مقالة منهجية

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

16.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51387

⸱

أبريل 23, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

في هذه المقالة

ملخص

مجمعات البروتين متعدد العناصر تلعب دورا حاسما خلال وظيفة الخلوية والتنمية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل المجمعات البروتين الأصلي من أجنة ذبابة الفاكهة في الجسم الحي بعد يشابك تليها تنقية المجمعات crosslinked لاحقة تحليل هيكل وظيفة.

الملخص

يتم التحكم في العديد من العمليات الخلوية عن طريق المجمعات البروتين multisubunit. كثيرا ما تشكل هذه المجمعات عابر وتتطلب البيئة المحلية لتجميع. لذلك، لتحديد هذه المجمعات البروتين وظيفية، من المهم لتحقيق الاستقرار لهم في الجسم الحي قبل تحلل الخلايا وتنقية لاحقة. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل كبير مجمعات البروتين حسن النية من أجنة ذبابة الفاكهة. ويستند هذا الأسلوب على permeabilization الجنين والاستقرار في المجمعات داخل الأجنة في الجسم الحي بواسطة يشابك باستخدام تركيز منخفض من الفورمالديهايد، والتي يمكن بسهولة عبر غشاء الخلية. في وقت لاحق، وimmunopurified مجمع البروتين من الفائدة تليها تنقية جل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. نحن لتوضيح هذه الطريقة باستخدام تنقية مجمع البروتين تيودور، وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية. تيودور هو بروتين كبيرة، والذي يحتوي على مجالات متعددة تيودور - الصغيرةالوحدات التي تتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينات المستهدفة. هذه الطريقة يمكن تكييفها لعزل المجمعات البروتين الأصلي من الكائنات الحية والأنسجة المختلفة.

المقدمة

يتم تنفيذ عزل التجمعات البروتين multisubunit والمجمعات الحمض النووي RNA أو البروتين لتحديد المجمعات البروتين، ومواضع الجيني معترف بها من قبل البروتينات التنظيمية ملزمة الحمض النووي RNA أو أهداف من البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي. طرق مختلفة تسمح تحديد على نطاق الجينوم الحمض النووي من المواقع المعترف بها من قبل عوامل النسخ أو البروتينات لونين (رقاقة وما يليها) 1 وأهداف RNA يرتبط مع بروتين ملزمة الحمض النووي الريبي معين (CLIP وما يليها) 2. ثم يتم التسلسل عميق مكتبات cDNAs المستمدة من الحمض النووي الريبي DNA أو أهداف. استخدام هذه الأساليب الكيميائية أو عبر ربط لتحقيق الاستقرار في المجمعات تليها مناعي (IP) مع الأجسام المضادة ضد أحد مكونات البروتين من مجمع درس الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية.

خلال تطوير كائن حي، وكثير من المجمعات البروتين تشكيل عابر. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحليل تكوين وظيفة هذه المجمعات في الجسم الحي لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديفelopment. ان مثل هذا التحليل في الجسم الحي تكون متفوقة على النهج في المختبر لأنه يكاد يكون من المستحيل لإعادة إنتاج تركيزات مواطن من مكونات التفاعل والبيئة البيوكيميائية الخلوية في المختبر. نحن هنا إثبات وجود في الجسم الحي النهج التي نستخدمها بنجاح لعزل البروتين المجمعات الكبيرة من أجنة ذبابة الفاكهة. في هذه الطريقة، crosslinked المجمعات البروتين في الأجنة الحية مع تركيز منخفض من الفورمالديهايد، وبعد ذلك يتم عزل المجمعات البروتين من الفائدة عن طريق IP مع الأجسام المضادة ضد عنصر معروف من المجمعات تليها هلام تطهير المجمعات وتحليل الطيف الكتلي ل تحديد مكونات معقدة غير معروفة. منذ الفورمالديهايد قادرة على تتخلل غشاء الخلية ويبلغ مداه يشابك من 2،3-2،7 Å 3، مجمعات البروتين يمكن crosslinked في الجسم الحي، ويحتمل أن تكون قريبة من بعضها البعض في مكونات معقدة. في هذه المادة ونحنتصف هذه الطريقة باستخدام عزلة تيودور (TUD) بروتين معقد كمثال على ذلك. TUD هو بروتين سلالة الجرثومية وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية 4-7. هذا البروتين يحتوي على 11 المجالات TUD معروفة للتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينية الأخرى 8-10.

