع مقيضة (SOC) المتوسطة (2٪ ث / ت bacto-تريبتون، 0.5٪ ث / ت استخراج bacto-الخميرة، 8.56 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 20 ملي MgSO ₄ و 20 ملي الجلوكوز والماء عالى النقاء؛ درجة الحموضة = 7.0) ويهز في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: SOC لا ينبغي تعقيمها ولكن يتم تصفية تعقيمها من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
7. لوحات الجافة 10-15 دقيقة قبل خلايا الطلاء.
8. ماصة 25، 50، و 100 ميكرولتر من محلول الخلية على لوحات أجار منفصلة تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والتتراسيكلين (12.5 ميكروغرام / مل) المضادات الحيوية. استخدام الخرز الزجاجي لتوزيع حل بالتساوي على لوحات أجار.
<لى> احتضان لوحات رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة 15-18 ساعة.
9. التحقق من وجود البكتيريا الفردية مستعمرات صغيرة على لوحات وتخزين رأسا على عقب في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى (الشكل 2A).
   1. إذا لم يكن هناك مستعمرات موجودة:
      1. تحقق نضارة والعقم من مخازن واللوازم.
      2. زيادة كمية البلازميد يضاف إلى E. القولونية K12 السلالة.
   2. إذا مستعمرات كبيرة موجودة أو أن هناك فرط نمو المستعمرات (الشكل 2B و 2C)، restreak لوحة آغار جديدة باستخدام حلقة التلقيح المعقمة أو خلايا لوحة في انخفاض حجم.
10. تطعيم 5 مل تحتوي على LB الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والتتراسيكلين (12.5 ميكروغرام / مل) مع المضادات الحيوية مستعمرة واحدة تحولت من E. الخلايا القولونية. تنمو الخلايا المتابعة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 250-300 دورة في الدقيقة.
11. في اليوم التالي، استخدم عدة البلازميد العزلة من أجل عزل ناقلات الهدف من غرو بين عشية وضحاهاث اب ومخزن تنقية البلازميد في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    1. اختياري: التحقق نقاء وتركيز البلازميد باستخدام القراءة الامتصاصية التي تم الحصول عليها في 260 و 280 نانومتر.

4. التحول من البلازميد في التعبير المضيف

ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.

