تطوير البروتينات الانصهار biotinylatable لديها العديد من التطبيقات المحتملة في مختلف مجالات البحث العلمي. المؤتلف الهندسة البروتين هو إجراء على التوالي إلى الأمام التي هي فعالة من حيث التكلفة، وتوفير عوائد عالية من البروتينات مصمم خصيصا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد استخدمت المؤتلف هندسة البروتينات القولونية (E. كولاي) نظم التعبير عن ما يقرب من 4 عقود، واليوم E. كولاي لا يزال الكائن المضيف الأكثر استخداما على نطاق واسع. مرونة النظام يسمح لإضافة الأنصاف مثل علامة البيوتين (للتفاعل streptavidin) والبروتينات وظيفية أكبر مثل بروتين الفلورية الخضراء أو الكرز الأحمر البروتين. أيضا، وقد مكن دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية مثل chelators أيون الفلز، المجموعات الوظيفية على رد الفعل فقط، تحقيقات الطيفية، والجزيئات نقل التعديلات بعد متعدية التلاعب أفضل من خصائص البروتين وظائف. ونتيجة لهذا الأسلوب يخلق البروتينات الانصهار للتخصيص التي تقدم فائدة كبيرة لمختلف مجالات البحث العلمي. وبشكل أكثر تحديدا، قد أدرجت تسلسل البروتين biotinylatable في العديد من البروتينات المستهدفة بسبب تفاعل عالية تقارب بين البيوتين مع أفيدين وstreptavidin. وقد ساعد هذا في تعزيز بالإضافة إلى ذلك كشف وتنقية البروتينات الموسومة فضلا عن فتح المجال لتطبيقات الثانوية مثل الفرز الخلية. وبالتالي، تظهر جزيئات البيوتين المسمى تأثير متزايد وعلى نطاق واسع في مجالات الطب الحيوي وbioindustrial. لغرض بحثنا قمنا هندسة البروتينات الانصهار المؤتلف البيروكسيديز تحتوي على عامل النمو العصبي (NGF) وsemaphorin3A (SEMA3A) مناطق وظيفية. لقد ذكرت سابقا كيف أن هذه البروتينات الانصهار البيروكسيديز، جنبا إلى جنب مع غيرها من تسلسل البروتين النشط، يمكن المربوطة إلى الحيوية لهندسة الأنسجة وأغراض التجدد. يحدد هذا البروتوكول أساسيات الهندسة biotinylatable البروتينات في نطاق مليغرام، وذلك باستخدام T7 لاك محرض النواقل وE. المضيفين التعبير القولونية، بدءا من التحول لتوسيع نطاق المتابعة وتنقيتها.
المقدمة
البروتينات تغطي مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية التي هي المسؤولة عن العديد من الوظائف البيولوجية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل الأنسجة السليمة والمنظمة. هذه الجزيئات بدء الآلاف من مسارات الإشارات التي تتحكم يصل التنظيم و / أو أسفل تنظيم الجينات والبروتينات الأخرى، والحفاظ على التوازن داخل الجسم البشري. تعطيل بروتين واحد يؤثر هذا على شبكة الإنترنت بأكملها من الإشارات، التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور اضطرابات مدمرة أو الأمراض. هندسة البروتينات الفردية في المختبر يقدم حلا واحدا لمكافحة هذه الآثار الضارة ويوفر بديلا للأدوية جزيء صغير. في عام 1977، وكان الجينات ترميز التسلسل السوماتوستاتين 14 حمض أميني واحد من البروتينية المهندسة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصميم البروتين المستهدف
- باستخدام المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية موقع (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) الحصول على تسلسل الأمينية للبروتين الهدف مع الأخذ في الاعتبار نوع من الفائدة والمتغيرات أي لصق. تحديد تسلسل الأحماض الأمينية الذي يتوافق مع المنطقة النشطة من الفائدة من البروتين.
