مقالة منهجية

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

DOI:

10.3791/51408

⸱

مايو 29, 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك حاجة واحدة الجين الخلية التعبير مقايسة لفهم التغاير الخلايا الجذعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدم تجانس السكان الخلايا الجذعية يعوق فهم مفصل لبيولوجيا الخلايا الجذعية، مثل التمايز ميلها نحو الأنساب مختلفة. وحيد الخلية Transcriptome على الفحص يمكن أن يكون نهجا جديدا لتشريح الاختلاف الفردية. قمنا بتطوير خلية واحدة طريقة QRT-PCR، وأكد أن هذا الأسلوب يعمل بشكل جيد في العديد من ملامح التعبير الجيني. في مستوى خلية واحدة، كل خلية الجذعية الجنينية البشرية، تم الفرز حسب OCT4 :: الخلايا إيجابية EGFP، لديه عالية في التعبير OCT4، ولكن على مستوى مختلف من NANOG التعبير. وينبغي أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لاستجواب التغاير السكان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السكان حقيقي النواة معظم العالي غير متجانسة وبالتالي مع تحليل من سكان المجمعة، غالبا ما يكون من الصعب تفسير خصائصها الخلوية. الخلايا الفردية ضمن مجموعة من السكان قد تكون مختلفة بمهارة، ويمكن لهذه الاختلافات لها عواقب هامة للخاصية وظيفة من إجمالي عدد السكان 1، 2. خاصة، ومن المعروف عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أن تكون غير متجانسة، والذي يسبب مستويات مختلفة من تعدد القدرات والإمكانات المتنوعة لمواصفات النسب في طرق مميزة بدقة 3 و 4. على سبيل المثال، تختلف مستضدات سطح الخلية يمكن استخدامها لتصنيف الخلايا الجذعية المحفزة غير متمايزة، (5) ومجموعة أوستن سميث المقترحة مستويات مختلفة من تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية، استنادا على التشكل، الميل التمايز وتبعية يشير مسار 6. وقد افترض هذه الظاهرة في الجنين البشريالخلايا الجذعية شركة الاستثمارات الوطنية 7. في حين أجريت الدراسات الشاملة بين مختلف خطوط الخلايا الجذعية، وليس الخلايا الجذعية فرد واحد، ويمكن أن تكون مثيرة للغاية لتحليل مستويات مختلفة من تعدد القدرات على مستوى خلية واحدة، والتي يحتمل أن يؤثر على قدرات التمايز تجاه كل الأنساب الخلية الجسدية.

يمكن أملت عدم التجانس الخلوية والجزيئية من خلال التنميط النسخ، وهو ما يسمى 'Transcriptome على خلية واحدة' ويؤكد نهج جديدة لقياس مستويات التعبير الجيني 8-10. لتحليل مستويات التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وضعنا بروتوكولا بسيطة، ولكن قوية من خلية واحدة الكمي RT-PCR. أكدنا على فعالية وجدوى من بروتوكول لدينا من خلال مقارنة كل نصف لست] خلية واحدة، وكذلك مجموع الرنا المخفف متسلسل من hESCs، مما أدى إلى الاختلافات التقنية والحد الأدنى من الخلافات. علاوة على ذلك، استخدمنا خط مراسل الوراثية لعزل ع متجانسةopulation من hESCs باستخدام نظام استهداف الجينات. استخدمت ناقلات المانحة لاستهداف OCT4 موضع (OCT4-2A-EGFP-PGK-بورو بناء) وزوج من البلازميدات TALEN 11. أدخلت ناقلات المانحة وزوج من البلازميدات TALEN في hESCs (H9، WA09) باستخدام لدينا nucleofection وبروتوكول اختيار نسيلي وصيانة أجريت hESCs استنادا لدينا بروتوكول روتين 12. أكدنا هذا الخط مراسل الوراثية التعبير عن EGFP لOCT4 التعبير في OCT4 :: EGFP hESCs.

لدينا نتيجة يدل على أن hESCs الفردية (تم الفرز حسب OCT4 :: EGFP الخلايا إيجابية بقوة) عقد مستويات عالية من OCT4 التعبير، ولكن مستويات مختلفة من NANOG التعبير. لذلك، يجب أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لدراسة التغاير السكان من الخلايا الجذعية المحفزة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد اللوحة 96 جيد

  1. مزيج 1 ميكرولتر من خلية واحدة DNase1 إلى 9 ميكرولتر وحيد الخلية تحلل الحل.
  2. وضع 10 ميكرولتر حل مختلطة في كل بئر من 96 لوحة جيدا PCR.