في السابق، ونحن قد ولدت خط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر HA الموسومة الوظيفية TUD 5 وبالتالي، يتم استخدام محددة لمكافحة HA الأجسام المضادة لهدم مجمع TUD بعد يشابك.

بالإضافة إلى crosslinks البروتين البروتين، يمكن أن الفورمالديهايد توليد النووي crosslinks حمض البروتين ويستخدم في التجارب رقاقة وما يليها. علاوة على ذلك، في ذبابة الفاكهة، في الجسم الحي مع يشابك الفورمالديهايد سمحت تحديد هدف الحمض النووي الريبي من البروتين RNA helicase فاسا 11.

بينما في هذه المادة ونحن تصف طريقة لفي الجسم الحي يشابك وبورification المجمعات البروتين من أجنة ذبابة الفاكهة، وهذه الطريقة يمكن تكييفها للكائنات والأنسجة الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد كبيرة عصير التفاح لوحات أجار

  1. لجعل 4 لوحات، إضافة 375 مل من H 2 O، 11.25 غرام ذبابة أجار وبقضيب إلى قارورة 1،000 مل. هذا هو مزيج A. A الأوتوكلاف ميكس مع غطاء قارورة توج فضفاضة على دورة واحدة و 30 دقيقة التعقيم للبضائع السائلة.
  2. إضافة 125 مل عصير التفاح، 12.5 غرام سكر المائدة وبقضيب إلى كوب 500 مل. هذا هو ميكس ميكس الحرارة B. B على منصة ساخنة مع التحريك والحفاظ على درجة الحرارة عند حوالي 70 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء من التعقيم من مزيج A.
  3. عند الانتهاء من خلط التعقيم، ونقل ميكس ميكس A. B لنضع الخليط مع التحريك مجتمعة بلطف واتركها تبرد لمدة 15 دقيقة. تجنب الإفراط في التبريد والتصلب أجار نتج قبل إضافة المواد الحافظة.
  4. جعل 10٪ (وزن / حجم) الميثيل الحل 4-hydroxybenzoate في الايثانول. وهذا التصرف كمادة حافظة. إضافة 3.75 مل من الحل إلى ما سبق التفاح خليط عصير أجار. الحفاظ على التحريك لمدة anotheص 5 دقائق.
  5. صب 125 مل عصير التفاح أغار خليط مع المواد الحافظة في كل 300 سم 2 أو لوحة من البلاستيك الستايروفوم. اتركها تبرد لRT ويصلب. تجنب تشكيل فقاعات الهواء بينما تتدفق.
    ملاحظة: التفاح وعصير لوحات أجار تكون جاهزة للاستخدام فورا. تغطية لوحات غير المستخدمة مع يلف واضحة وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

