مقالة منهجية

تقييد أنزيم الاستنساخ القائم على أسلوب لتقييم في المختبر القدرة تكرار HIV-1 النوع الفرعي C-الكمامة MJ4 همي الفيروسات

DOI:

10.3791/51506

⸱

أغسطس 31, 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يتم تعريف التسبب في فيروس نقص المناعة البشرية < p class = 'jove_content'> من خلال كل من الخصائص الفيروسية والعوامل الوراثية المضيفة. نصف هنا طريقة قوية تسمح بقياسات قابلة للتكرار لتقييم تأثير تباين تسلسل جين الكمامة على قدرة النسخ المتماثل في المختبر للفيروس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعزى التأثير الوقائي للعديد من أليلات HLA من الفئة الأولى على التسبب في فيروس نقص المناعة البشرية -1 وتطور المرض ، جزئيا ، إلى قدرتها على استهداف الأجزاء المحفوظة من جينوم فيروس نقص المناعة البشرية -1 التي تهرب بصعوبة. تنشأ تغييرات التسلسل المنسوبة إلى الضغط المناعي الخلوي عبر الجينوم أثناء الإصابة ، وإذا تم العثور عليها داخل المناطق المحفوظة من الجينوم مثل Gag ، يمكن أن تؤثر على قدرة الفيروس على التكاثر في المختبر. ارتبط انتقال تعدد الأشكال المرتبطة ب HLA في Gag إلى متلقي HLA غير المتطابق بانخفاض الأحمال الفيروسية في نقطة الضبط. افترضنا أن هذا قد يكون بسبب انخفاض قدرة الفيروس على التكاثر. نقدم هنا طريقة جديدة لتقييم التكاثر في المختبر لفيروس نقص المناعة البشرية -1 على أنه يتأثر بجين الكمامة المعزول من النقاط الزمنية الحادة من النوع الفرعي C الزامبي المصابين به. تستخدم هذه الطريقة الاستنساخ القائم على إنزيم التقييد لإدخال جين الكمامة في العمود الفقري الفيروسي المشترك من النوع الفرعي C لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، MJ4. هذا يجعله أكثر ملاءمة لدراسة تسلسلات النوع الفرعي C من الطرق السابقة القائمة على إعادة التركيب والتي قامت بتقييم التكرار في المختبر لتسلسلات الكمامة الاحترافية المشتقة بشكل مزمن. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة لدراسات الفيروسات من الأنواع الفرعية الأخرى. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة قوية وقابلة للتكرار لتقييم قدرة النسخ المتماثل لفيروسات Gag-MJ4 الخيمرية على خط الخلايا التائية المستندة إلى CEM. تم استخدام هذه الطريقة لدراسة الفيروسات الخيمرية Gag-MJ4 المشتقة من 149 من الزامبيين من النوع الفرعي C المصابين بشكل حاد ، وسمحت بتحديد المخلفات في Gag التي تؤثر على النسخ المتماثل. والأهم من ذلك ، أن تنفيذ هذه التقنية قد سهل فهما أعمق لكيفية تحديد التكاثر الفيروسي لمعلمات التسبب في الإصابة المبكرة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 مثل الحمل الفيروسي لنقطة الضبط وتدهور الخلايا التائية CD4 + الطولية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد كل من المضيف وخصائص الفيروسية التي تؤثر HIV-1 المرضية وتطور المرض هو الهدف الأسمى لتصميم لقاح عقلانية. الاستجابة المناعية الخلوية عنصرا أساسيا من الاستجابة المناعية للعدوى البشرية HIV-1. السامة للخلايا T الليمفاوية (CTL) ضرورية لمراقبة الأولية من افيروس الحاد، وتسمح المضيف لتأسيس حالة مستقرة (مجموعة نقطة) الحمل الفيروسي 1،2. نضوب التجريبية من هذه الخلايا المستجيب النتائج في فقدان السيطرة الفيروسية 3،4. على الرغم من هذا، والهروب تنشأ الطفرات داخل الجينوم الفيروسي أن تخريب الاعتراف CTL من الخلايا المصابة فيروسي 5-9.

