البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

قياس الاختلافات تركيز العديد من البروتينات المعقدة بين العينات هو التحدي الرئيسي في البروتينات. على نحو متزايد، ويجري ذلك عن طريق وضع العلامات البروتينات في كل عينة مع العلامات النظائر المختلفة، والجمع بين العينات، واستخدام مطياف الكتلة لقياس الاختلافات التركيز. توجد عدة طرق لوضع العلامات النظائر مستقرة من البروتينات والببتيدات ¹⁵ N وضع العلامات ¹ و ² SILAC إدخال تسميات النظائر عملية الأيض في الجسم الحي، في حين ICAT ^{3، 4} iTRAQ، والحد من dimethylation ⁵ إضافة علامات النظائر مستقرة بعد استخراج البروتين والهضم. بين هذه الأساليب، dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) تكتسب شعبية باعتبارها، طريقة استنساخه غير مكلفة لتحديد الاختلافات تركيز البروتين في أي نوع تقريبا من العينة.

ويشمل وضع العلامات ريدي الببتيدات التفاعل مع الفورمالديهايد لتشكيل قاعدة شيف، الذي يتم تخفيض ثمبواسطة cyanoborohydride. رد الفعل هذا dimethylates المجموعات الأمينية الحرة على N-تيرميني والجانب يسين سلاسل وmonomethylates prolines N-محطة. بروتوكول الموصوفة هنا methylates الببتيدات في نموذج 1 مع "النور" التسمية باستخدام الكواشف مع ذرات الهيدروجين في توزيع النظائر الطبيعية وعينة 2 مع تسمية "الثقيل" باستخدام الفورمالدهيد بالديوتيريوم وcyanoborohydride (الشكل 1). كل مجموعة أمينية dimethylated على نتائج الببتيد في الفرق الجماعية لل6.0377 دا بين الضوء والأشكال الثقيلة، والذي يعمل على التمييز بين الشكلين باستخدام مطياف الكتلة. على وجه التحديد، وكميا فرة الببتيد النسبية كنسبة من MS1 استخراج المناطق اللوني ايون (MS1 نسبة المساحة الذروة) من الضوء والنسخة الثقيلة لكل زوج الببتيد أيون. يتم احتساب الوفرة النسبية للبروتين مثل نسبة المساحة الذروة MS1 متوسط ​​بين جميع الببتيدات في البروتين. في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول قوية للسلوكجي ريدي التجارب وضع العلامات من قبل LC-MS/MS يتضمن عكس المرحلة الببتيد المرحلة الصلبة استخراج، ووضع العلامات ريدي على العمود، الببتيد تجزئة بواسطة الرقم الهيدروجيني الأساسية المرحلة (BPRP) اللوني عكسه، وتنقية مخاليط الببتيد باستخدام StageTips (الشكل 2) . نحن نناقش مزايا والقيود المفروضة على استخدام الوسم ريدي لالبروتيوميات الكمي.

ملاحظة: هذه الطريقة تم وصفها سابقا ^12.

1. عزل بروتين

إعداد 1 ملغ من البروتين الخلوية من قبل خلايا lysing، ويفضل عن طريق الطرق الفيزيائية مثل الصحافة الفرنسية، وحبة الضرب، أو صوتنة. تجنب بوساطة الليزوزيم الخلية تحلل لأن الانزيم سوف نخلط قياسات مطياف الكتلة.

2. الهطول TCA من البروتينات

إضافة 1 حجم حمض الخليك ثلاثي الكلور (TCA) لبروتين 4 مجلدات والبرد على الجليد لمدة 10 دقيقة لترسيب البروتينات. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة طاف. resuspend الكرية في 1 مل من الجليد الباردة الأسيتون وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف وعكس أنبوب على مقاعد البدلاء لتجفيف بيليه لمدة 15 دقيقة. الكريات متجر البروتين في -80 درجة مئوية.

