عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

Samantha Khoury; Pamela Ajuyah; Nham Tran

doi:10.3791/51443

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

18K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51443

⸱

يونيو 19, 2014

Samantha Khoury¹ , Pamela Ajuyah¹ , Nham Tran²^,³

¹School of Medical and Molecular Biosciences, Faculty of Science, University of Technology, Sydney, ²Centre for Health Technologies, Faculty of Engineering and Information Technology, University of Technology, Sydney, ³The Sydney Head and Neck Cancer Institute, Sydney Cancer Centre, Royal Prince Alfred Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستخراج الرنا صغيرة من مصل الإنسان. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لعزل microRNAs من مصل السرطان للاستخدام في صفائف الحمض النووي وأيضا singleplex PCR الكمي. بروتوكول يستخدم الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف مع بعض التعديلات لانتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية.

الملخص

تحليل الحمض النووي الريبي والتعبير هو سمة مشتركة في العديد من المختبرات. أهمية هو ظهور الرنا الصغيرة مثل microRNAs، والتي توجد في خلايا الثدييات. هذه الرناوات الصغيرة هي المنظمين الجينات القوية السيطرة على الممرات الحيوية مثل النمو والتنمية والموت والكثير من الاهتمام وقد وجهت في التعبير عنها في سوائل الجسم. ويرجع ذلك إلى التقلبات في الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان وإمكانية تطبيقها والمؤشرات الحيوية مصل هذا. ومع ذلك، فإن تحليل ميرنا التعبير في المصل قد يكون مشكلة. في معظم الحالات من كمية المصل يحد ويحتوي على كميات قليلة من المصل الحمض النووي الريبي مجموع، والتي تشكل الرنا صغيرة فقط 0.4-0.5٪ ^1. وبالتالي عزل كميات كافية من نوعية الحمض النووي الريبي من المصل يشكل تحديا كبيرا للباحثين اليوم. في هذه الورقة التقنية، ونحن لشرح الطريقة التي يستخدم فقط 400 ميكرولتر من مصل الإنسان للحصول على الحمض النووي الريبي كافية لصفائف إما DNA أو تحليل QPCR. وعلىdvantages هذه الطريقة هي بساطتها والقدرة على انتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية. لا يتطلب أي أعمدة متخصصة لتنقية الرنا صغيرة وتستخدم الكواشف العامة والأجهزة الموجودة في المختبرات المشتركة. يستخدم أسلوب لدينا قفل جل المرحلة للقضاء على التلوث الفينول بينما في نفس الوقت جودة عالية الغلة الحمض النووي الريبي. ونحن نقدم أيضا خطوة إضافية لمواصلة إزالة جميع الملوثات خلال الخطوة العزلة. هذا البروتوكول هو فعالة جدا في عزل الحمض النووي الريبي غلة إجمالية تصل إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر من المصل ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لالأنسجة البيولوجية الأخرى.

المقدمة

في السنوات الأخيرة، كان هناك دفع المتزايد لاكتشاف مؤشرات حيوية جديدة للكشف المبكر عن الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تركز الكثير من الاهتمام على استخدام الرنا الصغيرة مثل microRNAs ² (miRNAs أو ميرس) كعلامات محتملة. تم العثور على هذه الرناوات الصغيرة في سوائل الجسم مثل الدم والدراسات أظهرت أنها مقاومة للتدهور ومستقرة على مجموعة من الظروف البيئية المتباينة ^3. ونظرا لهذه الميزات miRNAs، المصل أو المتداولة هي العلامات البيولوجية مثالية ^{4، 5.} حاليا هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لعزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل البيولوجية. يستخدم النهج الأول التكنولوجيا القائمة على عمود لربط وأزل الرنا صغ....