1. كرر الخطوات 3،2-3،10 للE. الخلايا القولونية BL21 مع التغييرات التالية:
   ملاحظة: خلايا BL21 لا تتطلب أي إضافية المضادات الحيوية، وبالتالي الأمبيسلين فقط يضاف إلى لوحات أجار للتحول.
   1. إضافة 2-5 ميكرولتر من البلازميد المعزولة في 0.5-2 ng/50 الخلايا ميكرولتر من الخطوة 3،12 حتي 50 ميكرولتر E. الخلايا المضيفة التعبير القولونية.
   2. خلايا الصدمة الحرارية ل60-90 ثانية.
   3. يهز محلول يحتوي على SOC المتوسطة في 250 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة بدلا من 30 دقيقة.
2. نتف مستعمرة واحدة من خلايا البكتيريا تحولت من طبق بيتري مع ستيرإيل قضيب عصا وضعها في أنبوب اختبار يحتوي على 5 مل مرق LB مع التركيز المناسب من الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل).
3. وضع أنابيب الاختبار في شاكر بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 250 دورة في الدقيقة.
4. في صباح اليوم التالي، واتخاذ 200 ميكرولتر من ليلة وضحاها تنمو المتابعة وإضافته إلى 5 مل تحتوي على LB الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل.
5. تجميد أسفل الخلايا المتبقية مع 250 ميكرولتر 50٪ الجلسرين (العقيمة) إلى 750 ميكرولتر الثقافة والحفاظ في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن أن يتم التعبير اختبار جديد وإجراءات التصعيد باستخدام قضيب عصا العقيمة للحصول على تجريف الخلايا المجمدة وبتلقيح LB مع المضادات الحيوية المناسبة.
6. وضع أنبوب اختبار في شاكر في 250-300 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية حتى يتم قياس الكثافة الضوئية (OD) بين 0.7-0.8 في لالامتصاصية 600 نانومتر.
7. لحث الخلايا مع IPTG في تركيز النهائي من 1 ملم.
8. يهز ل4 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في 300 دورة في الدقيقة. بدلا من ذلك يمكن خلايا أيضاتتزعزع بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية في 250-300 دورة في الدقيقة. هذا يمكن أن يؤدي إلى عائدات أعلى من البلازميد اعتمادا على البروتين الهدف.
9. الصوديوم كبريتات دوديسيل بولي أكريلاميد جل الكهربائي (SDS-PAGE) تحليل اختبار التعبير
   1. تأخذ 500 ميكرولتر من الثقافة والمكان في أنبوب 1.5 مل. تدور باستمرار في 13-15 x ج لمدة 5 دقائق. صب قبالة السائل طاف وتسمية "القابلة للذوبان". بيليه resuspend مع vortexing لفي 200 ميكرولتر من صبغ التحميل (50 ميكرولتر 2 المركابتويثانول، 950 ميكرولتر عينة Laemmli عازلة).
      ملاحظة: سيتم استخدام البكتيريا القابلة للذوبان الكريات لتحديد ما إذا كان البروتين المؤتلف في المناطق هيولي من خلايا البكتيريا. ويمكن تخزين الكريات في -80 درجة مئوية دون تحميل صبغ لحين الحاجة إليها. ثقافة البكتيريا التحكم التي لم يتم تحويلها أو التي يسببها يمكن أن تعامل على أنها قابلة للذوبان وكذلك للمقارنة.
   2. تأخذ 1،000 ميكرولتر من الثقافة والمكان في أنبوب 1.5 مل. تدور باستمرار في 13-15 x ج لمدة 5 دقائق.صب قبالة السائل طاف وتسمية "غير القابلة للذوبان".
      ملاحظة: سوف تخضع لإجراءات غير القابلة للذوبان الكريات تمسخ أدناه من أجل الإفراج عن البروتينات الموجودة في الهيئات إدراج خلايا البكتيريا. ويمكن تخزين الكريات في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. ثقافة البكتيريا التحكم التي لم يتم تحويلها أو التي يسببها يمكن أن تعامل على أنها غير قابلة للذوبان وكذلك للمقارنة.
      1. resuspend الكرية غير قابلة للذوبان في 200 ميكرولتر Bugbuster وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      2. تدور باستمرار العينة مرة أخرى في 13-15 x ج لمدة 5 دقائق وتأخذ 50 ميكرولتر من طاف وإضافته إلى الجديد "غير قابل للذوبان" 1.5 مل أنبوب.
      3. ثم إضافة 50 ميكرولتر من صبغ التحميل لهذه العينة الجديدة.
   3. تغلي عينات للذوبان وغير القابلة للذوبان على حد سواء لمدة 5 دقائق لتفسد البروتينات لتحليل SDS-PAGE.
   4. تحميل كل عينة إلى هلام الكهربائي مع سلم القياسية.
   5. من أجل تصور استخدام عينات البروتين staininز كاشف واتبع بروتوكول الشركة.
   6. تحديد ما إذا كان البروتين يعبر في الكسور للذوبان و / أو غير قابلة للذوبان عن طريق مقارنة هذه الممرات اثنين وكذلك المقارنة بين الممرات لمراقبة الممرات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان (انظر الملاحظة 4.9.1 و4.9.2) على هلام SDS-PAGE (الشكل 2). يجب أن تظهر الفرقة الداكنة حول الوزن الجزيئي للبروتين في الممرات للذوبان أو غير قابلة للذوبان. هذا وسوف يحدد الإجراء الذي عزل لاستخدامها في البروتوكول 6.
      ملاحظة: إذا كان هناك عصابة في كل من هذه المناطق من العزلة إما المستخدمة في بروتوكول 6 أدناه يمكن أن يؤديها، أو البروتين يمكن أن تكون معزولة في كلا الاتجاهين من أجل تحديد الطريقة التي تنتج العزلة عائدات أعلى من البروتين المؤتلف (الشكل 3) .
   7. إذا تم إجراء 4 ساعة وبين عشية وضحاها الاستقراء، وتحديد الطريقة التي التعريفي لديها أعلى إنتاج البروتين لنطاق المتابعة العملية (الشكل 2).