3. بروتينات والحد من السندات ثاني كبريتيد

إعادةتعليق البروتينات إلى ~ 2 ملغ / مل في 500 ميكرولتر العازلة وتمسخ التخفيض (إما 4 أو M اليوريا 3٪ SDS في 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 8.5، 5 ملي DTT). اختياريا، وتشمل مثبطات الأنزيم البروتيني في المخزن المؤقت. احتضان البروتينات لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية، تليها 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

4. Aklylate الحرة المجموعات سلفهيدريل لتعطيل لا رجعة فيه ثاني كبريتيد تشكيل بوند

إعداد الطازجة 0.3 M iodoacetamide في الماء. تنبيه! Iodoacetamide عالية السمية. إضافة 25 ميكرولتر 0.3 M iodoacetamide (15 ملي تركيز النهائي) إلى 500 ميكرولتر البروتين واحتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. إخماد iodoacetamide بإضافة 10 ميكرولتر من 300 ملي DTT (5 ملي تركيز النهائي DTT). تخزين البروتينات الألكيلية في -80 درجة مئوية.

5. الهضم من البروتين

TCA يعجل البروتينات (كما هو موضح في الخطوة 2) و resuspend في 1 مل من 50 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 8.2)، 1 M اليوريا. إعداد محلول المخزون من الليزيل endoproteinبورصة عمان (ليز-C) في الماء بتركيز 2 ميكروغرام / ميكرولتر وإضافة 5 ميكرولتر إلى حل البروتين. احتضان الخليط لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ضمان تركيز النهائي ليز-C هو 10 نانوغرام / ميكرولتر ونسبة البروتين إلى LysC (ث / ث) هو 1/50 و 1/200. في resuspend 20 ميكروغرام التسلسل الصف التربسين في 40 ميكرولتر من 50 ملي حمض الخليك، إضافة 5 ميكرولتر (10 ميكروغرام التربسين) إلى ليز-C هضم، واحتضان لمدة 6 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام نفس تركيز الأنزيم البروتيني والبروتيني نسب إلى البروتين لليز-C كما تستخدم لالتربسين.

6. عكس المرحلة الببتيد استخراج

1. يحمض الببتيدات بإضافة حمض trifluoroacetic (TFA) إلى تركيز النهائي من 0.5٪ (الرقم الهيدروجيني ≈ 2). إرفاق العمود C18 إلى مشعب الاستخراج. استخدام أعلى معدل تدفق ممكن لجميع الخطوات ما عدا التحميل وشطف من الببتيدات.
2. العمود الرطب مع 6 مل أسيتونتريل (ACN). غسل العمود مع 6 مل 80٪ ACN، TFA 0.1٪، ثم تتوازن مع 6 مل 0.1٪ TFA. لا تسمح للالعمود لتجف بين الخطوات.
3. وقف الضغط فراغ وتحميل 500 ميكروغرام من الببتيدات على العمود بمعدل تدفق ما يقرب من 1 مل / دقيقة. مرة واحدة وقد الببتيدات منضم إلى عمود، إعادة تشغيل فراغ ويغسل مع 6 مل 0.1٪ TFA، ثم مع 3 مل من حمض الستريك العازلة (0.09 M حمض الستريك، 0.23 M نا ₂ هبو _4، ودرجة الحموضة 5.5).
   ملاحظة: يمكن أن توصف كميات الببتيد العالي ولكن يجب أن يكون العمود C18 قدرة ملزمة على الأقل شقين أعلى من كمية الببتيد لتجنب فقدان العينة.

7. في عمود الببتيد وصفها من قبل انتقاصية Dimethylation (ريدي وصفها)

تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء الكيميائية كما يتم تحريرها سيانيد الهيدروجين في تركيز منخفض أثناء عملية وضع العلامات.

