Method Article

البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

DOI:

10.3791/51416

⸱

July 1st, 2014

 , 
1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هي استراتيجية غير مكلفة السريع لدقيقة الشامل القائم على البروتينات الطيف الكمي. نحن هنا لشرح طريقة قوية لإعداد وتحليل مخاليط البروتين باستخدام نهج ريدي التي يمكن تطبيقها على ما يقرب من أي نوع العينة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هو وسيلة لقياس بدقة الفروق بين البروتين التعبير العينات باستخدام مطياف الكتلة. يتم تنفيذ وسم ريدي باستخدام إما العادية (الضوء) أو بالديوتيريوم (الثقيلة) أشكال الفورمالديهايد والصوديوم cyanoborohydride إضافة إلى اثنين من مجموعات الميثيل إلى كل أمين الحرة. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول قوية لوضع العلامات وريدي مقارنة كمية من خليط من البروتين المعقدة. يتم هضمها عينات البروتين للمقارنة في الببتيدات، وصفت لتنفيذ إما خفيفة أو ثقيلة الميثيل به، مختلطة، وشارك في تحليل من قبل LC-MS/MS. وكميا وفرة البروتين النسبية بمقارنة المناطق الذروة ايون اللوني من الإصدارات الثقيلة والخفيفة وصفت من الببتيد المكونة المستخرجة من كامل أطياف MS. الطريقة الموضحة هنا يشمل إعداد عينة من عكس المرحلة استخراج المرحلة الصلبة، ووضع العلامات ريدي على عمود من الببتيدات، الببتيد تجزئة من قبل القس درجة الحموضة الأساسيةersed المرحلة (BPRP) اللوني، وStageTip تنقية الببتيد. نحن نناقش مزايا وقيود وضع العلامات ريدي فيما يتعلق بأساليب أخرى لإدماج النظائر مستقرة. نسلط الضوء تطبيقات جديدة باستخدام الوسم ريدي كوسيلة سريعة وغير مكلفة، ودقيقة للمقارنة بين تركيزات البروتين في أي نوع تقريبا من العينة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس الاختلافات تركيز العديد من البروتينات المعقدة بين العينات هو التحدي الرئيسي في البروتينات. على نحو متزايد، ويجري ذلك عن طريق وضع العلامات البروتينات في كل عينة مع العلامات النظائر المختلفة، والجمع بين العينات، واستخدام مطياف الكتلة لقياس الاختلافات التركيز. توجد عدة طرق لوضع العلامات النظائر مستقرة من البروتينات والببتيدات 15 N وضع العلامات 1 و 2 SILAC إدخال تسميات النظائر عملية الأيض في الجسم الحي، في حين ICAT 3، 4 iTRAQ، والحد من dimethylation 5 إضافة علامات النظائر مستقرة بعد استخراج البروتين والهضم. بين هذه الأساليب، dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: هذه الطريقة تم وصفها سابقا 12.

1. عزل بروتين

إعداد 1 ملغ من البروتين الخلوية من قبل خلايا lysing، ويفضل عن طريق الطرق الفيزيائية مثل الصحافة الفرنسية، وحبة الضرب، أو صوتنة. تجنب بوساطة الليزوزيم الخلية تحلل لأن الانزيم سوف نخلط قياسات مطياف الكتلة.

2. الهطول TCA من البروتينات

إضافة 1 حجم حمض الخليك ثلاثي الكلور (TCA) لبروتين 4 مجلدات والبرد ع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتقييم دقة، والدقة، واستنساخ لوضع العلامات ريدي باستخدام خميرة الخباز وكلوستريديوم phytofermentans لست] خلية كاملة. نحن كميا لأول مرة ريدي كفاءة وسم مزيج من C. phytofermentans لست] البروتين من السليلوز (المسمى الثقيلة، H) والجلوكوز (التسمية ضوء، L) الثقافات. عندما تمت تصفيتها إلى 1٪ الببتيد معدل اكتشاف كاذبة، الواردة هذه العينة 11،194 متواليات الببتيد فريدة من نوعها مع 98٪ كفاءة وضع العلامات ريدي. غير المجزأ S. وصفت الخباز البروتين المحللة .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدة نقاط تجعل وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات باستخدام dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) وسيلة جذابة للالبروتيوميات الكمية: الكواشف غير مكلفة وضع العلامات (تكلف الكواشف أقل من 1 دولار لكل عينة)، ومعدل رد فعل سريع (~ 10 دقيقة)، وغياب المنتجات الجانبية، وارتفاع استنساخ (الأرقام 3، 4)، منتجات التفاعل مستقرة، والقدرة على استخدام أي الأنزيم البروتيني، وكفاءة عالية التأين من الببتيدات المسمى. وضع العلامات الكيميائية ريدي هو أيضا من المفيد بالنسبة لوضع ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة أو الصراعات الأخرى ذات الاهتمام.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر SP Gygi و GM Church على المساعدة والتوجيه. تم دعم هذا العمل من قبل رئيس التميز في المركز الوطني للدراسات العليا في ACT.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض ثلاثي كلورو أسيتيكسيجما ألدريتشT9159ترسيب البروتين
الأسيتونسيجما ألدريتش650501ترسيب البروتين
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتش71736الطبيعة ، تقليل البروتين
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتشS8045الطبيعة ، تقليل البروتين
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43816يحول ، يقلل ، مثبط بروتين الألكلات
كوكتيل صغيرروش4693124001الطبيعة ، يقلل من البروتين
يودوأسيتاميدسيجما ألدريتشI6125بروتين الألكيلات
HEPESSigma-AldrichH7523التعليق ، استخراج ، تسمية البروتين
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشC5670إعادة تعليق البروتين
Lysyl EndoproteaseWako Chemicals129-02541هضم البروتين
درجة التربسينPromegaV5111هضم البروتين
حمض الخليكسيجما ألدريتش320099هضم البروتين
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتش299537استخراج الببتيد في المرحلة العكسية
tC18 خراطيش Sep-Pak C18المياهWAT054960استخراج الببتيد في المرحلة العكسية
مشعب الاستخراجالمياهWAT200609استخراج الببتيد في المرحلة العكسية
الأسيتونيتريلسيجما ألدريتش14261
الفورمالديهايدسيجما ألدريتش252549" ضوء" وضع العلامات على الببتيد
CyanoborohydrideSigma-Aldrich71435" ضوء" وضع العلامات على الببتيد
الفورمالديهايدالديوتيرات سيجما ألدريتش492620" ثقيل" وضع العلامات على الببتيد
نظائر CDN السيانوبورودوتيريد الصوديومD-1797" ثقيل" وضع العلامات على الببتيد
MESSigma-AldrichM3671ببتيد وضع العلامات
على العمود C18-HPLC (4.6 × 250 مم ، 5 وميكرو ؛ حجم الجسيمات م)Agilent770450-902اللونيات الأساسية ذات الطور المعاكس لدرجة
الحموضة حمض الفورميكسيجما ألدريتش399388أقراص
C18 Emporeالمختلفة 3M14-386-3 & nbsp ؛نصائح المرحلة
الميثانولسيجما ألدريتش494437المرحلة
البروتياز الكامل تسلسل نصائح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reductive DimethylationStable Isotope LabelingQuantitative ProteomicsPeptide FractionationLC MS MS AnalysisSolid Phase ExtractionBasic pH Reversed Phase ChromatographyStageTip PurificationMass Spectrometry QuantificationProtein Abundance Comparison

Related Articles