2. فصل hESCs لنظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية

  1. فصل OCT4 :: خط الخلية EGFP ES من 60 ملم صحن مع 1 مل Accutase لمدة 20 دقيقة، عند 37 درجة مئوية، والتي كانت متعادلة مع وسائل الاعلام الإنسان ES.
  2. إعداد السكان خلية في 1 مل FACS العازلة وضبط خلية إلى 1 × 10 6 خلية / مل.
  3. تمرير عينة الخلية من خلال مصفاة الخلية 35 ميكرومتر غطاء الأنبوب.
  4. تخزين أنبوب في الجليد قبل الفرز الخلية.

3. تحلل من نظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية خلية واحدة في كل بئر من لوحة 96 جيدا

  1. فرز عينة للخلايا إيجابية EGFP على فارز الخلية مع المشغل المدربين. وضع خلية واحدة في خلية واحدة Lysis/DNase1 حل في 96 لوحة جيدا PCR. إذا لزم الأمر، و9لوحة 6 جيدا مع عينة يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية التجميد العميق أقل من شهر واحد.
  2. احتضان العينات 5 دقائق على RT لتحلل الخلية.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من وقف الحل لوقف رد فعل تحلل.
  4. احتضان 2 دقيقة في RT.

4. عكس النسخ

  1. إضافة إلى كل قسامة 0.5 ميكرولتر من 20 ميكرومتر SMA-T15، SMA-A.
  2. إضافة 4 ميكرولتر 5X العازلة، 2 ميكرولتر DTT، 1 ميكرولتر الناسخ العكسي، و 1 ميكرولتر dNTP إلى كل بئر.
  3. أداء النسخ العكسي في cycler الحرارية.
    1. ضبط البرنامج الحراري في 42 ° C × 90 دقيقة وتعطيل الناسخ العكسي في 85 ° C × 5 دقائق.

5. التضخيم

  1. إضافة 4 ميكرولتر من كاشف ExoSAP-IT لكل عكس العينة كتب.
    1. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة و 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى تعطيل كاشف ExoSAP-IT.
  2. إعداد PCR مزيج التفاعل ثإيث SMA-P2 (2 نانومتر)
  3. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج PCR رد فعل على عكس كل عينة كتب.
  4. أداء التضخيم، ويتألف من 20 دورات تمسخ (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية)، الصلب (57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية)، والإرشاد (68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة).

6. الأداء QRT-PCR

  1. إضافة 10 ميكرولتر من 2X SYBR الأخضر ميكس ماجستير PCR، 1 ميكرولتر تضخيم [كدنا]، 2 الاشعال نانومتر، و 7 ميكرولتر المياه إلى كل بئر.
    1. ضبط البرنامج تليها 95 درجة مئوية لمدة 3 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية × 40 دورات.
  2. أداء في مكررة لأخطاء فنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كفاءة وقوية واحدة تضخيم الحمض النووي الريبي الخلية

لتقليل التباين بين النسخي hESCs، استخدمنا OCT4 :: EGFP HESC استنساخ لتنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد فرز OCT4 :: الخلايا إيجابية EGFP في لوحة 96 جيدا، وهي lysed كل خلية في تحلل العازلة وتحويلها بولي (A) + RNA إلى كامل طول كدنا] باستخدام SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) التمهيدي وترسيخ مع SMA-A (ACATGTATCCGGATG...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحد التنميط الجيني الخلايا يمكن أن تكون أداة رئيسية للتنبؤ وظيفة من خلية واحدة أو شعب بأكمله. بسبب قيود تقنية، وقد تم تقييد التحليل التنميط الجيني بأكمله إلى المتوسطات السكان. وقد اقترحت الاختلافات في أنماط التعبير الجيني ومستويات بين الخلايا الفردية والمجموعات السكانية الفرعية للتسبب التفسير الخاطئ. هذه الجوانب الخلوية المتنوعة يمكن العثور عليها في hESCs ويسبب عدم التجانس قدرتها المختلفة بمهارة للحفاظ على تعدد القدرات والمواصفات مصير العملية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر أعضاء المختبر لي لإجراء مناقشات قيمة على المخطوطة. وأيد العمل في المختبر لي من المنح المقدمة من روبرتسون جائزة الباحث نيويورك مؤسسة الخلايا الجذعية من ولاية ماريلاند وصندوق أبحاث الخلايا (TEDCO) الجذعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96-well PCR لوحةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1402-8900
Ambion Cell Lysis KitLife Technologies4458235
SMARTScribe Reverse TranscriptaseClonetech639536
ExoSAP-ITUSB 78200
Platinum Taq DNA polymerase عالي الدقةInvitrogen11304
10 ملي مولار dNTP Mix، PCR GradeInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS buffer45 مل PBS ، 5 مل a-MEM ، 100 & mu ؛ ل DNase ، مرشح معقم
35 & مو ؛ أنابيب غطاء مصفاة الخلية m BDBiosciences352235

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

OCT4 EGFP

مقالات ذات صلة