وقد ارتبطت أليل HLA معينة مع انخفاض الأحمال الفيروسية وتباطؤ تطور المرض بما في ذلك B * 57، B * 27 و 81 * B 10-15. ويمكن أن يعزى جزء من فائدة وقائية من الدرجة HLA I الأليلات إلى حقيقة أنها مقيدة وظيفيا استهداف مناطق من الجينوم مثل الكمامةوحدد للطفرات الهروب التي تقلل من قدرة الفيروس على تكرار في المختبر 16-21. على الرغم من الهروب من نظام المناعة الخلوية هو مفيد للفيروس في سياق الطبقة اختيار أليل HLA I، وتأثير هذه الطفرات قد تكون له عواقب التفاضلية للمضيف على انتقال لHLA-متطابقة الفردية 22،23. ولذلك، فهم آثار الطفرات الهروب المرتبط HLA تنتقل القدرة على تكاثر الفيروس سيكون من المهم تعزيز فهمنا لأوائل HIV-1 المرضية.

بينما تم إحراز تقدم كبير في تحديد وتوصيف العيوب اللياقة البدنية من الطفرات الهروب الفردية المرتبطة الدرجة HLA محددة I الأليلات 24-29، تحدث بشكل طبيعي HIV-1 العزلات وآثار أقدام فريدة ومعقدة من الأشكال HLA المصاحب، من المحتمل الناشئة عن HLA ضغط المناعة بوساطة من مختلف الخلفيات مستمنع 30. في أبتحليل revious، Goepfert وآخرون. أظهرت أن تراكم HLA المصاحب الطفرات في تسلسل الكمامة تنتقل المستمدة من 88 الزامبيين المصابة تماما كان مرتبطا مع انخفاض في مجموعة الحمل الفيروسي نقطة 31. اقترح هذا أن نقل من الطفرات الضارة الهروب، وتحديدا في الكمامة، إلى المستلمين HLA-متطابقة يوفر فائدة سريرية، وربما يعود لتكاثر الفيروس الموهن. المضي قدما، لا بد من دراسة كيفية مجموعات من الأشكال الكمامة داخل مجمع العزلات التي تحدث بشكل طبيعي تعمل في تناسق لتحديد خصائص الفيروس ينتقل مثل القدرة تكرارها، وكيفية تكرارها في وقت مبكر قد يؤثر بدوره HIV-1 المعلمات السريرية والمراحل المتأخرة المرضية.

بروكمان وآخرون أظهرت لأول مرة وجود علاقة بين القدرة تكرار متواليات هفوة الموالية معزولة خلال مرحلة الإصابة المزمنة والحمل الفيروسي C في كل من فرعي والتهابات B32-35. المنهج التجريبي المقدم في هذه الدراسات، على الرغم المناسب لاختبار قدرة تكرارها في المختبر من متواليات المستمدة من الأشخاص المصابين بشكل مزمن، لديها العديد من المحاذير والقيود الفنية التي تجعل من دراسة HIV-1 قدرة تنسخي في النوع الفرعي C المصابين تماما صعوبة. ويعتمد هذا الأسلوب على إعادة التركيب من القائمة على السكان تسلسل PCR تضخيم في النوع الفرعي B NL4-3 طليعة الفيروس، والتي كانت مستمدة جزئيا من LAV، تكييف مختبر الفيروسات الأسهم 36. تم انجازه الجيل الفيروس عن طريق التعاون ترنسفكأيشن خط T-خلية مقرها CEM-37 مع amplicons PCR وهضمها delta--هفوة الموالية NL4-3 DNA. يتطلب هذا الأسلوب ثمرة من الفيروسات على مدى فترة من أسابيع إلى أشهر، وربما انحراف طبيعة الأسهم فيروس تعافى فيما يتعلق quasispecies الفيروسية في الجسم الحي، وبالتالي تغيير قياس قدرة تكرارها في المختبر. طريقة هذا طهو أكثر مناسبة لدراسة الأفراد المصابين المزمنين، حيث يختار بشكل فعال للفيروس وفقا لأعلى قدرة تنسخي، وحيث استنساخ العديد من المتغيرات الفيروسية مختلفة من عدد كبير من الأشخاص المصابين بشكل مزمن هو العمل المكثف تماما، وبالتالي لا جدوى. ومع ذلك، داخل الفرد المصاب تماما، وهناك عموما 1-2 متغيرات الحاضر، وبالتالي القضاء على خطر انحراف طبيعة الفيروس الأسهم المستردة، في المختبر من خلال الضغوط الاختيار، ويسمح لإجراء تقييم أكثر دقة للفي المختبر قدرة النسخ المتماثل. ثانيا، هذا الأسلوب يتطلب إعادة توحيد فرعي C-هفوة الموالية تسلسل إلى النمط الفرعي B العمود الفقري المشتقة، ويمكن إدخال العمود الفقري التحيزات عدم التوافق في التحليل. بسبب هذه القيود، يجب تحليل أعداد كبيرة من متواليات من أجل التغلب على أي التحيزات المحتملة قدم.

