مقالة منهجية

وهناك طريقة منخفضة التكلفة لتحليل مثل الاستيلاء آخر والحركة في ذبابة الفاكهة

DOI:

10.3791/51460

⸱

فبراير 19, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Franciscan University of Steubenville, 2Department of Computer Science, Franciscan University of Steubenville

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام كاميرا ويب، ومجموعة من البرامج المجانية وغير مكلفة، وأنماط قاطرة في ذبابة الفاكهة السوداء البطن يمكن تحليلها للكشف عن اختلافات في السرعة والمسافة والوقت من الأنشطة الحركية المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت نظم تتبع الفيديو على نطاق واسع لتحليل حركة البطن ذبابة الفاكهة والكشف عن مختلف شذوذ في السلوك الحركي. في حين أن هذه النظم يمكن أن توفر ثروة من المعلومات السلوكية، فإن تكلفة وتعقيد هذه الأنظمة يمكن أن تكون باهظة بالنسبة لكثير من المختبرات. وقد وضعنا مقايسة منخفضة التكلفة لقياس السلوك الحركي والحركة في الاستيلاء D. البطن. يستخدم نظام A-ويب كام لالتقاط الصور التي يمكن معالجتها باستخدام مزيج من البرامج غير مكلفة ومجانية لتتبع نقل المسافة، ومتوسط ​​سرعة الحركة ومدة الحركة خلال فترة زمنية محددة. للتدليل على فائدة هذا النظام، درسنا مجموعة من المسوخ D. البطن، الانفجار تراعي (BS) المشلولين، والتي هي 3-10 مرات أكثر عرضة لنشاط مثل ضبط (SLA) من الذباب نوع البرية. باستخدام هذا النظام الرواية، تمكنا من الكشف عن أن BS mutanر ضجة لا معنى لها (BSS) يسلك المستويات الدنيا للتنقل استكشافية في بيئة رواية من نوع البرية الذباب. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نظام لتحديد أن الميتفورمين المخدرات، والذي يستخدم عادة لعلاج مرض السكري من النوع الثاني، ويقلل من شدة جيش تحرير السودان في المسوخ BS.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا مدة بقائه قصيرة والأدوات الجينية القوية المتاحة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام نموذجا ممتازا عن التحقيق في مسببات الأمراض المختلفة وعلم وظائف الأعضاء الكامنة وراء العمليات البيولوجية المختلفة. في كثير من الحالات، فإنه من المفيد لقياس الآثار التي التلاعب السلوكية أو وراثية أو الدوائية لها على تحرك في هذه الكائنات نموذج 1،2.

وهناك مجموعة متنوعة من الأساليب التي تستخدم عادة لقياس حركة الطيران في يومين أبعاد 3-7. يمكن لهذه الأنظمة تدعم تتبع من الذباب متعددة في وقت واحد ويمكن قياس السرعة، وأطوال مسار السجل وتسجيل نسبة الوقت قد قضى ذبابة تتحرك. تم استخدامها لدراسة الحركة في مجموعة متنوعة من السياقات بما في ذلك آثار المخدرات على تحرك وطبيعة ديمبرافيك الجنسي للذبابة الحركة 6-9. العيب الرئيسي من هذه الأنظمة هو تكلفة تتبع أنظمةتيم أو البرامج المماثلة والكاميرا. في بعض الحالات، وهذا يمكن في تشغيل الآلاف من الدولارات. التكلفة هي مصدر قلق خاص للمختبر التي تحتاج فقط الاستخدام المحدود لمثل هذا النظام، على سبيل المثال، قياس أنماط قاطرة متحولة معزولة حديثا.

وهناك طريقة أبسط ولكن أقل قوة هو استخدام أنظمة الحركة التي سجل استنادا إلى عدد المرات ذبابة يعبر الأشعة تحت الحمراء مسار شعاع ضوء التي يتم وضعها في منتصف أنبوب مغلقة 10،11. بينما مثل هذه الأنظمة يمكن أن تعطي معلومات قيمة عن الحركة ودورات النوم واليقظة، فإنها يمكن أن تزيد أو تنقص من حركة تقدير لأنها تفشل في التقاط المسار الفعلي للالطاير. على سبيل المثال، سوف الذباب الذي يحمل حركة كبيرة في نهايات الأنبوب تسجيل حركة منخفضة كما الذباب على الرغم من أن وسائل إضافية عالية الدقة وقد استخدمت لمحاولة الالتفاف على هذه القيود 12.