1. إعداد 12 مل من "النور" و "الثقيل" مخازن ريدي لميثيلات الأمينات الحرة الببتيد. يتكون عازلة ريدي ضوء 0.8٪ الفورمالديهايد و0.12 M cyanoborohydride الصوديوم تحمل الهيدروجين في الEIR توزيع النظائر الطبيعية في المنطقة العازلة حامض الستريك. يتكون عازلة ريدي الثقيلة من 0.8٪ الفورمالديهايد بالديوتيريوم و0.12 M بالديوتيريوم cyanoborohydride الصوديوم العازلة في حامض الستريك.
2. احتضان عمود يحتوي على الببتيدات بإضافة 10 مل إما خفيفة أو ثقيلة عازلة ريدي إلى الأعمدة التي تحتوي على الببتيد في معدل التدفق من 1 مل / دقيقة، وتكرار لضمان وضع العلامات كاملة. غسل العمود مع 6 مل 0.1٪ TFA ثم مع حمض الخليك 1 مل 0.5٪.
3. وقف فراغ وأزل الببتيدات وصفت الأولى مع 1 مل 40٪ ACN، حمض الخليك 0.5٪، ثم مع 1 مل 80٪ ACN، حمض الخليك 0.5٪ باستخدام معدل تدفق ما يقرب من 0.5 مل / دقيقة. إذا رغبت في ذلك، وقياس كفاءة التوسيم العينات الفردية عن طريق قياس الطيف الكتلي قبل خلط العينات الثقيلة والخفيفة (انظر "نتائج الممثل"). مزيج 1:01 عينات الببتيد الثقيلة والخفيفة التي تحمل علامات ليكون كميا بواسطة مطياف الكتلة.

8. خليط الببتيد منفصلة بواسطة الحموضة بسيطة عكس المرحلة (BPRP) اللوني </ ع>

الرقم الهيدروجيني الأساسية عكس المرحلة (BPRP) اللوني للفصل بين خليط الببتيد إلى كسور متعددة، التي يتم تحليلها بشكل مستقل من قبل LC-MS/MS لزيادة التغطية بروتيوم.

1. يجزئ الخليط الببتيد على عمود C18-HPLC عن طريق تطبيق التدرج في زيادة تركيز ACN في 10 ملي بيكربونات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 8). تبدأ مع 5٪ (ت / ت) ACN لمدة 5 دقائق، وزيادة إلى 35٪ في ACN 60 دقيقة، ثم إلى 90٪ في ACN 1 دقيقة. الإبقاء على ACN 90٪ ​​لمدة 4 دقائق قبل تخفيض ACN إلى 5٪ لإعادة توازن-العمود لمدة 9 دقائق. جمع 96 أجزاء من حجم مساو في لوحة 96 جيدا (A1 إلى H12). رصد تجزئة باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية في 220 نانومتر بينما الببتيدات ويبلغ حجمه قبالة العمود (10-70 دقيقة لظروف وصفها هنا).
2. الجمع بين الكسور من الآبار A1، C1، E1، وG1 (جزء A1)، من الآبار B1، D1، F1، وH1 (جزء B1)، من الآبار A2، C2، E2، وG2 (جزء A2) وفقا لذلك ل المتبقية الكسور. إزالة solvenر باستخدام جهاز للطرد المركزي فراغ. الببتيدات في resuspend من الكسور A1، B2، A3، B4، A5، B6، A7، B8، A9، B10، A11، و B12 في 130 ميكرولتر من 1٪ M urea/0.5 TFA وتنقية باستخدام StageTips كما هو موضح في الخطوة 9. مخزن الكسور B1، A2، B3، A4، B5، A6، B7، A8، B9، A10، B11، وA12 في -20 درجة مئوية.

9. تنقية الببتيدات التي كتبها stop الذهاب واستخراج (StageTips)

إعداد ^C18-7 StageTip microcolumns بواسطة التعبئة 200 ميكرولتر ماصة نصائح مع اثنين من C18 الأقراص مع القطر الداخلي (ID) من 1.07 مم. وضع المرحلة نصائح في أنابيب إيبندورف. استخدام ميكروسنتريفوج نصائح لغسل مع 130 ميكرولتر من الميثانول، ثم 130 UL 80٪ ACN، حمض الخليك 0.5٪. تتوازن مع 130 ميكرولتر StageTips TFA 0.1٪. نقل خليط الببتيد لStageTips ويغسل مع 130 ميكرولتر 0.1٪ TFA، ثم 40 ميكرولتر 0.1٪ TFA، ثم 40 ميكرولتر 0.5٪ حامض الخليك. أزل الببتيدات الأولى مع 20 ميكرولتر 40٪ ACN، حمض الخليك 0.5٪، ثم 20 ميكرولتر 80٪ ACN، حمض الخليك 0.5٪. الجمع بين eluates لالثاني الجافة عن طريق الترشيح فراغ.