نحن هنا وصف لAPPRO التجريبي بديلمنظمة العمل ضد الجوع المناسب لدراسة تسلسل المستمدة من النوع الفرعي C الأفراد المصابين تماما. نحن نستخدم استراتيجية استنساخ انزيم التقييد استنادا إلى إدخال الجين هفوة المستمدة من النقاط الزمنية العدوى الحادة للHIV-1 النوع الفرعي C المصابين في العمود الفقري proviral النوع الفرعي C، MJ4. استخدام MJ4 بمثابة العمود الفقري شيوعا التي لاستنساخ الجينات أسكت أمر بالغ الأهمية لتحليل النوع الفرعي C تسلسل مشتقة. مشتق MJ4 من عزل الأساسي 38، وبالتالي سيكون أقل احتمالا لتقديم التحيز بسبب عدم التوافق بين فرعي العمود الفقري والجينات هفوة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج القائمة على استخدام انزيم تقييد الاستنساخ يسمح للproviral يبني أن transfected مباشرة إلى خلايا 293T، وانتعاش الأسهم فيروس النسيلي مطابقة للتسلسل هفوة المستنسخة.

طريقة الواردة أدناه هي طريقة إنتاجية عالية لتقييم قدرة تكرار النوع الفرعي C المستمدة الكمامة-MJ4الفيروسات خيالية. ترنسفكأيشن في الخلايا 293T واضح ومباشر والتعافي من الفيروس يأخذ ثلاثة أيام فقط. ويعاير في المختبر قدرة النسخ المتماثل على نفس أساس خط T-خلية CEM-CCR5 التي أنشأتها بروكمان وآخرون 37، ولكن باستخدام بروتوكول التعديلات الهامة اللازمة لتكرار النجاح من النوع الفرعي C MJ4 الفيروسات خيالية. استخدام خط T-خلية المناسب بدلا من PBMCs يسمح لأعداد كبيرة من النوع الفرعي C-MJ4 خيالية الفيروسات لفحصها مع فحص عالية التكاثر. أخيرا، وذلك باستخدام رديولبلد الناسخ العكسي لفحص الكمي للفيروس في طاف هو أكثر فعالية من استخدام P24 المتاحة تجاريا مجموعات ELISA التكلفة. كما انه يعطي مجموعة أعلى ديناميكية، وهذا أمر مهم للكشف عن الفيروسات على حد سواء سيئة للغاية وتكرار في نفس الفحص وللكشف عن الفروق الدقيقة في النسخ المتماثل بين العزلات.

في الختام، فإن الطريقة المعروضة هنا قد سمح لدراسة متعمقة لقدرات تكرار متواليات هفوة المستمدة من HIV-1 النوع الفرعي C إصابة حادة الأفراد من زامبيا، وكما هو مكتوب، ويمكن أيضا أن توسعت لدراسة النوع الفرعي الآخر C إصابة السكان. ولوحظ وجود درجة عالية من التباين في القدرات النسخ المتماثل بين العزلات الكمامة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على إظهار ارتباط إحصائية بين قدرة تكرار الكمامة تنتقل ووضع نقطة الحمل الفيروسي وكذلك مع CD4 + انخفاض على مدى فترة ثلاث سنوات 39. هذه النتائج تبرز أهمية دراسة الخصائص الفيروسية كيف تنتقل، مثل القدرة التكرار، تتفاعل مع الجهاز المناعي المضيفة للتأثير المرضية خلال العدوى في وقت مبكر، وسوف تكون متكاملة لتطوير لقاح التدخلات الفعالة وكذلك العلاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التضخيم من هفوة جين HIV-1 من المصاب، البلازما المجمدة