أبسط وأرخص زالت الأجهزة التي تقيس geotaxi التسلقق، الحركة الصعودية من الذباب، من خلال أنبوب واحد أو سلسلة من الأنابيب 2،13. بينما مثل هذه الأنظمة هي رخيصة ويمكن التعرف بسهولة العيوب انجذاب بالجاذبية، فإنها تفشل في التقاط جوانب أخرى كثيرة من الحركة التي من شأنها أن تكون ذات فائدة للمحققين.

بالنسبة للعديد من المعامل ومنخفضة التكلفة نظام تحليل قوي وهذا هو بسيطة لانشاء وتشغيل شأنها أن تكون أداة مفيدة لوصف الاختلافات السلوكية في البطن D. السلالات. نحن هنا تصف مقايسة التي يمكن انشاء لأقل من مائتي دولار وقادرة على إعطاء معلومات حول مسار والسرعة ومدة حركة الذبابة. للتدليل على فعالية الفحص، نقدم بيانات تظهر أنه يمكن أن تستخدم لتحديد؛ 1) خلل الحركي في متحولة بانج تراعي (BS) التي هي عرضة للنوبات و2) قدرة الميتفورمين المخدرات، والتي ويستخدم عادة لعلاج مرض السكري من النوع الثاني، للحد من شدة مثل الاستيلاء النشاط (SLA) طن اثنين من المسوخ BS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الفرد للتنقل الذباب الفحص

  1. نقل الذباب من خلال استغلال برفق في قارورة فارغة الفردية وغطاء قارورة مع المكونات القطن. تسمح الذباب على الجلوس دون عائق 20-30 دقيقة قبل المراقبة. من المهم أن لا تخدير الذباب في غضون الساعات قبل الملاحظة السلوكية كما وجدت دراسات سابقة التعرض التخدير يمكن أن يغير السلوك بالمقارنة مع الذباب unanesthetized 14.
  2. بلطف اضغط على ذبابة من القارورة ووضع الذباب الفردية تحت 5 سم القطر بيتري غطاء طبق (5 ملم عالية) مع الشقوق الصغيرة للسماح بمرور الهواء. تضيء من دون مراقبة والذباب باستخدام كاميرا ويب مثبتة فوق طبق بيتري.

2. إعداد الفردية الذباب عن الاستيلاء الفحص

  1. إطعام القديمة الذباب الحساسة الاستيلاء لمدة يومين اما المعيار الإعلام الخميرة / الذرة / أجار أو وسائل الإعلام مختلطة القياسية مباشرة مع المخدرات. للبيانات المعروضة هنا، تم تغذية الذباب إما الذهاب 1و وسائل الاعلام القياسية أو 1 غرام من وسائل الاعلام القياسية مختلطة مع 25 ملغ من الميتفورمين.
  2. بعد أن غذت الذباب لمدة يومين على وسائل الإعلام أو وسائل الإعلام بالإضافة إلى المخدرات، ونقل لهم من قبل التنصت لطيف في قارورة فارغة الفردية وغطاء قارورة مع المكونات القطن. تسمح الذباب على الجلوس دون عائق لمدة 20 دقيقة قبل المراقبة. من المهم أن لا تخدير الذباب في غضون الساعات قبل الملاحظة السلوكية كما وجدت دراسات سابقة التعرض التخدير يمكن أن يغير السلوك بالمقارنة مع الذباب unanesthetized 14.
  3. دوامة قارورة الفردية التي تحتوي على ذبابة واحدة على vortexer المختبر باستخدام أعلى الإعداد لمدة 10 ثانية. وضع ذبابة يجمد على ورقة بيضاء فارغة من الورق مباشرة تحت كاميرا ويب مثبتة فوق الورق.

3. تسجيل الفيديو

  1. تسجيل حركة جيش تحرير السودان أو باستخدام برنامج حاسوبي HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . يستخدم هذا البرنامج لكاميرا ويبالتقاط الصور بناء على إعدادات المستخدم.
  2. حدد الخيار الصور الوقت الفاصل بين تحت علامة التبويب لقطة، عندما يفتح النافذة، حدد الكاميرا كجهاز التقاط. بالنسبة لمعظم التجارب حجم إطار الفيديو 640 × 480 كافية.
  3. اختر إنتل IYUV الترميز للضغط واختيار 0.1 ثانية / الإطار لفحص الاستيلاء أو اختيار 0.1-0.5 ثانية / الإطار لفحص الحركة. ضمن علامة التبويب خيارات متقدمة، حدد إنشاء ملف صورة BMP. لكل التقاط وتحديد مجلد لبرنامج لتخزين الصور التي يستغرق (مكدس الصورة).
  4. وضع ذبابة ميتة على ورقة من الورق. انقر على مربع إعدادات الفيديو وضبط إعدادات تحت علامة التبويب إعدادات الجهاز حتى لا يكون هناك خلفية بيضاء مشرقة وتباين واضح مع الذبابة أكثر قتامة.
  5. انقر على زر البداية لبدء التسجيل. بمجرد الانتهاء من فترة التسجيل، انقر على زر التوقف. يجب أن تكون رزمة الصورة الآن في المجلد المحدد. ملاحظة: قبل التسجيل، تأكد من أن فلدير اختيارها للصورة مكدس فارغ.

4. تحليل البيانات باستخدام يماغيج

  1. الصورة البرمجيات الحرة ومفتوحة يماغيج تجهيز المعاهد الوطنية للصحة، والتي يمكن تحميلها في http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . ملاحظة: بالإضافة إلى تنزيل البرنامج، يجب تحميل Multitracker في المكونات وتركيبها كما هو مبين في http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
  2. استيراد صورة مكدس في يماغيج من خلال النقر على علامة التبويب ملف ثم تحديد استيراد → تسلسل الصور.
    1. حدد المجلد الذي يحتوي على الصورة المكدس، تسليط الضوء على واحدة من الصور وحدد فتح. سيتم فتح مربع الحوار خيارات تسلسل. انقر أسماء ترتيب عدديا ثم اختر موافق وسيتم تحميل الصورة إلى كومة يماغيج.
  3. عتبة جميع الصور بحيث يكون لكل يتكون من خلفية بيضاء مع الذبابة يجريتحويلها إلى نقطة سوداء. لبدء هذه العملية، تحويل الصورة إلى تنسيق 8 بت من خلال تحديد نوع → 8 بت ضمن علامة التبويب صورة.
    1. انقر فوق علامة التبويب صورة مرة أخرى وحدد ضبط → عتبة. سيؤدي هذا إلى فتح مربع الحوار عتبة الذي خفض عتبة إيقاف يمكن تعديلها نقطة.
    2. مسح من خلال الصور لمعرفة ما إذا كان هناك نقاط سوداء إضافية أو إذا كان يفتقر إلى شريحة نقطة سوداء. إذا كان هذا هو الحال، وضبط عتبة للتخفيف من حدة المشكلة. عادة لا يحتاج إلى أن يتم ضبط عتبة كما الافتراضات البرنامج إلى قيمة كافية.
      ملاحظة: يجب على كل شريحة في كومة واحدة فقط نقطة سوداء تمثل موقف الطاير.
    3. حدد تطبيق في مربع الحوار عتبة وسوف تحويل إلى قناع مربع الحوار فتح. لا تقم بالنقر فوق أي من الخيارات ولكن ببساطة انقر فوق موافق لعتبة الصورة المكدس.
  4. بعد مستوى العتبة الصورة مكدس، حدد Multitracker في المكونات تحت علامة التبويب الإضافات من أجلقياس حركة الطيران في بكسل. سوف يظهر مربع حوار كائن المقتفي.
    1. انقر فوق كافة الخيارات الأربعة التي وردت في مربع الحوار ثم اختر موافق. سوف Multitracker في المكونات ثم نعلق الإحداثيات إلى نقطة سوداء في كل شريحة وأدرجها في إطار نتائج فضلا عن طول المسار الكلي في بكسل. يعطي إطار مسارات عرض رسومية من مسار استغرق الطاير.
    2. نسخ قائمة س و y-تنسيق من نافذة نتائج ولصق البيانات في جدول بيانات Excel. إذا لم يكن لديك أي شريحة في كومة نقطة سوداء في ذلك، سيقوم البرنامج Multitracker وقف في تلك الشريحة. إذا حدث هذا، فمن الضروري أن نعود إلى الخطوة 4.2 وإعادة عتبة المكدس للتأكد من أن سجلات الطيران باعتبارها نقطة سوداء في الشريحة المعنية.
  5. من أجل تحويل مسار أطوال من بكسل لسم، تأخذ صورة منفصلة اثنين من النقاط التي يتم متباعدة واحد سم بعيدا على قطعة بيضاء فارغة من الورق.
    1. اتبع أعلاهالخطوات (3.1-4.4.2)، لتحديد س، ص إحداثيات بكسل لاثنين من النقاط واستخدام هذه المعلومات لتحديد عدد وحدات البكسل المقابلة لسم. ويستخدم هذا العامل التحويل في الخطوة الخامسة إلى توليد بيانات الحركة في الطول. ملاحظة: حالما يتم ذلك، فمن المهم للحفاظ على الكاميرا الثابتة لجميع التسجيلات في المستقبل. في كل مرة يتم نقل الكاميرا أو تعديلها، واحد يحتاج إلى تكرار هذه الخطوة لتحويل بكسل لسم.
    2. طول المسار الذي تم إنشاؤه من قبل المكونات في Multitracker يغالي الحركة بسبب تقلبات طفيفة في وضع الجسم وشدة الضوء / انعكاس سيؤثر على حجم ووسط نقطة سوداء التي يتم إنشاؤها عند مستوى العتبة الصور. يجب إزالة هذا الضجيج من أجل الحصول على تقدير دقيق لحركة الطيران.