10. LC-MS/MS Microcapillary

1. حل الببتيدات في 1-5 ميكرولتر حمض الفورميك 5٪، 5٪ ACN إلى تركيز من حوالي 1 ميكروغرام / ميكرولتر. حل ~ 1 ميكروغرام الببتيدات على 100 ميكرون × 20 سم العمود تطبيق المرحلة HPLC مع التدرج من 6-22٪ في ACN حمض الفورميك 0.125٪ عكس C18-أكثر من 75 أو 100 دقيقة بمعدل تدفق 300 ~ NL / دقيقة.
2. تحديد الببتيدات باستخدام LTQ Orbitrap VELOS ¹² أو ما شابه ذلك السائل منصة الطيف اللوني الشامل مع مطياف الكتلة توفير درجة عالية من الدقة ودقة عالية الشامل. تعمل مطياف الكتلة في وضع تعتمد على البيانات مع كامل MS الفحص (قرار من 60،000) المكتسبة في محلل Orbitrap. توليد فخ ايون الخطي MS / MS الأطياف ل20 الأيونات الأكثر وفرة في الكشف عن MS الطيف الكامل. تعيين التلقائي السيطرة (AGC) الأهداف إلى 1 × 10 ⁶ لMS كاملة و 2،000 لMS / MS. تعيين الحد الأقصى مرات تراكم أيون إلى 1،000 مللي ثانيةلMS و 150 ميللي ثانية للMS / MS. استبعاد مجزأة أيونات الببتيد السلائف من مزيد من التحديد من MS / MS ل20-60 ثانية.

11. MS / MS الحصول على البيانات

تحديد الببتيدات من خلال مقارنة MS / MS الأطياف ملفات RAW إلى قاعدة بيانات النظري مع خوارزمية مثل SEQUEST ⁸ باستخدام هذه المعايير (الجدول 1).

الجدول 1. الببتيد قاعدة بيانات البحث معلمات.

1. مرشح الببتيدات إلى 1٪ في معدل اكتشاف كاذبة مع أسلوب مثل ⁹ استراتيجية الهدف شرك باستخدام قاعدة بيانات للإطارات القراءة المفتوحة في التوجهات الفعلية وعكسه.

12. الببتيد الكمي

حساب مجالات أزواج الثقيلة والخفيفة من MS1 استخراج أيون الاستشرابية (مناطق ذروة MS1) والببتيد إشارة إلى الضوضاء (S / N) النسب ^10. وتشمل أزواج الببتيد فقط عندما متوسطها إشارة إلى أمة الإسلامنسبة حد ذاته هو فوق الخامسة. قياس الوفرة النسبية من الببتيد في اثنين من العينات ونسبة MS1 مناطق ذروة الإصدارات الثقيلة والخفيفة من نفس الببتيد (MS1 نسبة المساحة الذروة). حساب تركيزات البروتين النسبية بأنه نسبة منطقة ذروة MS1 وسيطة لجميع الببتيدات في البروتين.