  1. استخراج RNA الفيروسي من 140 ميكرولتر إذابة HIV-1 البلازما المصابين باستخدام عدة الاستخراج.
    1. عندما يكون ذلك ممكنا، الشروع فورا في التوليف [كدنا] بعد استخراج الحمض النووي الريبي RNA الفيروسي كما رفع التجميد تؤدي إلى أفضل النتائج التضخيم. إذا كان ذلك ممكنا، إعداد PCR مزيج الرئيسي لأول جولة تضخيم الحمض النووي وتخزينها في 4 درجات مئوية قبل استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي.
  2. العكسية تدوين [كدنا] من الحمض النووي الريبي DNA وتضخيم منتجات الجولة الأولى باستخدام العكسية الناسخ والبلمرة DNA بالحرارة في خطوة واحدة RT-PCR.
    1. اتخاذ RNA من -80 ° C الفريزر (إذا كان من الضروري تجميد)، وذوبان الجليد لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة ثم ضع في كتلة البارد. نقل 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لكل أنبوب PCR يحتوي على 45 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لإعطاء الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. وضع على الفور المتبقية عينات الحمض النووي الريبي إلى -80 ° C الفريزر.
    2. بعد الانزيم هوdded إلى الدور الأول-PCR مزيج الرئيسي (الجدول 1A)، قسامة 45 ميكرولتر في كل التضخيم PCR رقيقة الجدران أنبوب لعدد من ردود الفعل المطلوب. تأكد من استخدام أنابيب PCR مع قبعات الفردية وليس تجريد مباراة دولية لضمان الحد الأدنى من انتقال التلوث بين العينات. وضع أنابيب PCR في كتلة البارد لحماية انزيم RNA القالب وRT حساس درجة الحرارة. ملاحظة: يجب تشغيل العينات في ثلاث نسخ من أجل أخذ عينات بشكل كاف quasispecies الفيروسية. من المهم أيضا للاستفادة من المنتج مع عالية الدقة إنزيم البلمرة DNA من أجل تقليل misincorporation قدم PCR. يرجى الرجوع إلى قائمة الكواشف للمنتج الموصى بها.
    3. بعد تمت إضافة قالب RNA لجميع أنابيب رد فعل، ونقل أنابيب PCR على thermocycler لتضخيم باستخدام برنامج cycler هو موضح في الجدول 1B. ملاحظة: سيتم استخدام المنتج من هذا التضخيم في الجولة الثانية متداخلة PCR.
  3. إجراء متداخلة حد ذاتهكوند جولة PCR التضخيم، وذلك باستخدام 1 ميكرولتر من أول جولة PCR التضخيم (1.2) كقالب DNA.
    1. قسامة 49 ميكرولتر من الجولة الثانية PCR مزيج الرئيسي (الجدول 2A) لكل أنبوب PCR رقيقة الجدران لعدد من ردود الفعل المطلوب. نقل 1 ميكرولتر من الدور الاول-PCR التضخيم لكل أنبوب رد فعل لإعطاء الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. ملاحظة: ستكون هذه خدمة DNA القالب ك لتضخيم الدور الثاني. من المهم أيضا للاستفادة من البلمرة DNA مع قدرات الإخلاص وتصحيح التجارب المطبعية عالية جدا من أجل تقليل misincorporation قدم PCR. يرجى الرجوع إلى قائمة الكواشف للمنتج الموصى بها.
    2. نقل الجولة الثانية PCR مزيج رد فعل على thermocycler وتشغيل البرنامج المبين في الجدول 2B. ملاحظة: بعد الانتهاء من البرنامج، سيتم تشغيل منتجات هذا رد فعل على هلام الاغاروز لتأكيد إنتاج المنتج.
  4. إضافة 3 ميكرولتر من صبغ تحميل 5X إلى 5 & #181؛ ل 50 ميكرولتر من الدور الثاني حجم رد الفعل وتعمل في 120 V على 1٪ الاغاروز تاي هلام يحتوي على الحمض النووي وصمة عار للأشعة فوق البنفسجية الفلورسنت حتى يتم حل العصابات. تصور العصابات 1.6 كيلو بايت على ضوء إضاءة زرقاء (انظر الشكل 1A).
  5. تشغيل 45 ميكرولتر حجم رد الفعل المتبقية على 1٪ الاغاروز تاي هلام يحتوي على الحمض النووي وصمة عار، واستئصال العصابات المناسبة بشفرة حلاقة نظيفة.
    1. استخراج الحمض النووي من شريحة هلام باستخدام طقم تنقية هلام، أزل في nuclease خالية من المياه، والجمع بين ثلاثة ردود فعل إيجابية للفرد، وتجميد المنتج في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

2. إعداد Amplicons أسكت عن طريق الاستنساخ مقدمة من مواقع تقييد الضرورية

  1. تضخيم كرر محطة الطويلة (LTR) / 5 "UTR جزء من البلازميد MJ4 (انظر الجدول 3).
  2. تصور 1.3 كيلوبايت المنتجات PCR على إضاءة، amplicons إيجابية المكوس، هلام تنقية وتجميد كما في السابقوصف (1.4،1.5، انظر الشكل 1B).
  3. خلق تنصهر MJ4 LTR- amplicons هفوة عبر "لصق-التداخل تمديد" PCR (انظر الجدول 4).
  4. تصور، والمكوس، وتنقية، وتجميد amplicons 3.2 كيلو بايت كما في 1.4،1.5 (انظر الشكل 1C).

3. استنساخ الجينات هفوة أسهب في MJ4، النوع الفرعي C، استنساخ الجزيئية المعدية

  1. هضم 1.5 ميكروغرام من MJ4 البلازميد و 1.5 ميكروغرام من تنقية المنتج LTR- هفوة PCR مع BclI (مثيلة حساسة) نوكلياز داخلية تقييد مقابل 1.5 ساعة عند 50 درجة مئوية (انظر الجدول 5A).
  2. إضافة 1 ميكرولتر من NgoMIV إلى رد فعل الهضم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. إضافة 5X صبغ تحميل لتقييد هضم ردود الفعل وelectrophorese ببطء الحجم الكلي على 1٪ الاغاروز تاي الجل تحتوي على هلام وصمة عار الحمض النووي لمدة 1-2 ساعة عند 100 V. تصور والمكوس، وتنقية العصابات أشار للاستنساخ كما سبق تنازلياribed (انظر الشكل 2).
  4. إعداد ردود الفعل ربط باستخدام النقي LTR- هفوة إدراج وDNA ناقلات MJ4 في 3: 1 تضاف إلى نسبة النواقل. احتضان ردود الفعل ربط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (انظر الجدول 5B).
  5. تحويل JM109 البكتيريا المختصة كيميائيا مع منتجات ربط ونشر على لوحات أجار LB مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة 22+.
    1. ذوبان الجليد JM109 الخلايا المختصة على الجليد لمدة 15 دقيقة. تسمية 1.5 مل أنابيب microcentrifuge والبرد على الجليد.
    2. قسامة 50-100 ميكرولتر من الخلايا JM109 إلى ما قبل مبرد 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إضافة 2.5-5 ميكرولتر من رد فعل لربط JM109 الخلايا عبها الأنبوب برفق لمزج والعودة فورا إلى جليد. احتضان خلايا المختصة مع المنتج ربط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. الصدمة الحرارية 1.5 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي JM109 الخلايا المختصة وربط رد فعل في 42 ° C كتلة الحرارة لمدة 45 ثانية والعودة إلى الجليد لمدة 3 دقائق على الأقل.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من وسائل الاعلام SOC إلى كل أنبوب microcentrifuge ولوحة رد فعل التحول بأكمله على درجة حرارة الغرفة LB-أجار لوحات تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين.
    5. لوحات نقل إلى 30 درجة مئوية الحاضنة وتترك لمدة 20 ساعة، أو حتى يتم تشكيل المستعمرات بشكل واضح.
  6. اختيار المستعمرات المعزولة وتنمو في 4 مل من LB مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة 22+.
  7. تدور باستمرار في الثقافات 3،200 x ج لمدة 15 دقيقة، صب من مرق، واستخراج DNA البلازميد.
  8. لتأكيد استنساخ الإخلاص، وقطع DNA miniprep مع NgoMIV انفلونزا الطيور وتقييد الانزيمات في ضعف الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تحليل على 1٪ الاغاروز تاي هلام (انظر الجدول 5C).
  9. تسلسل المنطقة إدراج LTR-أسكت كل البلازميد باستخدام بادئات التالية: GagInnerF1، GagF2، REV1، REV3، وGagR6 (الجدول 6) لتأكيد هوية التسلسل.
  10. مقارنة تسلسل المستنسخة التي تم الحصول عليها مع تسلسل سكان ديرived من amplicon النقي الأولي من 1.5.1. ملاحظة: من المهم لتقييم القدرة في نهاية المطاف تكرار اثنين من الحيوانات المستنسخة مستقلة من أجل ضمان أن أي تكرار في المختبر الظواهر ليست بسبب أخطاء العمود الفقري قدم أثناء عملية الاستنساخ.

4. الجيل وTitering من النسخ المتماثل المختصة الكمامة-MJ4 همي الفيروسات

  1. توليد تكاثر الفيروس المختصة عليها بنقل 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد miniprep MJ4 خيالية إلى خلايا 293T باستخدام نسبة 4: 1 من Fugene HD كما وصفها الأمير وآخرون 39.
  2. عيار تحصد مخزونات فيروس على خلايا TZM-BL كما هو موضح أدناه والأمير وآخرون 39.
    1. لوحة-TZM از خلايا 24 ساعة قبل الإصابة بفيروس في أجل الحصول على 30-40٪ أحادي الطبقة الخلية متكدسة في اليوم التالي. وعادة ما يمكن أن يتحقق هذا عن طريق إضافة 5 × 10 4 خلايا في إجمالي حجم 800 ميكرولتر لكل بئر في 24 لوحة جيدا.
    2. بعد إضافة خلايا إلى البئر، نقل بلطف 24 لوحة جيدا إلى الأمام والخلف، ثم جانب إلى آخر من أجل توزيعها بكفاءة الخلايا. دوامة أبدا - وهذا سوف يؤدي إلى تراكم الخلايا في وسط اللوحة.
    3. في اليوم التالي، وإعداد 1٪ FBS في DMEM. وسوف تستخدم هذه لتمييع دجلة-ديكستران وتمييع مخزونات فيروس. الأسهم دجلة-ديكستران هو 10 ملغ / مل أو 125x، وتركيز النهائي من 80 ميكروغرام / مل أو 1X هو المطلوب.
    4. إخراج الأسهم فيروس لفحصها من -80 ° C الفريزر ومكان على شاكر لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
    5. باستخدام ماصة الأقنية، وتمييع متسلسل مخزونات فيروس في زراعة الأنسجة ذهابا والقاع 96 لوحة تعامل جيدا مع غطاء. هذا هو بروتوكول التخفيف 3 أضعاف. انظر الجدول رقم 7 لنظام التخفيف.
    6. إزالة وسائل الاعلام من المصنف 24 لوحات جيدا TZM از باستخدام الشافطة فراغ التأكد من عدم إزعاج أحادي الطبقة الخلية. فقط إزالة وسائل الإعلام من واحد 24 لوحة جيدا في وقت لذلك أن الخلايا تفعللا تجف.
    7. إضافة 150 ميكرولتر من 1X دجلة-ديكستران + 1٪ FBS في DMEM الخليط إلى كل بئر باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر. لا تستخدم تكرار ماصة لأن هذا يعطل أحادي الطبقة.
    8. إضافة 150 ميكرولتر من كل تخفيف الفيروس إلى البئر المناسب. إضافة الفيروس إلى مركز البئر ودوامة بلطف لتوزيع بالتساوي الفيروس عبر أحادي الطبقة الخلية. احتضان الخلايا المصابة لمدة 2 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    9. بعد حضانة 2 ساعة، إضافة 0.5 مل 10٪ FBS في DMEM إلى كل بئر والعودة إلى الحاضنة لوحات ل48 ساعة إضافية.
    10. بعد 48 ساعة، وينبغي أن تكون خلايا متكدسة 100٪. لأن MJ4 هو فيروس المختصة التكرار، سيكون هناك بعض موت الخلايا، ولكن هذا أمر متوقع.
    11. إزالة وسائل الإعلام من كل بئر وإضافة 400 ميكرولتر / جيد من تحديد الحل (انظر الجدول 8A وصفة). إصلاح لوحة واحدة فقط في المرة الواحدة. إضافة تحديد الحل باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر، وترك الجلوس لمدة 5 دقائق فيدرجة حرارة الغرفة.
    12. إزالة تثبيت الحل وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+. استخدام زجاجة بخ لإضافة بلطف PBS إلى جانب البئر لتجنب تعطيل أحادي الطبقة. بعد غسل الثالث، وصمة عار لوحة جاف على ورق ماص.
    13. إضافة 400 ميكرولتر / جيد من حل تلطيخ (انظر الجدول 8B وصفة) إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة. مرات حضانة أطول مقبولة، ولكن يجب أن تبقى مرات حضانة متناسقة بين التجارب titering.
    14. غسل 2X مع PBS مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ ويسجل للعدوى، أو إضافة برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التهديف في وقت لاحق. يمكن أن تظل لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أيام، طالما يتم الاحتفاظ أحادي الطبقة المائية.
    15. ليسجل للعدوى، استخدم علامة دائمة لتقسيم الآبار من 24 لوحة جيدا في الأرباع. عد جميع الخلايا الزرقاء ضمن مجال الرؤية، وذلك باستخدام التكبير الكلي لل200X، مرة واحدة فيكل من الأرباع الأربعة من بئر.
    16. حساب وحدات المعدية لكل ميكرولتر على النحو التالي: [(# خلايا الزرقاء / 4) × 67] / (ميكرولتر فيروس مضاف) = IU / ميكرولتر. الرجوع إلى الجدول لحجم 8C في ميكرولتر من فيروس تضاف إلى كل بئر. متوسط ​​عدة آبار معا. يجب أن تكون الأرقام مماثلة نسبيا لمعايرة دقيقة.