2. ذبابة الفاكهة الأجنة جمع ومعالجة ما قبل يشابك

  1. تحميل قفص السكان مع ما يقرب من 40،000 إلى 50،000 الذباب التي سيتم جمعها الأجنة.
  2. جعل اثنين من لوحات كل منها يحتوي على 125 مل من معيار دقيق الذرة، دبس المتوسطة 12 ويرش حوالي 4 غرام من خميرة الخباز المجففة على كل لوحة. وضع هذه اللوحات في قفص السكان في الحاضنة 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لتسمين الذباب.
  3. 2 التفاح الدافئ لوحات عصير أجار إلى 25 درجة مئوية. رش حوالي 1 غرام من خميرة الخباز المجففة على كللوحة. وضع لوحات 2 في القفص السكان للبدء في جمع 0-1 الأجنة ساعة قديمة.
  4. تأخذ بها لوحات في نهاية جمع 1 ساعة. استبدال لوحات جديدة 2 إذا كان هناك حاجة جولة أخرى من المجموعة.
  5. إضافة كمية كافية من الماء لتغطية لوحات و resuspend الأجنة برفق باستخدام فرشاة الطلاء بشكل جيد. صب الأجنة معلق من خلال غربال اثنين من طبقة مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة أسلاك الفولاذ.
    ملاحظة: تتكون الطبقة العليا من متوسطة حجم المسام (850 ميكرون) عيون الذي يجمع أجزاء كبيرة ذبابة حين السماح من خلال الأجنة. تتكون طبقة السفلي من شبكة غرامة (75 ميكرون) الذي يجمع أجنة في حين ترك من خلال الخميرة والماء.
  6. استخدام فرشاة الطلاء غرامة لنقل الأجنة التي تم جمعها في سلة جمع مصنوعة من أنبوب 50 مل وغرامة شبكة من النايلون. شطف الأجنة لفترة وجيزة مع الماء ثم صمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف.
  7. تزج الأجنة في التبييض 50٪ مع يحوم طيف لمدة 3 دقائق. شطف شامللاي بالماء لإزالة أي مواد التبييض المتبقية. وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف.
  8. تزج الأجنة dechorionated في الأيزوبروبانول مع الإثارة لطيف لمدة 15 ثانية أو حتى انهيار كتل متعددة الجنين (هذا لا ينبغي أن تستغرق وقتا أطول من 30 ثانية). وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف تماما.
  9. تزج الأجنة في هيبتان لمدة 5 دقائق أثناء استخدام ماصة لتيار هيبتان أكثر من الأجنة لابقائهم معلق. وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف.
  10. شطف الأجنة مع تيارات من الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS) تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (PBST) لمدة 3 دقائق.
  11. تفكيك سلة جمع ونقل الأجنة إلى جانب شبكة لأنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل PBST. عكس الأنبوب برفق لغسل الأجنة خارج شبكة.
  12. إزالة شبكة من الأنبوب. وضع أنبوب في وضع عمودي، والسماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية.
    ملاحظة: ما يقرب من 100-300ومن المتوقع لمجموعة 1 ساعة من قفص واحد ميكرولتر من الأجنة.
  13. إزالة PBST والاستمرار في أداء يشابك على الفور.

3. في الجسم الحي يشابك من الأجنة التي يتم جمعها

  1. إعداد 0.2٪ الفورمالديهايد في PBST فورا قبل الاستخدام. إضافة 10 مل من تثبيتي الفورمالديهايد إلى الأجنة واحتضان عند 25 درجة مئوية مع الإثارة لطيف على شاكر دوارة لمدة 10 دقيقة. تجاهل تثبيتي غير المستخدمة في نهاية اليوم.
  2. إخماد رد فعل يشابك
    1. في نهاية يشابك، والسماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب.
    2. إزالة الحل الفورمالديهايد. إضافة على الفور 10 مل من 0.25 M الجلايسين في PBST لإرواء رد فعل يشابك. احتضان عند 25 درجة مئوية مع الإثارة لطيف على شاكر دوارة لمدة 5 دقائق.
    3. السماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب. إزالة الحل إخماد. غسل الأجنة مع 10 مل من PBST ثلاث مرات.
    4. تماما إزالة Pالحل غسل BST باستخدام ماصة. متجر الأجنة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. إعداد نموذج البروتين ومناعي

  1. التجانس 500 ميكرولتر الأجنة crosslinked باستخدام الخالط Dounce في 2 مل العازلة تحلل (0.5 M اليوريا، 0.01٪ SDS، 2٪ تريتون X-100، 2 مم phenylmethanesulfonyl فلوريد [PMSF] ومثبط البروتياز كوكتيل في برنامج تلفزيوني).
    ملاحظة: تنفيذ هذه والخطوات التالية في RT ما لم ينص على خلاف ذلك.
  2. نقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي والصخور بلطف على منصة دوارة لمدة 15 دقيقة لضمان تحلل شامل. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلوية. حفظ طاف في أنبوب 15 مل نظيفة.
  3. إضافة 40 ميكرولتر الخرز الاغاروز مكافحة HA الطين لطاف واحتضان على منصة دوارة لمدة 2.5 ساعة.
  4. بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف ولكن ترك APPROximately 250 ميكرولتر في الأنبوب. resuspend والخرز في طاف المتبقية ونقل إلى عمود الدوران 1.5 مل مع 10 ميكرون فلتر المسام.
  5. أجهزة الطرد المركزي لعمود الدوران في 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وتجاهل من خلال تدفق.
  6. تغسل حبات بإضافة 200 ميكرولتر غسل العازلة (0.1 M الجلايسين، 1 M كلوريد الصوديوم، 1٪ IGEPAL CA-630، 0.1٪ توين 20، في برنامج تلفزيوني). أجهزة الطرد المركزي في العمود 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وتجاهل غسيل. تكرار غسل مرتين أخريين.
  7. إضافة 40 ميكرولتر العازلة شطف (2 ملغ / مل HA-الببتيد في برنامج تلفزيوني) إلى الخرز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف كل 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في العمود 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وجمع شطافة.
  8. تأكيد شطف للمجمع عن طريق التحليل الغربي لطخة استخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة HA 13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم تحليل فعالية يشابك وتنقية الناجح للبروتين معقد TUD crosslinked بواسطة SDS-PAGE على 3٪ - 7٪ خطوة هلام (موضح في الشكل 1)، يليه لطخة غربية (الشكل 2).

