مقالة منهجية

استخدام كاسباس المتعدد الفحص لتحديد موت الخلايا المبرمج في المهاد الخليوي نموذج

DOI:

10.3791/51305

⸱

أبريل 16, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 4Department of Medicine, University of Minnesota Medical School, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن فحوصات متعددة لتوفير المعلومات المفيدة الآليات الخلوية الأساسية والقضاء على النفايات من الكواشف والتجارب المتكررة التي لا داعي لها. نحن هنا وصف متعددة كاسباس 3/7 النشاط الفحص، وذلك باستخدام أساليب الفلورسنت والقائم على الانارة، لتحديد بقاء الخلية في نموذج طائي في المختبر التالية التحدي التأكسدي مع حمض البالمتيك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على معدد المقايسات في دراسات الآليات الخلوية المعقدة يلغي الحاجة لإجراء التجارب المتكررة، ويوفر الضوابط الداخلية، ويقلل من الهدر في التكاليف والكواشف. نحن هنا وصف تعظيم الاستفادة من مقايسة متعددة لتقييم موت الخلايا المبرمج التالية حمض البالمتيك (PA) التحدي في نموذج طائي في المختبر، وذلك باستخدام كل من الفلورسنت والانارة مقرها المقايسات لقياس عدد خلايا قابلة للحياة وكاسباس 3/7 النشاط في 96 جيدا تنسيق وحة microtiter. بعد التحدي السلطة الفلسطينية، تم تحديد خلايا قابلة للحياة من خلال فحص الفلورسنت القائم على ريسازورين. كان كاسباس 3/7 ثم تحديد النشاط باستخدام الركيزة luminogenic، DEVD، وتطبيع لعدد الخلايا. هذا الاختبار هو مضاعفة تقنية مفيدة لتحديد التغير في النشاط كاسباس بعد التحفيز أفكارك، مثل الأحماض الدهنية المشبعة التحدي. الأحماض الدهنية المشبعة السلطة الفلسطينية يمكن أن تزيد الاكسدة طائي وموت الخلايا المبرمج، مما يدل على إمكانية importaالامتحانات التنافسية الوطنية من المقايسات مثل التي وصفت هنا في دراسة العلاقة بين الأحماض الدهنية المشبعة وظيفة الخلايا العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الوجبات الغذائية الغنية بالأحماض الدهنية المشبعة مثل حمض البالمتيك (PA) ترتبط السمنة والأمراض المصاحبة الأخرى، بما في ذلك أمراض القلب والشرايين والسكري 1 و 2. وقد تبين أيضا الوجبات الغذائية عالية الدهون لزيادة الاكسدة، موت الخلايا المبرمج، وتنكس الخلايا العصبية في منطقة ما تحت المهاد، وهو منظم المهم الشهية والطاقة النفقات 3-7. فهم الآلية التي من خلالها التعرض حمية عالية الدهون يؤدي التقلبات طائي بالتالي، من المهم لتطوير علاجات الدوائية للسمنة. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية من خلالها الدهون الغذائية يؤثر على وظيفة الخلايا العصبية تظل غير واضحة. فهم أفضل لكيفية الدهون مثل السلطة الفلسطينية قد تؤدي ظهور مسارات أفكارك طائي هو خطوة أولى ضرورية نحو هذا الهدف. الهدف من هذه المقالة هو لوصف مقايسة متعددة في المختبر لاختبار استجابة الخلايا العصبية للتعرض للسلطة الفلسطينية، وضعت لاستخدامها في دراسات حتنكس عصبي ypothalamic. نحن نقدم وصفا مفصلا ل96 جيدا شكل فحص في المختبر متعددة لقياس كاسباس 3/7 النشاط في العدد الكلي للخلايا في خلد الماوس الكبار خط متباينة طائي الخلية (المعين A12) بعد التحدي التأكسدي مع السلطة الفلسطينية 8.