5. تحليل البيانات باستخدام إكسل

  1. إزالة الضجيج من البيانات المسجلة عن طريق استيراد سلسلة من X، Y إحداثيات الناتجة عن العلاقات العامة Multitrackerogram في تحليل يطير، وهو برنامج Visual Basic إكسل أنشأه. (البرنامج متاح عن طريق الاتصال الكتاب.)
  2. انقر فوق الزر البيانات وتحديد قيمة العتبة وقف انتاج المواد الانشطارية. تحديد قيمة عتبة 0.5 سم / ثانية للتحليل جيش تحرير السودان أو تحديد قيمة بين 0،1-0،3 سم / ثانية للتحليل الحركة. انقر فوق موافق وسيقوم البرنامج حساب السرعة والوقت والمسافة للحركة. ملاحظة: يستخدم هذا البرنامج لتحليل نافذة انزلاق لتقييم البيانات في صناديق متتابعة 0.5-1.0 ثانية ويحسب سرعة خلال تلك النافذة. يتم التعامل مع أي شيء أعلى من القطع المعرفة من قبل المستخدم كما حركة الطيران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت هذه التقنية الموصوفة هنا سابقا لتحليل الاختلافات في جيش تحرير السودان في ذبابة الفاكهة BS المسوخ 1. النتائج المعروضة هنا تشمل سلالات BS صدمت بسهولة (قمة شرق آسيا)، ضجة لا معنى لها (BSS)، وبالضربة القاضية الفنية (الضربة القاضية الفنية). موضع قمة شرق اسيا يشفر كيناز ايثانول تشارك في التوليف الفوسفاتيديل ايثانول 15 وموضع الضربة القاضية الفنية يشفر riboprotein الميتوكوندريا 16. الطفرة BSS هو أليل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند دراسة الحركي أو أنماط الحركة في ذبابة الفاكهة، فمن المفيد أن تكون قادرة على استخراج معلومات تتعلق المسافة المقطوعة، وسرعة الحركة ونمط الحركة. من أجل استخراج هذه المعلومات، وقد جرت العادة على العاملين معدات باهظة الثمن التي غالبا ما تكون باهظة للمختبرات أصغر أو مختبرات التي ترغب في استخدام هذه المقايسات ماما 4،8،9.

مقايسة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لتحديد سافر مسافة (أرقام 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أيضا أن أعرب عن الشكر لكريس الشعلة، ستيفن ماكيني، لورا توبين، جيني Gilbreath واشلي Olley، ميغان هوفر، وميغان هايد لعملهم في صقل هذا الاختبار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاميرا الويبLogitechPro900أي كاميرا ويب عالية الجودة ستكون كافية.
HandiAVI لبرنامج الفاصل الزمنيالعثور على أحدث إصدار في http://www.azcendant.com/
ImageJNIHيمكن العثور على أحدث إصدار في http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-InNIHيمكن العثور على أحدث إصدار في http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html
VortexerVWRVortex Genie 2تكفي معظم الدوامات ذات الحجم القياسي مثل Vortex Genie 2.
غطاء طبق بتري مقاس 5 سمLabM LimitedD011يمكن استخدام أغطية أطباق بتري الأصغر أو الأكبر في ساحة في فحص الحركة.
صندوق خفيفمصنوعمصنوع من مواد الخردة. يتم استخدام الإضاءة لمقايسة الحركة. اعتمادا على إضاءة الغرفة ، من الممكن إجراء الفحص بدون صندوق الإضاءة.
برنامج يمكن حسب الطلب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
  2. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
  3. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  4. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
  5. Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
  6. Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
  9. Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
  10. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
  11. Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
  12. Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
  13. Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
  14. Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
  15. Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
  16. Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
  17. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
  18. Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
  19. Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila Image J

مقالات ذات صلة