وقد تم تطوير نموذج الفأر من بالمنظار إعادة الإعمار قاعدة الجمجمة البشرية التي تخلق واجهة نصف نافذ بين الدماغ والأنف باستخدام الطعوم المخاطية الأنفية. يسمح هذا الأسلوب للباحثين لدراسة التسليم إلى النظام العصبي المركزي للعلاجات عالية الوزن الجزيئي التي تستبعد خلاف ذلك حاجز الدم في الدماغ عندما تدار بشكل منتظم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
منتبذ المخاطي Engrafting إجراءات تسليم المخدرات مباشرة الى المخ في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وأعاق إيصال العلاجات إلى الدماغ عن وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB) الذي يقيد مرور مركبات الوزن الجزيئي القطبية وارتفاع من مجرى الدم وإلى أنسجة المخ. وقد تحقق بعض النجاح التسليم المباشر في البشر من خلال زرع القسطرة عبر الجمجمة؛ ولكن هذا الأسلوب هو الغازية للغاية ويترافق مع مضاعفات عديدة. وثمة بديل أقل الغازية لتكون جرعة الدماغ من خلال زرع جراحيا، غشاء نصف نفوذ مثل الغشاء المخاطي للأنف الذي يستخدم لإصلاح العيوب الجمجمة قاعدة التالية بالمنظار transnasal جراحة إزالة ورم في البشر. نقل المخدرات على الرغم من أن هذا الغشاء تجاوز بشكل فعال ومنتشر BBB مباشرة الى الدماغ والسائل المخي الشوكي. مستوحاة من هذا النهج، وقد وضعت نهجا الجراحية في الفئران التي تستخدم الأغشية المخاطية المغروسة المانحة الحاجز أكثر من خارج القحف الجراحية عيب BBB. وقد تبين هذا النموذج على نحو فعالتسمح بمرور المركبات عالية الوزن الجزيئي في الدماغ. منذ العديد من المرشحين المخدرات غير قادرين على عبور BBB، وهذا النموذج هو قيمة لأداء اختبار قبل السريرية لعلاجات جديدة للأمراض العصبية والنفسية.
المقدمة
علاج الأمراض العصبية والنفسية وأعاقت بشدة من وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB) الذي يمنع أكثر من 95٪ من جميع وكلاء الدوائية المحتملة من الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي 1-3. على سبيل المثال، الدبقية مشتقة عصبية عامل (GDNF) وقد تبين أن تكون فعالة في علاج مرض باركنسون عند حقنه مباشرة في الدماغ، ولكن غير فعالة عند تسليمها بشكل منتظم لأنه لا يمكن اختراق BBB 4-6.
العديد من اقترب وضعت في محاولة للتحايل على هذه المشكلة. وقد أظهرت تحسنا في تسليم النظامية من neurotheraputics باستخدام تقارن المخدرات التي تحتوي على الأجسام المضادة للبروتينات النقل انتقائية تقع على البطانة الشعرية الدماغ؛ ومع ذلك لم يظهر هذا الأسلوب لتكون قابلة للتطبيق لمجموعة واسعة من المستحضرات الصيدلانية 7،8. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام افتتاح الاسموزي من BBB العيادةحليف، ومع ذلك تعاني هذه الطريقة من الجرعات النظامية المخدرات في مقابل تسليم أكثر مباشرة إلى منطقة الدماغ التي تهم 9. وقد بذلت جهود كبيرة في تحسين تسليم transnasal على أمل تستهدف الدماغ 10-12 مباشرة. على الرغم من تحقيق بعض النجاح، وفقط تم الحصول على نتائج قاطعة عن الأدوية التي تمتلك مستقبلات الذاتية، مثل الأنسولين 13،14. وعلاوة على ذلك كانت آلية التسليم transnasal مثيرة للجدل مع أدلة تشير إلى دخول غير مباشرة الى الدماغ عن طريق حاسة الشم امتصاص الخلايا العصبية أو من خلال مجرى الدم 11. وقد تحقق المباشر، والتسليم عبر الجمجمة باستخدام القسطرة زرع، ولكن هذا الإجراء هو الغازية للغاية ويرتبط مع العديد من المضاعفات 15،16. حتى الآن، لا يوجد، طريقة مينيملي العامة لتقديم مركبات عالية الوزن الجزيئي في الدماغ.