لفترة وجيزة، ويتحدد بقاء الخلية التالية تحديا للسلطة الفلسطينية عن طريق فحص ريسازورين القائمة. ريسازورين هو مركب نفاذية الخلية التي يخضع الحد الأنزيمية في خلايا نشطة أيضي، وهي عملية يعتقد أن تحدث عن طريق الميتوكوندريا 9. تحويل خلايا قابلة للحياة باستمرار ريسازورين لresorufin، وتنتج إشارة الفلورسنت يتناسب مع عدد من خلايا قابلة للحياة. ثم يتم تحليل النشاط كاسباس 3/7 باستخدام مقايسة lumogenic مقرها DEVD. DEVD هو تسلسل الأحماض الأمينية (آسيا والمحيط الهادئ، غلو، فال ASP) المشقوق من قبل كاسباس 3. عندما يقترن هذا التسلسل إلى مادة lumogenic، على تفعيل الخلايا كاسباس 3/7 والانقسام اللاحقةمن DEVD الركيزة، يتم تحريرها المنتج الانارة. هذا رد فعل يتناسب مع النشاط كاسباس وبالتالي إلى استحثاث موت الخلايا المبرمج. كما الخلايا الميتة لا يمكن ان تنتج كاسباس، كاسباس 3/7 النشاط هي عابرة الطبيعة؛ ولذلك ينبغي أن يكتمل تحليل ما بين 30 دقيقة إلى 4 ساعات بعد التحدي، وهذا يتوقف على فعالية الضغوطات الخلية. بقاء الخلية يتناسب عكسيا مع نشاط كاسباس 3/7، ويمكن استخدامها لتحديد آليات موت الخلايا. على سبيل المثال، قد سبق استخدام هذا الأسلوب لإظهار أن المعالجة مع هرمون الببتيد أوريكسين يقلل موت الخلايا المبرمج في الخلايا طائي تحدى مع بيروكسيد الهيدروجين، مما يوحي بأن آليات تتأثر بهذا العلاج مهما في حماية ضد الضرر التأكسدي 10. من المهم أن نلاحظ هذه المقايسات والخط والتي تعتمد على الخلايا والأنسجة، كما أنها تعتمد على النشاط الميتوكوندريا للحد من الكواشف مقايسة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للماوس الكبار طائي (A12) الخلايا؛ ومع ذلك،يجوز تغيير الأساليب المذكورة لتدخل ضمن نطاق البحوث مماثلة.

المقايسات المتنوعة من ثقافة واحدة ويوفر أيضا ميزة على الطريقة التقليدية في أداء فحوصات فردية لعدة أسباب. بالإضافة إلى توفير الوقت وعينات الخلايا، والكواشف والثقافة، ويمكن أيضا تقديم المقايسات مضاعفة المعرفة من بقاء الخلية والوفاة، وتوفير الضوابط الداخلية، والقضاء على الحاجة لإجراء التجارب المتكررة 11، 12.

وقد اعتمدت أساليب بديلة على البقع أو ELISAs الغربية، والتي هي فحوصات موثوق بها، ولكنها مكلفة وتستغرق وقتا طويلا (1-2 أيام)، وخاصة عند استخدام تنسيق 96 جيدا. باستثناء الوقت الذي يستغرقه لخلايا الثقافة للمقايسة مضاعفة، مرة إجمالية تبلغ أقل من 3 ساعة. في حين تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع A12 الخلايا، فإنه يجوز تغيير لاستخدامها في نماذج أخرى مع الحفاظ في الاعتبار العوامل التي قد تؤثر على سلامة الخلية. ردعإذا التعدين هذا البروتوكول سيعمل على سلسلة من التجارب يتوقف على عدد من العينات أو الظروف التجريبية والتجارب على المصب المخطط لها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الطلاء والصيانة الثقافة الخليوي

  1. الدافئة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) سائل الإعلام والثقافة (DMEM + 10٪ FBS + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / نيومايسين) إلى 37 درجة مئوية.
  2. الحصول على الأسهم من A12 الخلايا المجمدة من -80 درجة مئوية.
  3. بسرعة ذوبان الجليد الخلايا في 37 درجة مئوية حمام الماء؛ مرة واحدة إذابة، بلطف خلايا ماصة لنقل إلى 75 سم 2 تنفيس قارورة الثقافة وإضافة 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة.
  4. احتضان بين عشية وضحاها في قارورة 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. بعد نضح وسائل الإعلام على مدار 24 ساعة واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة. تستمر الخلايا المتنامية حتى يتم الحصول على 70-80٪ التقاء (النمو 2-3 أيام).

2. العد وطلاء الخلايا

  1. DMEM الدافئة و 1X-التربسين EDTA-حل ل37 درجة مئوية.
  2. وسائل الإعلام نضح من الخلايا ويغسل مرتين مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS).
  3. إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة.
  4. فصلالخلايا من القارورة باستخدام مكشطة وتعليق الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام. تمر الخلايا من خلال مصفاة ويمر عبر مصفاة الخلية في أنبوب 50 مل نظيفة. قد تحتاج لتمرير الخلايا من خلال مصفاة أكثر من مرة، ولكن لا تكرر أكثر من ثلاث مرات.
  5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات لتحديد كمية الخلايا لثقافة البذور 6،000 خلية / جيدا في قاع أسود أو أبيض لوحة الجدران 96 جيدا واضحة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام. احتضان لوحة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

3. تحديد الجدوى الخليوي وكاسباس 3/7 آخر

  1. نقل السلطة إلى معقمة 5 مل قارورة زجاجية وذوبان في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تمييع الأسهم PA 01:10 حل في DMSO وإضافته إلى prewarmed DMEM للحصول على تركيز العمل النهائية من 0.1 ملي السلطة الفلسطينية. لوسائل الإعلام السيطرة، إضافة نفس تركيز DMSO التي يتم إضافتها إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على السلطة الفلسطينية.
  2. إزالة وسائل الإعلام في كل بئر واستبدالها مع وسائل الإعلام 50 ميكرولتر + / -السلطة الفلسطينية. احتضان لوحة لمدة 2 ساعة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. ثم إضافة 5 ميكرولتر كاشف ريسازورين واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. باستخدام قارئ المتعدد صفيحة ميكروسكوبية، سجل مضان (560 EX / 590 م) لقياس بقاء الخلية. يتم عرض النتائج وحدات مضان النسبي (RFU).
  4. لنفس لوحة، وإضافة 55 ميكرولتر من كاشف كاسباس ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  5. مرة أخرى باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية، سجل التلألؤ لقياس النشاط كاسباس 3/7. يتم عرض النتائج وحدات التلألؤ النسبي (RLU)، مع التلألؤ يتناسب طرديا مع كاسباس 3/7 النشاط.
  6. لتطبيع النشاط كاسباس 3/7 إلى عدد خلايا، وتقسيم الخلية الجدوى (RFU) من خلال كاسباس 3/7 النشاط (RLU).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول أعلاه توضح النتائج في مضاعفة تحليلين منفصلين لتحديد آليات موت الخلايا. الشكل 1 يبين لمحة عامة عن بروتوكول لتحديد بقاء الخلية وكاسباس 3/7 النشاط. وزيادة النشاط بشكل ملحوظ كاسباس في الخلايا تحدى مع السلطة الفلسطينية بعد 2 ساعة الحضانة (الشكل 2A والجدول 1). فقدان النزاهة غشاء الخلية هو تغيير المورفولوجية المرتبطة استحثاث موت الخلايا المبرمج، وهي واضحة في الخلايا بعد التعرض 2 ساعة إلى السلطة الفلسطينية (الشكل 2B). الشكل 3 يحد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقايسة متعددة هي تقنية مقبولة تماما التي تم استخدامها من قبل العلماء في العديد من التطبيقات مثل PCR ميكروأرس، مناعي، وغيرها من وسائل الكشف عن البروتين على أساس 13 و 14. في الآونة الأخيرة، وأصبحت تستخدم بشكل متزايد المقايسات مضاعفة في التجارب في المختبر القائم على لوحة ولقد تم التحقق من صحة باعتبارها طريقة دقيقة لتقييم سمية الخلايا وقدرتها على البقاء 12. في البروتوكول أعلاه، علينا أن نظهر فعالية مضاعفة الفلورسنت والانارة فحوصات لتحديد النشاط كاسباس 3/...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم الصراعات في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل الموصوف هنا من قبل وزارة الخارجية الامريكية لشؤون المحاربين القدامى مختبر أبحاث الطب الحيوي والتنمية BX001686-1A1 وVA بحوث التأهيل والتنمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفأر البالغ تحت المهاد خط الخلية mHypoA-1 / 2  شركة Cellutions Biosystems Inc.CLU172
دولبيكو s النسر المعدل s متوسطInvitrogen10313-039
مصل الأبقار الجنين مختبرات PAAA15-751
البنسلين / الستربتومايسينInvitrogen15070-063
حمض البالمتيكسيجما-ألدريتشP0500
دايميثي سلفوكسيد   ؛Sigma-AldrichD2650

كاشف بقاء الخلية PrestoBlue		InvitrogenA13262
Caspase-Glo 3/7 أنظمة الفحصPromegaG8091
96 واط لوحة سفلية بصرية ، بوليسترين أسود ، معالجة ثقافة الخلية ، مع غطاء ،Thermo Fisher Scientific165305
SpectraMax M5 متعددة الأوضاع
أجهزة جزيئية معقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
  2. Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
  3. Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
  4. Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
  5. Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
  6. Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
  7. Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
  8. Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
  9. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  10. Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
  11. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  12. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
  13. Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
  14. Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
  15. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  16. Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
  17. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

3 7 DEVD

مقالات ذات صلة