5. نطاق المتابعة الإجرائية والثقافة الرئيسية

1. إعداد وسائط النمو مع 85.7 غرام من رائع مرق و 28.8 مل من الجلسرين 50٪ في 1.8 L من الماء عالى النقاء والتعقيم في دورة السائل لمدة 1 ساعة.
2. بدء الثقافة بين عشية وضحاها من الأسهم المجمدة الخلية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.5.
   ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.
   1. خلط 20 مل من LB ومع تركيز النهائي من الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل في العقيمة 125 مل دورق مخروطي سعة.
   2. باستخدام قضيب عصا معقمة اتخاذ الغاء تحولت E. القولونية الخلايا وانخفاض قضيب في قارورة. إزالة عصا قضيب والمكونات سدادة قارورة مع رغوة أو القطن، وتغطي مع رقائق الألومنيوم للحفاظ على العقم.
   3. بين عشية وضحاها يهز في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. الثقافة الرئيسية
   ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.
   1. صب الثقافة بين عشية وضحاها إلى 1.8 لتر من وسائط النمو العقيمة وإضافة الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل و 6-8 قطرات من مضاد الرغوة العقيمة 204 باستخدام ماصة باستور.
   2. الثقافات المكان في 37 ° C حمام الماء مع 0.2 ملم تصفيتها ضغط الهواء محتدما في الثقافات من خلال الحجارة التهوية.
   3. مرة واحدة تصل إلى 0.7-0.8 _{ل 600Nm} OD، لحث مع IPTG (1 ملم) والسماح لتحريض تحدث إما 4 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية تبعا للذوبان / النتائج غير قابلة للذوبان من SDS-PAGE في الخطوة 4.9.
4. جمع E. خلايا القولونية
   1. تدور باستمرار ثقافة خلية في 1 زجاجات L الطرد المركزي (2 زجاجات / ثقافة) لمدة 15 دقيقة في 14،000 XG في 4 درجات مئوية.
   2. تخلصي من طاف وباستخدام ملعقة رقيقة، مغرفة البكتيريا بيليه في 50 مل أنابيب اثنين. الخلايا يمكن مكعبات بواسطة الطرد المركزي مرة أخرى لبضع دقائق.
      ملاحظة: كل ثقافة 1.8 لتر ينتج في اثنين من البكتيريا والكريات، واحد في كل 50 مل أنبوب الطرد المركزي.
   3. مخزن الكريات في -80 مئوية حتى البروتين العزلة.

6. العزلة وتنقية البروتين المؤتلف

ملاحظة: إذا كان موجودا في البروتين في المنطقة القابلة للذوبان التي تستند إلى تحليل SDS-PAGE من الخطوة 4.9 ثم سيتم استخدام "عزل الأم"، ولكن للبروتينات قابلة للذوبان إجراءات "العزل غير مواطن" سوف يتم تنفيذها.