الواردة في هذه الوثيقة هو إجراء العمليات الجراحية الفئرانالذي يخلق واجهة نصف نافذ مع الدماغ. ويتم إنجاز ذلك عن طريق engrafting على الغشاء المخاطي ازدراع 17 على عيب حج القحف الجراحية في الماوس. باستخدام هذا الإجراء فقد تبين أن مركبات قابلة للذوبان تصل إلى 500 كيلو دالتون يمكن تسليمها في النظام العصبي المركزي (الدماغ مباشرة في حمة وكذلك في السائل النخاعي) في كل وقت والوزن الجزيئي تعتمد الأزياء 18. هذا الأسلوب من تجاوز BBB هو نموذج لإصلاح عيب قاعدة الجمجمة في البشر والذي يستخدم ترقيع الغشاء المخاطي أوعية دموية لإصلاح ثقوب في الجمجمة التالية transnasal الجراحة بالمنظار 19،20.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
قبل الجراحة تأكد من الموافقة على جميع الإجراءات التي تتم عن طريق IACUC وأية سلطات أخلاقية أو قانونية إضافية واستخدام الممارسات علاج الحيوان إنسانية. وهذا يشمل استخدام الظروف الجراحة المعقمة، التخدير باستخدام الماوس وافق IACUC الأسلوب، التشحيم عيون الفئران مع مرهم الطبيب البيطري أثناء الجراحة، وتوفير الرعاية بعد الجراحة. لا المضي قدما في عملية جراحية إذا كان هناك أي سؤال حول ما إذا تمت الموافقة على جوانب الإجراء. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تؤدى في هذه الوثيقة من قبل لجنة جامعة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بوسطن.
1. إعداد الحيوانات واللوازم الجراحية
- الأوتوكلاف كل أداة جراحية التي سيتم استخدامها أثناء الجراحة.
- تأكد من الموافقة على جميع التقنيات التي سيتم تنفيذها من قبل الهيئات التنظيمية الحيوان.
2. حصاد المخاطي الكسب غير المشروع
- اختار الماوس متطابقة وراثيا من العمر مماثلة لالماوس التجريبية والموت ببطء في طريقة IACUC المعتمدة (هنا: الاختناق isoflurane وتليها خلع عنق الرحم).
- باستخدام مقص جراحي، وإزالة الجلد حول منطقة الأنف من الرأس الماوس تعريض الجمجمة.
- مع هوائي الحفر، مع علامة ثلاثة خطوط اثنان منها الجناح أفقيا منطقة الأنف وثالثة تمشيا مع عيون الذي يربط بين خطين عموديا.
- انتقل لأسفل البطني من أجل فصل الحاجز الأنفي من الأنسجة المحيطة بها. وهناك مسار أوسع منع تلف الغشاء المخاطي لكنه سيجعل الأمر أكثر صعوبة أيضا لعزل الغشاء. ينصح قطع الضيق أقرب إلى خط الوسط.
- استخدام مقص لقطع الحاجز خالية من أي نوع من الأنسجة انضمت إليها وتخزينها في محلول ملحي معقم. في هذا الوقت يمكن تنظيفها الكسب غير المشروع حتى إزالة أي نوع من الأنسجة المتصلة. الوضع المثالي هو أن يكون الأغشية المخاطية التالفة تعرض على جانبي الحاجز الغضروف. واحد غرامالخلف ان نورد الغشاء لمدة الفئران وفرت المساحة السطحية للغشاء هي كافية لتغطية مواقع حج القحف. فمن المستحسن أن يستخدم الكسب غير المشروع في أسرع وقت ممكن والعائدات الباحث إلى الخطوة 3 حالما يتم عزل الكسب غير المشروع.
3. زرع الجراحي لالمخاطي الكسب غير المشروع
- باستخدام والإجراءات الجراحية الفئران العقيم القياسية، تخدير وجبل ماوس في إطار stereological. استخدام ما يقرب من 2٪ isoflurane والأكسجين النقي في استخدام آلة التخدير القوارض.
- لشل حركة الماوس في جهاز التجسيمي بقضبان الأذن والأنف حامل. تطبيق مرهم للعين للعيون وفرك فروة الرأس مع بتدين و 75٪ من الإيثانول لمدة ثلاث جولات. باستخدام مقص أو الانتهازي الشعر، إزالة الفراء على رأسه. فضح الجمجمة بشفرة حلاقة ومستوى الرأس. إجراء حج القحف فوق موقع الدماغ التي سيتم مداوي. على سبيل المثال، عند استهداف المخطط قطع 1.25 ملمقطر ثقب دائري في الجمجمة (تركزت في AP: 1.00 مم؛ ML: 0.88 مم) باستخدام الحفر بالهواء المضغوط. الرطب منطقة حفر مع ملحي معقم واستخدام شفرة حلاقة لإزالة الجمجمة.