ويستند 7٪ هلام خطوة على الفصل الفعال للcrosslinked بروتين معقد TUD من البروتين المتبقية uncrosslinked TUD وتركيز المجمع - الغرض من استخدام 3٪. لدينا تحت ظروف في الجسم الحي يشابك المذكورة أعلاه، فإن نسبة كبيرة من البروتي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد الفورمالديهايد يشيع استخدامها بوصفها كاشف يشابك لتحديد البروتين البروتين والحمض النووي البروتين التفاعلات. حسن الذوبان ونفاذية غشاء الخلية، جنبا إلى جنب مع التوافق مع الإجراءات مطياف الكتلة المصب، وجعل الفورمالديهايد وكيل المرشح المثالي لتطبيقات الخلايا يشابك 3،15-17. على وجه الخصوص، تم استخدامه بنجاح لتحديد mRNAs والمرتبطة فاسا، وhelicase الحمض النووي الريبي الخلية الجرثومية حاسما في ذبابة الفاكهة 11. بالإضافة إلى ذلك، الفورمالديهايد واحدة من أق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر الأردن ديفيس، يانيان لين، اريك شادلر وJimiao تشنغ للمساعدة التقنية مع هذه الدراسة. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني وظيفيه منح MCB-1054962 لALA

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ذبابة الفاكهة < / em> أجارلاب العلمية (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1لا تقم بتعقيم مزيج الماء والأجار لفترة طويلة من الزمن لأنه سيؤدي إلى هشاشة ألواح عصير التفاح
ميثيل 4-هيدروكسي بنزواتسيجما (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501اسم آخر: TEGOSEPT
قفص سكانيFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
شبكة نايلون ناعمةFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102عند صنع سلة التجميع ، قم بقص الشبكة أكبر قليلا من فتحة غطاء أنبوب الصقر لضمان إحكام الختم
Dounce homogenizerSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETقم بتبريد الخالط على الثلج واشطفه مسبقا بمحلول التحلل البارد قبل الاستخدام لمنع تحلل البروتين
كوكتيل مثبط البروتياز   ؛روش (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001يمكن استخدام PBS لتحضير محلول مخزون مثبط البروتياز المركز
حبات الاغاروز المضادة لحمض الهيدروكسورونيكMBL الدولي (http://www.mblintl.com/)561-8تشتمل المجموعة أيضا على أعمدة HA-الببتيد والدوران
HA-peptideMBL الدولية (http://www.mblintl.com/)561-8الاستعداد إلى 2 مجم / مل مع PBS & nbsp ؛
عمود الدورانMBL الدولي (http://www.mblintl.com/)561-8يتم تضمين أعمدة الدوران كجزء من مجموعة
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ؛)BP26324
تريتون X-100فيشر ساينتفيك (www.fishersci.com/&lrm ؛)BP151-500
هيبتانفيشر العلمي (www.fishersci.com/&lrm؛)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625تمييع من 10X إلى 1X بالماء النانوي النقي قبل الاستخدام
الفورمالديهايدفيشر Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
جلايسينبيوراد (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
اليوريابيوراد (www.bio-rad.com/‎)161-0730
فينيل ميثان سولفونيل فلوريدسيجما (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1Gقم بإعداد محلول مخزون 200 ملي مولار في الأيزوبروبانول ثم قم بتخفيفه إلى تركيز عمل يبلغ 2 ملي مولار في عازلة التحلل
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ؛)BP337-100
أنابيب 15 مل الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية (http://www.usascientific.com/)1475-0511
مبيضماركةتمييع بحجم متساو من الماء النقي النانوي لصنع 50٪ مبيض
50 مل أنابيبBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
منخل الطبقة العليافيشر Scientific (www.fishersci.com/&lrm ؛)04-884-1AK
غربال الطبقة السفليةفيشر العلمية (www.fishersci.com/&lrm ؛)04-884-1 بكالوريوس
كلوركس

المراجع

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة