تتوفر العديد من الطرق لقياس درجة الحموضة داخل الخلايا ولكن القليل جدا منها يسمح بالقياس المتزامن لدرجة الحموضة السيتوبلازمية والعضوية. هنا ، نصف بالتفصيل منهجية سريعة ودقيقة لقياس الأس الهيدروجيني السيتوبلازمي والحويصلي في وقت واحد عن طريق التصوير النسبي للخلايا الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في وقت واحد قياس درجة الحموضة في التقامي وعصاري خلوي المقصورات في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم تنظيم الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا بإحكام وتم الإبلاغ عن اختلافات في الأس الهيدروجيني بين السيتوبلازم والعضيات1. يعد تنظيم درجة الحموضة الخلوية أمرا بالغ الأهمية للتحكم في التماثل في العمليات الفسيولوجية التي تشمل: تخليق البروتين والحمض النووي الريبي والاتجار الحويصلي ونمو الخلايا وانقسام الخلايا. يمكن أن تؤدي التغيرات في توازن الأس الهيدروجيني الخلوي إلى تغيرات وظيفية ضارة وتعزز تطور الأمراض المختلفة2. تتوفر طرق مختلفة لقياس درجة الحموضة داخل الخلايا ولكن القليل جدا منها يسمح بقياس الأس الهيدروجيني في السيتوبلازم وفي العضيات. هنا ، نصف بالتفصيل طريقة سريعة ودقيقة للقياس المتزامن لدرجة الحموضة السيتوبلازمية والعضوية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر على الخلايا الحية3. يتم تحقيق هذا الهدف باستخدام أصباغ نسبية متشعرة بدرجة الحموضة تمتلك تقسيما انتقائيا للحجرة الخلوية. على سبيل المثال ، يتم تقسيم SNARF-1 داخل السيتوبلازم بينما يتم تقسيم HPTS داخل العضيات الداخلية / الليزوزومية. على الرغم من أن HPTS يستخدم بشكل شائع كمؤشر للأس الهيدروجيني السيتوبلازمي ، إلا أن هذه الصبغة يمكنها تسمية الحويصلات على وجه التحديد على طول المسار الاحتجازي الداخلي بعد تناولها بواسطة كثرة الخلاياالصنوبرية 3،4. باستخدام مجسات استشعار الأس الهيدروجيني هذه ، من الممكن قياس الأس الهيدروجيني في وقت واحد داخل المقصورات الداخلية والسيتوبلازمية. يختلف الطول الموجي الأمثل للإثارة ل HPTS اعتمادا على الرقم الهيدروجيني بينما بالنسبة ل SNARF-1 ، فإن الطول الموجي الأمثل للانبعاث هو الذي يختلف. بعد التحميل باستخدام SNARF-1 و HPTS ، يتم زراعة الخلايا في محاليل مختلفة معايرة الأس الهيدروجيني لإنشاء منحنى قياسي للأس الهيدروجيني لكل مسبار. يسمح التصوير الخلوي عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر بالقضاء على القطع الأثرية وضوضاء الخلفية. نظرا للخصائص الطيفية ل HPTS ، فإن هذا المسبار مناسب بشكل أفضل لقياس الحيز الداخلي الحمضي المعتدل أو لإثبات قلوية العضيات الداخلية / الليزوزومية. تعمل هذه الطريقة على تبسيط تحليل البيانات ، وتحسين دقة قياسات الأس الهيدروجيني ويمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة الأساسية المتعلقة بتعديل الأس الهيدروجيني أثناء استجابات الخلية للتحديات الخارجية.
البروتوكول
1. إعداد حلول لالخلوية درجة الحموضة المعايرة
- إضافة مركبات التالية لخمسة أنابيب 50 مل المخروطية منفصلة لإعداد 5 حلول لاستخدامها في معايرة:
- كلوريد الصوديوم (1 مل من كلوريد الصوديوم M 1) (1 M كلوريد الصوديوم = 0.58 غ في 10 مل H 2 0)
- بوكل (6.75 مل من 1 M بوكل) (1 M بوكل = 0.75 غ في 10 مل H 2 0)
- الجلوكوز (1 مل من 1 M D-جلوكوز) (1M D-جلوكوز = 1.80 غ في 10 مل H 2 0)
- MgS0 4 (0.05 مل من 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1.20 غ في 10 مل H 2 0)
- 20 ملي HEPES (1 مل من 1M HEPES) (1 M HEPES = 2.38 غ في 10 مل H 2 0)
- و CaCl 2 (0.05 مل من 1M و CaCl 2) (1 M و CaCl 2 = 1.47 غ في 10 مل H 2 0)
إعداد جميع الحلول في ضعف المقطر H 2 O ([ده 2 O).