1. تحلل الخلية
   1. غير مواطن
      1. إزالة حولت E. القولونية بيليه من الفريزر -80 درجة مئوية، وإضافة 20 مل تحلل / غسل العازلة (الجدول 1) إلى كل أنبوب الطرد المركزي.
      2. دوامة ويهز بيليه المجمدة حتى يذوب وsolubilizes في حل العازلة دون أي قطع كبيرة. احتضان على nutator بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، يجب أن يكون بيليه الآن الطين اللزج ويرجع ذلك إلى تغيير طبيعة البروتين من المخزن المؤقت.
      3. أجهزة الطرد المركزي في الطين 20،500 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد لعزل وتجاهل بيليه.
   الأم
   1. الحصول تحولت E. بيليه القولونية من الفريزر -80 درجة مئوية.
   2. إضافة الاحتياطي تحلل (الجدول 1) إلى أنبوب الطرد المركزي للوصول إلى الحجم النهائي من 30 مل، وطرد بيليه المجمدة من قبل vortexing وتهتز بصرامة. وضع بيليه على الجليد.
   3. غسل sonicator التحقيق مع 70٪ من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1-2 دقيقة السعة. ثم كرر مع الماء عالى النقاء.
   4. البكتيريا يصوتن بيليه في حين على الجليد لمدة 5 دقائق (مجموع الوقت المنقضي من 10 دقيقة).
      1. تعيين sonicator في 30٪ السعة مع نبض 30 ثانية on/30 ثانية قبالة.
      2. بوب أنبوب الطرد المركزي صعودا وهبوطا خلال الفترة الفاصلة صوتنة من أجل كسر تماما حتى بيليه الخلية. في نهاية مجموع الوقت المنقضي ينبغي ألا يكون هناك البكتيريا مرئية بيليه ترك مفتول العضلات، الطين اللزج.
      3. تنظيف التحقيق sonicator بين العزلة البروتين المختلفة وكذلك لتخزين باستخدام الايثانول 70٪ والماء عالى النقاء كما هو موضح في الخطوة 6.1.2.3.
   5. أجهزة الطرد المركزي في الطين 20،500 XG في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد لعزل وتجاهل بيليه.
2. ني NTA الانجذاب اللوني
   1. غير مواطن
      1. إضافة 1 مل ني ^{2 +-NTA} الراتنج حل لكل أنبوب الطرد المركزي (2 مل مجموع الراتنج للثقافة 1.8 L)، واحتضان على RT لمدة 1 ساعة على الأقل على nutator.
      2. صب الطين في عمود النسب، والسماح حل لبالتنقيط من خلال صمام محبس تماما في دورق النفايات.
      3. تنفيذ 10 يغسل مع 10 مل من تحلل / غسل العازلة للكل غسل.
         1. ليغسل الأولين، إضافة إلى 10 مل أنبوب الطرد المركزي لإزالة الراتنج إضافية ثم تصب في العمود. يمكن إضافة يغسل إضافية مباشرة إلى العمود.
         2. بعد كل غسل، وإثارة الراتنج مع قضيب الزجاج التحريك. ، يمكن إضافة 10 مل القادم مرة واحدة تقطر غسل في دورق النفايات.
      4. بعد غسل تماما دكتورالمتكامله من خلال صمام محبس وثيق، وإزالة النفايات الكأس واستبدالها مع 50 مل أنبوب الطرد المركزي لجمع البروتين.
      5. إضافة 15 مل من شطف العازلة (الجدول 1) ويحرك المتابعة الراتنج، مما يتيح حل للجلوس لمدة 5 دقائق. فتح صمام محبس وشطف جمع. أكرر مرة أخرى مع 15 مل إضافية.
   2. محلي
      1. اتبع غير مواطن تقارب اللوني أعلاه (خطوات 6.2.1.1-6.2.1.4) باستثناء ضبط المعلمات التالية:
         1. احتضان ني ^{2 +-NTA} الراتنج الحل في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل على nutator.
         2. استخدام الاحتياطي اغسل المناسبة (الجدول 1).
      2. إضافة 5 مل من شطف العازلة (الجدول 1)، واحتضان مع الراتنج لمدة 5 دقائق.
         1. وقد مقطر مفتوحة صمام محبس وجمع شطف حتى أكثر من الحل من خلال.
         2. إضافة 90 ميكرولتر / جيد برادفورد كاشف لمسح وحة 96 جيدا. بعد كل شطف سماح 10 ميكرولتر من ذلكlution أن يتقطر من العمود إلى جيدا تحتوي على 90 ميكرولتر كاشف برادفورد.
         3. متابعة إضافة 5 مل شطف العازلة في كل مرة إلى برادفورد مقايسة لم يعد بالكشف عن البروتين (اللون الأزرق الداكن غني عن لضوء أزرق لمسح). هذا عادة ما يستغرق 4-5 كميات شطف.
3. غسيل الكلى / الإعادة الى الوضع السابق
   1. جعل غير الأصليين (استعادة الطبيعة) ومخازن غسيل الكلى الأصلي (الجدول 1) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم تحديد الرقم الهيدروجيني للمخازن غسيل الكلى من البروتين الهدف نقطة تساوي الكهربية (PI). كما يجب مخزنة قاعدة الإبهام من البروتينات واحدة على الأقل نقطة كاملة أعلاه أو أدناه القيم متزمت بهم.
   2. نقل elutions الأصلي وغير الأصليين لغسيل الكلى أنابيب مع قطع مناسبة الوزن الجزيئي (25،000 MWCO لNGF و50،000 MWCO لSEMA3A). وضع كل عينة البروتين في غسيل الكلى العازلة منها 1 لمدة 4 ساعة في 4 درجات مئوية ومن ثم استبدال العازلة منها أكثر من 2ليلة في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يحتاج بروتين أن مدال في كل العازلة لمدة 4 ساعة على الأقل لطوي ثانية السليم وتبادل العازلة لتأخذ مكان.
   3. تركيز البروتين مدال elutions إلى أقل من 5 مل باستخدام مركزات تدور أجهزة الطرد المركزي.
      ملاحظة: يمكن أن تزيد من البروتينات يمكن تنقيته باستخدام سريع البروتين السائل اللوني (FPLC) وتتركز مرة أخرى.
4. تحديد تركيز البروتين (ملغ / مل) من خلال تجميد تجفيف عينة 10-50 مل في أنبوب microcentrifuge preweighed.
   1. اختياري: تحديد معامل الانقراض، ε، لذلك يمكن تحديد أن تركيز البروتين في العزلة المستقبل عن طريق قياس الامتصاصية لعينة في 280 نانومتر باستخدام قانون بير لامبرت في: C = A _280nm / εl، حيث l هو طول المسار.