قمنا بتقييم دقة، والدقة، واستنساخ لوضع العلامات ريدي باستخدام خميرة الخباز وكلوستريديوم phytofermentans لست] خلية كاملة. نحن كميا لأول مرة ريدي كفاءة وسم مزيج من C. phytofermentans لست] البروتين من السليلوز (المسمى الثقيلة، H) والجلوكوز (التسمية ضوء، L) الثقافات. عندما تمت تصفيتها إلى 1٪ الببتيد معدل اكتشاف كاذبة، الواردة هذه العينة 11،194 متواليات الببتيد فريدة من نوعها مع 98٪ كفاءة وضع العلامات ريدي. غير المجزأ S. وصفت الخباز البروتين المحللة بالمثل مع H أو L الكواشف، وخلط في نسب مختلفة، وتحليلها. الاختلافات التعبير البروتين (تسجيل 2 (متوسط ​​المناطق الذروة MS1)) تعكس بتكاثر النسب التي كانت مختلطة H و L العينات عبر مجموعة واسعة من نسب خلط (الشكل 3). على وجه التحديد، تم قياس أضعاف تغيير 99٪ من البروتينات بأنها أصغر من 1.6 أضعاف لعينات مختلطة 1:1. في1:10 10:01 والعينات، وكانت 99٪ من البروتينات داخل 3.8 أضعاف من نسبة المتوقع، والتي تبين زيادة في الانحراف المعياري في أكبر مسافة من 1:1 الخليط. عندما تم تطبيق وضع العلامات ريدي إلى كلوستريديوم phytofermentans بروتيوم، ونحن كميا أكثر من 2،000 البروتينات مع 94٪ من البروتينات قياسها ضمن مستويات 2 أضعاف للثقافات تكرار المتزايد على الجلوكوز (الشكل 4A). البروتين أضعاف التغييرات للأزواج مكررة من الثقافات (الجلوكوز مقابل السليلوز) أيضا كانت مرتبطة إلى حد كبير (ص 2 = 0.82)، (الشكل 4B). S. مقارنات الخباز (الشكل 3) هي من ثقافة واحدة، وبالتالي تظهر استنساخ التقنية من البروتينات الكمي ريدي القائمة. C. phytofermentans القياسات (أرقام 4A، B) مقارنة تكرار الثقافات بحيث تمثل كل الخلافات التعبير خطأ في القياس والاختلاف البيولوجي بين الثقافات. معا، وهذه التجاربدعم الإدلاء بالبيانات التي ريدي البروتينات هي طريقة دقيقة وقابلة للتكرار لقياس الفروق بين البروتين التعبير عينات معقدة.

الشكل 1. dimethylation الاختزالية للالببتيدات باستخدام الكواشف الثقيلة والخفيفة لdimethylate الأمينات الحرة. نفس الببتيد المسمى مع الثقيلة مقابل الكواشف الضوء لديه +6.0377 دا التحول الشامل في الأمينات الحرة. هو المسمى الببتيد هو موضح هنا سواء على N-محطة وعلى الجانب سلسلة يسين. الصورة مقتبسة من المرجع 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2 لمحة عامة عن بروتوكول لالبروتيوميات الكمي dimethylation الاختزالية. أرقام الأحمر أعلاه السهام تتوافق مع الخطوات المذكورة في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. تقييم وضع العلامات ريدي باستخدام خميرة الخباز لست] خلية كاملة. وصفت عينات من ثقافة واحدة مع أي الثقيلة (H) وخفيفة (L) الكواشف، وخلط في النسب المختلفة (1H: 10L، 1H: 5L، 1H: 2L، 1H: 1L، 2H: 1L، 5H: 1L، و 10H: 1L)، والاختلافات بين بروتين H و L عينات وتم قياس كمية كما نسب سجل متوسط ​​2 منطقة ذروة MS1 (تسجيل 2 نسبة H / L). وR 2 قيمة خط الاتجاه الخطي من خلال جميع البياناتكان نقطة 0.96 (الخط الأسود)؛ كان ارتباط بيرسون 0.98. حدود الثقة (الخطوط الحمراء) تظهر مسافة عمودية مطلقة من خط الاتجاه من خلاله تم العثور على 95٪ من نقاط البيانات لكل عينة. الصورة مقتبسة من المرجع 12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. الكمي لريدي المسمى كلوستريديوم phytofermentans البروتينات من الثقافات متزايد من مصادر الكربون مختلفة. أ) التعبير البروتين في الجلوكوز الثقافة النسبي لثقافة الجلوكوز تكرار، ثقافة هيميسيلولوز، وثقافة السليلوز. جزء من البروتينات أعرب ضمن مستويات شقين: الجلوكوز الجلوكوز (94٪)، والجلوكوز، هيميسيلولوز (80٪)، وglucosالإلكترونية السليلوز (49٪). B) أضعاف التغيرات في تعبير البروتين للجلوكوز مقابل الثقافات السليلوز ترتبط إلى حد كبير (ص 2 = 0.82) للأزواج مكررة من الثقافات. صور مقتبسة من المرجع 12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة أو الصراعات الأخرى ذات الاهتمام.