- إكمال كل حل مع 35 مل من DDH 2 O وتخلط مع محرك مغناطيسي حتى ذلكويتحقق lution.
- ضبط درجة الحموضة من كل حل مع 1 N 1 N KOH أو حمض الهيدروكلوريك الحصول على قيم درجة الحموضة 5.5، 6.0، 6.5، 7.0 و 7.5. ثم، وضبط حجم مع الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي من 50 مل.
- قياس 5 ملغ من nigericin وإضافته إلى 670 ميكرولتر من ETOH المطلقة لإعداد 10 ملي nigericin محلول المخزون.
الحذر: nigericin عالية السمية ويجب التعامل بحذر شديد (القفازات، ونظارات السلامة وقناع). مزيج الحل عن طريق انقلاب حتى يذوب تماما nigericin. - إضافة 0.05 مل من 10 ملي nigericin (تركيز النهائي 10 ميكرومتر) على كل حل المعايرة. Nigericin هو حامل الأيون الذي يزيد من نفاذية الأغشية الخلوية ويسبب موازنة درجة الحموضة داخل الخلايا وخارج الخلية في وجود تركيز إزالة إستقطاب من خارج الخلية K +.
- ويمكن تخزين حلول المعايرة يصل إلى 1 في الشهر في 4 درجات مئوية
2. إعداد الخليوي
- تحت سافيت البيولوجيةذ غطاء محرك السيارة، وخلايا البذور في 35 ملم الأطباق ثقافة × 10 مم في 2 مل من متوسط النمو تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والمضادات الحيوية. استخدام كمية الخلايا اللازمة لضمان ما يقرب من 50٪ التقاء بعد 24 ساعة.
ملاحظة: في تجاربنا، ونحن نستخدم خط الخلية HT-1080 ولوحة 1 × 10 5 خلايا لكل طبق الثقافة. - تحديد عدد من الأطباق الثقافة اللازمة للتجربة وصفيحة 5 أطباق الثقافة إضافية لاستخدامها في المعايرة.
- أطباق ثقافة المكان في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 24 ساعة على الأقل.
3. إعداد تحقيقات الحموضة الاستشعار
- إعداد محلول المخزون 1M من الفلورسنت التحقيق الحموضة 8 hydroxypyrene-1، 3،6 حمض trisulfonic والملح صوديوم (HPTS / pyranine) في DDH 2 0. يجب أن يتم تخزين هذا الحل على RT ومحمية من الضوء.
- إعداد محلول المخزون من 1 ملم 5 - (و6) الكربوكسيل seminaphthorhodafluor acetoxymethyl استر خلات (C-SNARF-1 صباحا؛ دعا thereaأي fter SNARF-1) عن طريق إذابة 1 ملغ من SNARF-1 في 1.76 مل من DMSO. مزيج دقيق من قبل pipetting المتكررة. يجب أن يتم تخزين SNARF-1 الحل في -20 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
4. صفها الخليوي
- قبل ستة عشر ساعة التصوير الخلية الحية، إضافة 2 ميكرولتر من 1M HPTS محلول المخزون (تركيز النهائي 1 ملم) إلى كل طبق ثقافة تحتوي على 2 مل من المتوسط كاملة.
- العودة الأطباق الثقافة الحاضنة. التحقيق HPTS هو خلية impermeant، وبالتالي لتسمية العضيات يجب أن تؤخذ في التحقيق من قبل الإحتساء. يتطلب هذا الشرط أن حضانات الخلية مع HPTS يتم تنفيذها في استكمال مصل الثقافة المتوسطة.
- بعد الحضانة مع HPTS، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة وإضافة 2 مل من المصل خالية متوسطة لمدة لا تقل عن 2 ساعة. الحضانة مع SNARF-1 يحتاج إلى أن يؤديها في المصل خالية المتوسطة لأن المصل قد تمنع امتصاص التحقيق.
- إضافة 10 ميكرولتر من SNARF-1 محلول المخزون 1 ملم للحصول بالعربيةتركيز إينال من 5 ميكرومتر وتسمح للخلايا لاحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتحت ضوء خافت. قد تختلف C-SNARF-1 تركيز ووقت الحضانة وفقا لنوع الخلية.
- في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني العقيمة وإضافة 2 مل من المصل خالية المتوسطة.
5. إضافة الرقم الهيدروجيني المغيرون
- لتقييم ما إذا كان الأسلوب يمكن الكشف عن تغييرات درجة الحموضة في الخلايا والكواشف المختلفة التي تعدل الحموضة داخل الخلايا يمكن استخدامها:
- Bafilomycin A1، مثبط محددة من V-أتباز 5
- غ + / H + مبادل الإسوي 1 (NHE-1) 6
- NH 4 CL، قاعدة ضعيفة أن يزيد درجة الحموضة داخل الخلايا 7
- إعداد حلول المخزون من الكواشف المذكورة أعلاه:
- Bafilomycin A1: إضافة 10 ميكروغرام من bafilomycin A1 إلى 160 ميكرولتر من DMSO للحصول على محلول المخزون من 100 ميكرومتر
- EIPA: إضافة 25 ملغ من EIPA إلى 1.67 مل من الميثانول إلى obtaiغ تركيز النهائي من 50 ملم
- NH 4 الكلورين: حل 0.53 غرام من كلوريد الأمونيوم في 10 مل من DDH 2 O للحصول على تركيز النهائي من 1 ملم.
ملاحظة: يجب أن تبقى جميع الحلول السهم عند 4 درجات مئوية فيما عدا A1 bafilomycin التي يجب تخزينها في -20 درجة مئوية، ومحمية من الضوء. - في أطباق منفصلة الثقافة، إضافة واحد من الكواشف كما هو موضح أدناه:
- 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر bafilomycin A1 (تركيز النهائي 100 نانومتر)
- 1 ميكرولتر من 50 ملي EIPA (تركيز النهائي 25 ميكرومتر)
- 40 ميكرولتر من 1M NH 4 الكلورين (تركيز النهائي 20 ملي)
- احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- انتقل إلى الحصول على الصور.
6. مواصفات تعيش خلية التصوير وإعدادات اقتناء مجهر
- أداء التصوير الخلية الحية باستخدام الهدف 40X شنت على الطيفية مقلوب المسح microsco متحد البؤرالمؤسسة العامة مجهزة مرحلة XY بمحركات، وغرفة تستوعب الزجاج الأطباق ثقافة أسفل في بيئة تسيطر عليها (درجة الحرارة، الرطوبة، CO 2) مرحلة الحاضنة.
- وقد تم تجهيز الصك متحد البؤر (أوليمبوس FV1000) تستخدم هنا مع:
- الصمام الثنائي ليزر 405 نانومتر
- A 40 ميغاواط الأرجون ليزر (458 نانومتر، 488 نانومتر، 515 نانومتر)
- والهيليوم نيون ليزر (543 نانومتر)
- الهدف 10X فلوريت، NA0.4
- وثمة هدف LUCPLFLN 40X، NA0.60
- وثمة هدف النفط PLAPONSC خطة APO 60X، NA1.4
- A DM مزدوج اللون مرآة 405/458/488/543
- A SDM 560 وSDM 640 مرشحات مزدوج اللون
- A BA655-755 مرشح حاجز
- A BS20/80 شعاع الخائن
- برامج تحليل البيانات عن الحصول على الصور وتحليلها،
- مرة واحدة وقد تحسنت الحاضنة مرحلة تصل إلى 37 درجة مئوية، ويتم تعيين ما يصل المجهر، ضع صحن الثقافة المحتضنة سابقا مع HPTS وSNARF-1 في غرفة التصوير المرحلة متحد البؤر.
- Aأي fter تحديد مساحة من الاهتمام، وضبط إعدادات اقتناء البرمجيات الشكل 1.
- إعداد مجموعتين القناة الظاهرية.
- بدء المرحلة الأولى الذي يتوافق مع HPTS الإثارة في 405 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 505-525 نانومتر وSNARF-1 الإثارة في 543 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 570-600 نانومتر.
- بدء المرحلة الثانية الذي يتوافق مع HPTS الإثارة في 458 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 505-525 نانومتر وSNARF-1 الإثارة في 543 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 640-650 نانومتر.
- يتم تعيين الفتحة مبائر إلى 175 ميكرومتر افتراضيا ويحتاج الفتحة الأمثل لتعيين يدويا في 300 ميكرون.
- تأخذ الصورة عن طريق التراص الأفقي المسلسل المقاطع البصرية (800 × 800 بكسل) من 0.4 ميكرومتر سمك.
ملاحظة: ثمة هدف 40X من المفيد أن نلاحظ عدة خلايا في وقت واحد ويعمل بشكل جيد للعرض العضية. ومع ذلك، القرار المكانية وكثافة إشارة وباتحققت ص باستخدام الهدف 60X النفط. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك الإثارة أو الانبعاثات عبر الحديث بين اثنين من الأصباغ.
7. معايرة مجسات استشعار درجة الحموضة
- قبل المعايرة، وإزالة المتوسطة من الطبق الثقافة المحتضنة سابقا مع HPTS وSNARF-1، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ثم إضافة 2 مل من أحد الحلول المعايرة الخمسة.
- وضع الطبق الثقافة في غرفة المرحلة متحد البؤر.
- انتقل إلى الحصول على الصور مرور الزمن وفقا للإعدادات التالية:
- تعيين عدد من الصور والأوقات مدة الفاصل الزمني للتجربة.
ملاحظة: نحن عادة استخدام فاصل 1 دقيقة بين الصور لمدة تصل إلى 30 دقيقة. - برمجة لإغلاق مصراع بين اقتناء كل صورة.
- تعيين عدد من الصور والأوقات مدة الفاصل الزمني للتجربة.
- تسجيل كثافة مضان لكل دقيقة في برنامج جداول البيانات وتحديد الوقت عند كثافة مضان هو ثابت. درجة الحموضة داخل الخلايا عادة مستقرة بعد 15-20 دقيقة.
- REPEAT الخطوات 7،1-7،4 باستخدام طبق ثقافة جديدة لكل حل المعايرة المتبقية.
8. الحصول على البيانات
- مرة واحدة وقد تم ذلك المعايرة، والحصول على بيانات عينة 4-5 مجالات اختيارها عشوائيا تحتوي على خلايا 15-20 في الميدان. ويتم الحصول على صورتين لكل حقل: واحدة لوصفها HPTS (الحويصلات) والثانية لSNARF-1 وضع العلامات (العصارة الخلوية).
- خلفية مضان (منطقة خارج الخلية) يتم طرح رقميا من الصور الفلورسنت من كلا تحقيقات. ويتم اختيار الحويصلات وصفت والعصارة الخلوية من الصور الخاصة بها المخزنة باستخدام قناع ثنائي. لكل مسبار درجة الحموضة الاستشعار عن بعد، ويتم قياس كثافة مضان على نطاق والعددية (0-4،095 مقياس مستوى الرمادي). يتم احتساب متوسط كثافة لجميع بكسل في عضية أو السيتوبلازم وتستخدم لحساب قيم نسب مضان.
9. تحليل البيانات
- تتوفر تجاريا لتحليل البيانات وحزم البرمجيات المختلفة. أيFluoview البرمجيات.
- في جدول بيانات، والقيم سجل وحساب نسب مضان على النحو التالي: في حالة HPTS، R = (F 458 نانومتر / F 405 نانومتر) و، في حالة SNARF-1، R = (F 644 نانومتر / F 584 نانومتر ).
- رسم البيانات باستخدام برنامج الرسوم البيانية العلمية مثل GraphPad بريزم. المؤامرة يجب تصوير نسب مضان (Y-المحور) بوصفها وظيفة من درجة الحموضة (المحور السيني). ويتحقق منحنى المناسب باستخدام الانحدار غير الخطية.