7. Biotinylation من البروتين النقي

1. Dialyze البروتينات في 10،000 MWCO أشرطة غسيل الكلى AGainst 10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني = 8.0)، وتغيير المخزن المؤقت كل ساعة 4 مع ما مجموعه 6 تغييرات.
2. نقل البروتينات المؤتلف (الآن في 10 ملي تريس العازلة) إلى 2 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة لbiotinylation.
3. البروتينات Biotinylate باستخدام يغاز عدة البروتين البيوتين.
4. Dialyze البروتينات ضد برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4) باستخدام 10،000 MWCO أشرطة غسيل الكلى مع 3 العازلة يتغير يوميا لمدة 2 ايام.
5. تحديد biotinylation في المئة من البروتينات باستخدام عدة الكميات.
6. تحديد تركيز مرة أخرى كما هو موضح في 6.4 وتخزينها في 4 درجة مئوية أو قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

النتائج

الاستنساخ واختبار التعبير

عندما يتم تنفيذ الطلاء بشكل صحيح، يجب مستعمرات معزولة واحد تشكيل لزيادة فرص نتف البكتيريا الخلايا تحولت نسيلي (الشكل 2A). ومع ذلك، إذا ومطلي عدد كبير جدا من الخلايا، يتم تحضين لوحات طويلة جدا عند 37 درجة مئوية أو التحول هو مشكوك فيه، المستعمرات قد تغطي لوحة أجار أو تشكيل مجاميع أكبر من الخلايا (أرقام 2B و 2C). أثناء اختب...

المناقشة

المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية قوية جدا التي تمتد العديد من التخصصات. أنها فعالة من حيث التكلفة، والانضباطي إجراء بسيط نسبيا، مما يسمح إنتاج غلة عالية من البروتينات مصمم خصيصا. من المهم أن نلاحظ أن تصميم والتعبير عن البروتينات المستهدفة ليست دائما واضحة. التعبير القاعدية والاستقرار البروتين المؤتلف تعتمد على الخيارات المحددة للناقلات، E. سلالات القولونية الخلية، الببتيد علامة الاضافات والمعلمات زراعة. يستخدم لدينا معايير التصميم المحددة E. راسخة ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1،4-Dithio-DL-threitol ، DTT ، 99.5٪	Chem-Impex International	127	100 جم
2-هيدروكسي إيثيل ميركابتان بيتا ؛ -Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 مل
حمض الخليك ، EMD الجليدي		AX0073-9	2.5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 جم
ملح الصوديوم أمبيسلين   ؛	سيجما ألدريتش	A9518	25 جرام
مضاد للرغوة 204	سيجما ألدريتش	A6426	500 جرام
بارستار-NGF بي تي -21 أ (+)	GenScript USA Inc.		4 ومايكرو. ز
BL21 (DE3) الخلايا المختصة	Novagen	69450	1 مل ؛ كاشف إكسبريشن هوست
برادفورد	سيجما ألدريتش	B6916	500 مل
BugBuster	Novagen	70922-3	100 مل
معيار ترشيح جل	Bio-Rad	151-1901	6 قوارير
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride أميوفورماميدين هيدروكلوريد	Chem-Impex International	152	1 كجم
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 مل
حمض الهيدروكلوريك	EMD	HX0603-3	2.5 لتر
إيميدازول   ؛	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli عينة عازلة	Bio-Rad	161-0737	30 مل
الصوديوم كبريتات اللوريل ، سطح دوديسيل الصوديوم	Chem-Impex International	270	500 جم
مرق LB   ؛	سيجما ألدريتش	L3022	1 كجم
NovaBlue Competence Cells	Novagen	69825	1 مل ؛ استنساخ
فوسفات المضيف المحلول الملحي المخزن	سيجما-ألدريتش	P5368-10PAK	10 عبوة
كلوريد البوتاسيوم	Chem-Impex International	01247	1 كجم
Sema3A-pET-21a (+)	GenScript USA Inc.		4 ومايكرو. ز
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 لتر
كلوريد الصوديوم	سيجما ألدريتش	S5886-1KG	1 كجم
هيدروكسيد الصوديوم	فيشر Scientific	S318-500	500 جم
فوسفات الصوديوم دياباسيك	سيجما ألدريتش	S5136-500G	500 جم
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة	سيجما ألدريتش	S5011 500	جم
مرق رائع	Bioshop	TER409.5	5 كجم
التتراسيكلين هيدروكلوريد	Chem-Impex International	667	25 جم
Tris / Glycine / SDS Buffer ، 10x	Bio-Rad	1610732	1 لتر
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 كجم
التربتون ، البنكرياس	EMD	1.07213.1000	1 كجم
مستخلص الخميرة ، محبب	EMD	1.03753.0500	500 جم
& nbsp ؛ Ä KTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	يتضمن مجموعات وملحقات
منضدة شاكر مداري	حراري	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	يأتي إنزيم مع مخازن تفاعلية ومحلول بيوتين
كاسيت غسيل	الكلى Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (قوة إضافية)
غسيل	الكلىمختبرات الطيف	132127 ، 132129	MWCO: 25,000 و 50,000
صمام تحويل التدفق FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Measurement Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Rack ، Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	يتضمن مجموعات وملحقات
جهاز تدوير ساخن / مبرد   ؛	VWR	13271-102	موديل 1156D
فرن تسخين FD Series	الموثق		نموذج FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	توقف - المنتج البديل: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti جهاز طرد مركزي	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 الدوار	بيكمان كولتر	363055
JLA 8.1 الدوار	بيكمان كولتر	969329	يتضمن زجاجات بولي بوربيلين سعة 1 لتر
JS 5.3 الدوار	بيكمان كولتر	368690
التدفق الصفحي	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical نظام الرحلان الكهربائي
Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب	Bio-Rad	456-9036	أي كيلو دالتون ، مشط 15 بئر
Ni-NTA العمود	Bio-Rad	737-2512	49 مل   ؛ حجم ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 فولت ، 3 أمبير ، 300 واط
أنابيب البولي بروبيلين المشتركة القاع المستديرة	VWR	3119-0050	50 مل & nbsp ؛ أنابيب ل JA 25.50 الدوار
Spin-X UF المكثفات	Corning	431488 ، 431483	؛ 20 و 6 مل ؛ MWCO: 10,000 Da
خدمة الاستنساخ الفرعي	GenScript USA Inc.		خدمات البروتين
معالج الموجات فوق الصوتية	كول بارمر	18910445A	موديل CV18
Vortex-Genie 2	صناعات علمية	SI-0236	موديل G560