متساوي التدابير الكالوري المعايرة تدفق الحرارة المنطلقة أو الممتصة في التفاعلات الكيميائية. هذه الطريقة يمكن استخدامها لقياس انزيم الحفز. في هذه الورقة، وبروتوكول لإعداد مفيدة، يوصف عموما تجربة تشغيل، وتحليل البيانات، وتطبيقها على توصيف الأنزيمية اليوريا التحلل بواسطة جاك الفول اليورياز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الساخنة البيولوجية الحفز: متساوي الكالوري المعايرة لوصف التفاعلات الإنزيمية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
متساوي الكالوري المعايرة (ITC) هو أسلوب وصفها جيدا أن يقيس الحرارة المنطلقة أو الممتصة خلال تفاعل كيميائي، وذلك باستخدام مسبار على أنها جوهرية لتوصيف الواقع كل عملية كيميائية. في الوقت الحاضر، يتم تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع لتحديد المعلمات الحرارية من التوازنات ملزمة الجزيئية البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت ITC لتكون قادرة على قياس حركية مباشرة والمعلمات الحرارية (ك القط، K M، ΔH) من التفاعلات الإنزيمية، حتى وإن كان هذا التطبيق لا يزال غير مستغلة. كما تحدث تغيرات الحرارة بشكل عفوي خلال الحفز الأنزيمي ومركز التجارة الدولية لا يتطلب أي تعديل أو وسم نظام قيد التحليل ويمكن أن يؤديها في الحل. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة تحتاج كمية قليلة من المواد. هذه الخصائص تجعل ITC أداة لا تقدر بثمن، قوية وفريدة من نوعها لدراسة حركية الانزيم في العديد من التطبيقات، مثل، على سبيل المثال، واكتشاف المخدرات.
معشوقة = "jove_content"> في هذا العمل أسلوب التجريبي القائم ITC-لقياس حركية والديناميكا الحرارية من التفاعلات الإنزيمية يوصف بدقة. يتم تطبيق هذا الأسلوب لتحديد ك القط وK M من الإنزيمية من اليوريا التي كتبها الخنجري Canavalia (جاك الفول) اليورياز. يتم إجراء حساب المحتوى الحراري المولي الجوهرية (ΔH كثافة) من رد الفعل. القيم التي تم الحصول عليها وبالتالي تتفق مع البيانات السابقة التي أعلن عنها في الأدب، مما يدل على موثوقية المنهجية.
المقدمة
تقرير الكمي من التفاعلات الكيميائية الحيوية يوفر نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية في أساس الحياة. الكالوري يقدم منهجية خالية من التسمية لوصف كميا كل تفاعل كيميائي تقريبا في الحل. يقيس هذا الأسلوب الحرارة المنطلقة أو الممتصة مع مرور الوقت، وبالتالي فهو نظام الكشف الشامل ومنهجية مريحة للغاية لقياس كمية من رد فعل جزيئات (أي الديناميكا الحرارية ملزمة)، وكذلك لقياس معدل التفاعل (أي حركية). على وجه الخصوص، اعتمد متساوي الكالوري المعايرة (ITC) وطريقة الاختيار لتوصيف الديناميكا الحرارية من التوازنات الجزيئية البيولوجية، التي تنطوي على البروتين يجند، البروتين البروتين، البروتين أيونات المعادن والتفاعلات الحمض النووي البر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. عينات إعداد
- إعداد 2 مل من محلول أنزيم و 0.5 مل من محلول الركيزة لكل تشغيل تجريبي. تمييع الحلول الأسهم مركزة من الانزيم والركيزة في المحاليل وجود تركيبة متطابقة للحد من حرارة التخفيف والخلط خلال إضافة الركيزة.
- اختيار الظروف العازلة التي هي كافية لمنع تغير الرقم الهيدروجيني أثناء التجربة. على سبيل المثال، 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7 كافية لقياس درجة الحموضة في محايدة.
ملاحظة: إذا كان الأمر ينطوي تبادل البروتون، يجب النظر في المحت....
- اختيار الظروف العازلة التي هي كافية لمنع تغير الرقم الهيدروجيني أثناء التجربة. على سبيل المثال، 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7 كافية لقياس درجة الحموضة في محايدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
اليورياز (EC 3.5.1.5؛ اليوريا amidohydrolase) هو انزيم multisubunit المحتوية على النيكل وجدت في archea والبكتيريا وحقيقيات النوى وحيدة الخلية والنباتات. أعمال هذا البروتين في الخطوة الأخيرة من العضوية تمعدن النتروجين، تحفيز التحلل من اليوريا إلى الأمونيا وكاربامات، والتي تتحلل تلقائيا إلى إعطاء جزيء الثاني من الأمونيا وبيكربونات (المعادلة 6) 12.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أهمية المركز لدراسة النشاط الأنزيمي فيما يتعلق بأساليب القائمة
بالإضافة إلى التطبيقات الكلاسيكية لدراسة التوازنات ملزمة، متساوي الكالوري المعايرة يوفر طريقة موثوقة وسريعة لتوصيف التفاعلات الإنزيمية في حل باستخدام حرارة التفاعل باعتباره التحقيق، دون الحاجة إلى تعديل نظام أو وضع العلامات. المعلمات الحركية ك القط وعادة ما يتم الحصول على K M من خلال مجموعة من ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
واعترفت شركة الأسمدة منتجات متميزة (SFP) لتوفير الأموال اللازمة لهذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| هيبس | سيجما | H3375 | يذوب في الماء وضبط الأس الهيدروجيني مع هيدروكسيد الصوديوم |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | يذوب في الماء وضبط الأس الهيدروجيني مع حمض الهيدروكلوريك |
| ثنائي هيدروجين فوسفات الصوديوم | Riedel-de-Haen | 4270 | يذوب في الماء |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | Riedel-de-Haen | 30427 | يذوب في الماء |
| اليوريا | سيجما | U4128 | يذوب في الماء عند 40 درجة ؛ C |
| Canavalia ensiformis< / em> يورياز (النوع C-3) | Sigma | U0251 | يذوب في 20 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7 وتخزينها عند -80 درجة ؛ C |
| VP-ITC على Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | أداة |
| VPViewer2000 1.30.00 على برنامج الحصول على البيانات Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | المزود مع الأداة |
المراجع
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