- جمع شدة مضان من العينات كما هو موضح في الخطوة 8.2 وحساب نسب مضان. استخدام منحنيات المعايرة لتحويل نسب إلى قيم درجة الحموضة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقياس درجة الحموضة في وقت واحد في كل من داخل الخلايا والمقصورات الخلية endosomal / الليزوزومية، استخدمت الفلورسنت تحقيقات الحموضة الاستشعار ratiometric SNARF-1 وHPTS. SNARF-1 يقتصر على مقصورة عصاري خلوي في حين يسمح HPTS قياس درجة الحموضة ratiometric من المقصورة endosomal / الليزوزومية. تحميل الخلية مع HPTS لمدة 16 ساعة يسمح توطين انتقائية في الإندوسومات / 4 الجسيمات الحالة. ويرد مثال نموذجي من مضان سجلت من الخلايا HT 1080 محملة تحقيقات الحموضة الاستشعار عن بعد في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك حاجة إلى قياس درجة الحموضة الكمي في مجال التصوير الخلية الحية من مقصورات الخلوية المختلفة لقياس درجة الحموضة بدقة الاختلافات في استجابات الخلايا إلى التحديات الخارجية. ومع ذلك، واحدة من العقبات الرئيسية التي لا يزال هو بسهولة وتحديدا استهداف مقصورات الخلوية. في هذا الصدد، أبرزت عدد قليل من الدراسات استخدام HPTS كمؤشر درجة الحموضة داخل الخلايا التي أدخلت الخلايا عن طريق التثقيب الكهربائي أو حقن مكروي 8-10. هذه التقنيات تعاني من عيوب خطيرة، وهي تسبب أضرارا واسعة النط...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور جيل دوبوي على القراءة النقدية للمخطوطة.
التمويل
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية ، المنحة # MOP-126173. C.M.D عضو في مركز البحوث في البحوث والثقافة (FRSQ) الممول من مركز البحوث في المدرسة الثانوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حلول للمعايرة | |||
| كلوريد الصوديوم | فيشر | L-11621 | |
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر | M-12445 | |
| D-جلوكوز (سكر العنب) | فيشر | D16-1 | |
| كبريتات المغنيسيوم | فيشر | M65-500 | |
| هيبس | سيجما ألدريتش | H3375 | |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | فيشر | M-1612 | |
| ماء منزوع الأيونات | N / A | N / A | |
| NIGERICIN | CALBIOCHEM | 481990 | سام عن طريق الاستنشاق أو ملامسة للجلد |
| ثقافة C فارغة ؛ 35 مم | BD Biosciences | 354456 | |
| مجسات | |||
| 8-هيدروكسي بيرين -1،3،6-حمض تريسلفونيك (HPTS) | تقنيات الحياة | H-348 | الابتعاد عن الضوء في درجة حرارة الغرفة |
| 5- (و -6) - Carboxy SNARF & reg ؛ -1 ، Acetoxymethyl Ester ، تقنيات Acetate | Life | C-1271 | الابتعاد عن الضوء والرطوبة عند -20 درجة ؛ سي |
| ثنائي ميثيل سوفوكسيد (DMSO) | فيشر | BP231-1 ؛ | مضر |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 100X | |||
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر | M-12445 | 20 جم |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | فيشر | S369-1 | 115 جم |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | جي تي بيكر | 3246-01 | 20 جم |
| ماء منزوع الأيونات | غير | أحضر إلى 1 لتر | |
| الأوتوكلاف واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 | |||
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1X | |||
| PBS 100X | N / A | N / A | 50 مل |
| كلوريد الصوديوم | فيشر | L-11621 | 40.5 جم |
| ماء منزوع السماد | N / A | N / A | أحضر إلى 5 لتر |
| معدلات | |||
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B-1793 | |
| 5- (N-إيثيل-N-isopropyl) أميلوريد (EIPA) | سيجما ألدريتش | A3085 | |
| كلوريد الأمونيوم | فيشر | A649-500 |
المراجع
- Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
- Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
- Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
- Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
- Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
- Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
- Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
- Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