ملاحظة: للحصول على SEMA3A، وقد تم اختيار الأحماض الأمينية 21-747. تم تصميم البروتين الانصهار مع NGF حيث تسلسل barstar، الأحماض الأمينية 1-90، وأضيف إلى الأحماض الأمينية NGF 122-241.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الاستنساخ واختبار التعبير
عندما يتم تنفيذ الطلاء بشكل صحيح، يجب مستعمرات معزولة واحد تشكيل لزيادة فرص نتف البكتيريا الخلايا تحولت نسيلي (الشكل 2A). ومع ذلك، إذا ومطلي عدد كبير جدا من الخلايا، يتم تحضين لوحات طويلة جدا عند 37 درجة مئوية أو التحول هو مشكوك فيه، المستعمرات قد تغطي لوحة أجار أو تشكيل مجاميع أكبر من الخلايا (أرقام 2B و 2C). أثنا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية قوية جدا التي تمتد العديد من التخصصات. أنها فعالة من حيث التكلفة، والانضباطي إجراء بسيط نسبيا، مما يسمح إنتاج غلة عالية من البروتينات مصمم خصيصا. من المهم أن نلاحظ أن تصميم والتعبير عن البروتينات المستهدفة ليست دائما واضحة. التعبير القاعدية والاستقرار البروتين المؤتلف تعتمد على الخيارات المحددة للناقلات، E. سلالات القولونية الخلية، الببتيد علامة الاضافات والمعلمات زراعة. يستخدم لدينا معايير التصميم المحددة E. راسخة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه جامعة أكرون لتمويل التي دعمت هذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1،4-Dithio-DL-threitol ، DTT ، 99.5٪ | Chem-Impex International | 127 | 100 جم |
| 2-هيدروكسي إيثيل ميركابتان بيتا ؛ -Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 مل |
| حمض الخليك ، EMD الجليدي | AX0073-9 | 2.5 L | |
| Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 جم |
| ملح الصوديوم أمبيسلين ؛ | سيجما ألدريتش | A9518 | 25 جرام |
| مضاد للرغوة 204 | سيجما ألدريتش | A6426 | 500 جرام |
| بارستار-NGF بي تي -21 أ (+) | GenScript USA Inc. | 4 ومايكرو. ز | |
| BL21 (DE3) الخلايا المختصة | Novagen | 69450 | 1 مل ؛ كاشف إكسبريشن هوست |
| برادفورد | سيجما ألدريتش | B6916 | 500 مل |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 مل |
| معيار ترشيح جل | Bio-Rad | 151-1901 | 6 قوارير |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Guanidine hydrodioride أميوفورماميدين هيدروكلوريد | Chem-Impex International | 152 | 1 كجم |
| His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 مل |
| حمض الهيدروكلوريك | EMD | HX0603-3 | 2.5 لتر |
| إيميدازول ؛ | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli عينة عازلة | Bio-Rad | 161-0737 | 30 مل |
| الصوديوم كبريتات اللوريل ، سطح دوديسيل الصوديوم | Chem-Impex International | 270 | 500 جم |
| مرق LB ؛ | سيجما ألدريتش | L3022 | 1 كجم |
| NovaBlue Competence Cells | Novagen | 69825 | 1 مل ؛ استنساخ |
| فوسفات المضيف المحلول الملحي المخزن | سيجما-ألدريتش | P5368-10PAK | 10 عبوة |
| كلوريد البوتاسيوم | Chem-Impex International | 01247 | 1 كجم |
| Sema3A-pET-21a (+) | GenScript USA Inc. | 4 ومايكرو. ز | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 لتر |
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S5886-1KG | 1 كجم |
| هيدروكسيد الصوديوم | فيشر Scientific | S318-500 | 500 جم |
| فوسفات الصوديوم دياباسيك | سيجما ألدريتش | S5136-500G | 500 جم |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | سيجما ألدريتش | S5011 500 | جم |
| مرق رائع | Bioshop | TER409.5 | 5 كجم |
| التتراسيكلين هيدروكلوريد | Chem-Impex International | 667 | 25 جم |
| Tris / Glycine / SDS Buffer ، 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1 لتر |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 كجم |
| التربتون ، البنكرياس | EMD | 1.07213.1000 | 1 كجم |
| مستخلص الخميرة ، محبب | EMD | 1.03753.0500 | 500 جم |
| & nbsp ؛ Ä KTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | يتضمن مجموعات وملحقات |
| منضدة شاكر مداري | حراري | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | يأتي إنزيم مع مخازن تفاعلية ومحلول بيوتين |
| كاسيت غسيل | الكلى Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (قوة إضافية) |
| غسيل | الكلىمختبرات الطيف | 132127 ، 132129 | MWCO: 25,000 و 50,000 |
| صمام تحويل التدفق FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter Biotin Measurement Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 Tube Rack ، Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | يتضمن مجموعات وملحقات |
| جهاز تدوير ساخن / مبرد ؛ | VWR | 13271-102 | موديل 1156D |
| فرن تسخين FD Series | الموثق | نموذج FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | توقف - المنتج البديل: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti جهاز طرد مركزي | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 الدوار | بيكمان كولتر | 363055 | |
| JLA 8.1 الدوار | بيكمان كولتر | 969329 | يتضمن زجاجات بولي بوربيلين سعة 1 لتر |
| JS 5.3 الدوار | بيكمان كولتر | 368690 | |
| التدفق الصفحي | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
| Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical نظام الرحلان الكهربائي |
| Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب | Bio-Rad | 456-9036 | أي كيلو دالتون ، مشط 15 بئر |
| Ni-NTA العمود | Bio-Rad | 737-2512 | 49 مل ؛ حجم ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 فولت ، 3 أمبير ، 300 واط |
| أنابيب البولي بروبيلين المشتركة القاع المستديرة | VWR | 3119-0050 | 50 مل & nbsp ؛ أنابيب ل JA 25.50 الدوار |
| Spin-X UF المكثفات | Corning | 431488 ، 431483 | ؛ 20 و 6 مل ؛ MWCO: 10,000 Da |
| خدمة الاستنساخ الفرعي | GenScript USA Inc. | خدمات البروتين | |
| معالج الموجات فوق الصوتية | كول بارمر | 18910445A | موديل CV18 |
| Vortex-Genie 2 | صناعات علمية | SI-0236 | موديل G560 |
المراجع
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