- إزالة بعناية الجافية باستخدام غيض من إبرة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يمكن أن يتحقق من خلال تطبيق الحد الأدنى من الأنسجة لاصقة على سطح الجافية رطبة. مرة واحدة وشددت هذه الطبقة، الحركة الجانبية مع طرف شفرة حلاقة يمكن استخدامها لإزالة الغشاء.
- وضع الغشاء المخاطي فوق سطح الدماغ مع الحرص الشديد للحفاظ على الجانب الظهارية التي تواجه بعيدا عن الجرح. من الأفضل القيام بذلك عن طريق نقل الحاجز بأكمله على سطح الجمجمة المجاورة لموقع حج القحف مع ملاقط. استخدام غيض من زوج من مقص جراحي، وسحب الغشاء الخروج من الغضروف وعلى الجمجمة والدماغ السطح. لا تدع غشاء تجف أو لمسها مع أي مادة ماصة. الكسب غير المشروع يجب أن تتداخل بسخاء كل الحواف العظمية من ليالي حج القحفالفنار.
- تغطية الكسب غير المشروع مع قطعة معقمة من النتريل. هذا يعمل على منع التصاق الجلد إلى الكسب غير المشروع خلال الشفاء. والنتريل يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية الغشاء المخاطي بأكمله. تقليم الغشاء المفرطة إذا لزم الأمر. تجنب أي حركة النتريل مرة واحدة قد حان في اتصال مع الكسب غير المشروع.
- إغلاق الجلد مع تشغيل 5-0 خياطة العقيمة والسماح للماوس على التعافي لمدة 3-7 أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. والحرص على عدم التشويش على حاجز النتريل أو الكسب غير المشروع المخاطية أثناء إغلاق الجلد.
4. إدارة الجرعات الحل
- بعد تأمين الماوس تخدير في إطار التجسيمي، وقطع مع مقص خياطة وإزالة الجلد الزائد حول الجمجمة.
- إزالة حاجز النتريل وتنظيف سطح الجمجمة. استخدام العقيمة المالحة والقطن مسحات لتنظيف المنطقة حتى الكسب غير المشروع مرئيا. قد يكون من الضروري لخفض الكسب غير المشروع بشفرة الحلاقة لو نمت أكبر من دesired مساحة السطح.
- إذا كانت التجربة سوف تكون أطول من بضعة أيام، وأنه من الحكمة لزرع ما لا يقل عن اثنين من مسامير الجمجمة لتعزيز عملية الزرع الرأس.
- وضع أعلى بكثير من الكسب غير المشروع بحيث حواف على اتصال مع الجمجمة. تطبيق لاصقة cyanoacrylate عند تقاطع بين البئر والجمجمة. ملء البئر مع ملحي معقم وتحقق للتأكد من عدم وجود تسرب. مصنوعة من الآبار الإبر قطع حقنة.
- تطبيق الأسمنت العظام في الجمجمة لتأمين البئر في المكان.
- إزالة الملوحة من البئر مع ماصة. يغسل عدة مرات للتحقق جيدا لم تسربت بأن لاصقة فيها إضافة إلى الحل المنشود؛ في هذه الحالة يتم استخدام 50 ميكرولتر من ديكستران الفلورسنت. ومن المتوقع أن المركبات القابلة للذوبان المياه من قطبية مماثلة سوف تتصرف نفس ديكستران. لم يتم استكشافها تسليم مركبات مسعور أو تعليق مع هذا الأسلوب.
- سقف أعلى البئر باستخدام قطعة دائرية من النتريل تأمين لأعلى باستخدام فورية الغراء اللاصق. تأكد من أن لاصق لا تأتي في اتصال مع محتويات جيدا.
5. تحليل Transmucosal التسليم
- بعد المبلغ المطلوب من الوقت قد انقضى، تخدير الماوس وتبادل محتويات جيدا بمحلول صبغة زرقاء ايفان. ويستخدم هذه الصبغة للتحقق من أن الكسب غير المشروع كان سليما.
- بعد 30 دقيقة، تخدير الماوس بشكل كبير، وإزالة محلول الصبغة، والموت ببطء عبر قطع الرأس.
- إزالة يدويا الزرع وإزالة المخ باستخدام مقص جراحي. توخي الحذر للحفاظ الكسب غير المشروع في المكان.
- إزالة مرة واحدة، وتبريد فلاش تجميد الدماغ في حل من الأيزوبيوتان في حمام الثلج الجاف.
- تضمين الدماغ في درجة الحرارة المثلى للقطع (أكتوبر) حل وشريحة في 50 ميكرون.
- وضع شرائح المطلوب مباشرة على شريحة المجهر.
- صورة شريحة باستخدام مجهر الإزهار في أقرب وقت الحل أكتوبر قد جفت.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الحصول على كبيرة بما يكفي الأنف الحاجز ازدراع هو أمر حاسم لخطوات لاحقة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق حفر في الموقع على الجمجمة الماوس المانحة هو مبين في الشكل 1A. وقطع على طول هذا الطريق إنتاج النباتى من حجم كاف كما هو مبين في الشكل 1B. إذا كان عمق الحفر ليست عميقة بما فيه الكفاية، وسوف يكون مبتورا الكسب غير المشروع، وسوف يكون من الصعب الحصول على غشاء كبيرة بما يكفي لتغطية سطح الدماغ. حفر أكثر إبداعا من لا ينصح المسار المقترح لأن أكثر الأنسجة ستبقى على...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوة الأكثر صعوبة من الإجراء الموصوفة هنا هو النقل الناجح للغشاء المخاطي الحجم بشكل كاف على سطح الدماغ. يرصد هذه الخطوة أسهل بكثير إذا كان الحاجز الأنفي تحصد كبيرة بما فيه الكفاية وتنظيفها جيدا. إذا تم اقتطاع جزء بطني من الحاجز، وينبغي الحصول على الكسب غير المشروع الجديدة. يجب أن تكون زاوية الحفر العمودي في الرأس الماوس لضمان أن الغشاء المخاطي ليست تضررت من الحفر. إذا لم يتم اتخاذ مسار الحفر أوسع من المستحسن ستكون أصعب بكثير لإزالة الأنسجة الزائدة التي يتم توصيلها إلى الحاجز. يج...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
بنيامين س بليير MD هو المخترع الرئيسي للطرق تغطي براءات الاختراع المؤقت لتسليم المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة Mcihael J. فوكس للبحوث 2011 الابتكارات الاستجابة السريعة باركنسون برنامج جوائز. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفئران | تاكونيك | C57BL / 6 | |
| Isoflurane | Piramal الرعاية الصحية | ||
| مقص الطالب الناعم | أدوات العلوم الدقيقة | 91461-11 | |
| مثقاب هوائي | MTI Dental | 333-CB | |
| مثقاب | |||
| ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 91106-12 | |
| 0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| طبق البوليسترين بتري | فيشر | 08-757-12 | للتخزين المؤقت لمعقم حبة الكسب غير المشروع |
| أدوات العلوم الدقيقة | 18000-45 | ||
| نظام الأكسجين / الأيزوفلوران | SurgiVet | V720100 | |
| نظام التحكم في درجة الحرارة | Physitemp | TCAT-2LV | |
| أداة تجسيمية للحيوانات الصغيرة | KOPF | موديل 940 | |
| مرهم | |||
| ماكينة حلاقة | |||
| أدوات تطبيق قطنية برؤوس | فيشر | 23-400-106 | |
| 7.5٪ بروفيدون | اليود مقشر جراحي للبيتادين | ||
| 70٪ شفرة جراحية من الإيثانول | |||
| ريشة غير قابلة للصدأ | 2976 # 10 | ||
| مقبض مشرط - # 3 | أدوات العلوم الدقيقة | 10003-12 | |
| 3٪ بيروكسيد | لتنظيف الجمجمة | ||
| لاصق الأنسجة Vetbond | 3M | 1469SB | |
| إبر | Becton و Dickinson and Company | 305176 | إبرة مقطوع ويستخدم أيضا |
| محاقن | بيكتون ، Dickinson and Company | 309597 | |
| قفازات النتريل | Denville Scientific Inc | G4162 | لإغلاق البئر وحماية الكسب غير المشروع |
| 5-0 خيط | |||
| حامل إبرة الطالب هالسي | أدوات العلوم الدقيقة | 91201-13 | |
| لاصق | متاح بشكل مشترك طقم | ||
| أسمنت الأسنان بالغراء الفائق ، 1 رطل ، وردي غير شفاف | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-ميثيل بوتان) | Aldrich | M32631 | لحمام الثلج الجاف |
| الجاف |
المراجع
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