5. إعداد الثقافة وسائل الإعلام ونشر خلايا GXR25 لفي المختبر النسخ المتماثل الفحص

  1. إعداد كامل RPMI (cRPMI) لنشر خلايا GXR25. ملاحظة: من المهم للغاية بالنسبة خلايا الثقافة GXR25 قبل 4 أشهر على الأقل لتكرار التجارب المخطط لها (انظر الجدول 9).
  2. انقسام خلايا 1:10 مرتين في الأسبوع، والحفاظ على كثافة الخلية بين 1 × 05-02 أكتوبر × 10 6 خلية / مل.

6. النسخ المتماثل في المختبر من الكمامة-MJ4 الوهم في GXR25 (CEM-CCR5-GFP) الخلايا

  1. قبل يوم من طnfection، تقسيم الخلايا إلى تركيز بين 2-3 × 10 5 خلية / مل بحيث تكون في النمو اللوغاريتمي في يوم من العدوى.
  2. في يوم من العدوى، وإزالة مخزونات فيروس من -80 ° C الفريزر وذوبان الجليد. حساب حجم فيروس المطلوبة من كل الأوراق المالية على أساس وحدة دولية / عيار ميكرولتر من فحص الخلايا TZM-BL لكي تصيب 5 × 10 5 GXR25 خلايا في عدد وافر من العدوى من 0.05، وذلك باستخدام الصيغة:
    حجم الفيروس لعدوى (ميكرولتر) = 1 ميكرولتر / X IU س 0.05 س 500،000
    ملاحظة: لقد اخترنا وزارة الداخلية من 0.05 وهذه النتائج في مرحلة النمو لوغاريتمي لجميع الفيروسات التي اختبرناها. من المهم إجراء التجارب الأولية من أجل تحديد وزارة الداخلية المثلى لالتقاط النمو اللوغاريتمي للفيروس لفحصها.
  3. تمييع الفيروس في cRPMI إلى وحدة تخزين من 100 ميكرولتر (من أجل تحقيق 0.05 MOI) وإضافة إلى بئر لزراعة الأنسجة V-96 لوحة أسفل يعامل جيدا. ملاحظة: تشمل كلا من positiلقد التحكم (MJ4 WT المصابة) والسالب (الخلايا المصابة وهمية) في كل مجموعة من التجارب النسخ المتماثل. إعداد لوحة بحيث كل عمود آخر فارغ للحد من انتقال التلوث بين الآبار. السيطرة الإيجابية أمر حتمي، كما سيتم استخدامه في وقت لاحق كمعيار لتطبيع منحدرات التكرار، التي هي مقياس لمعدل تكرار مكررات التجريبية.
  4. عد الخلايا GXR25 باستخدام عداد خلية الآلي. حساب عدد الخلايا اللازمة في مجموع لجميع الإصابات (5 × 5 × 10 # العدوى). قسامة حجم المطلوب في أنبوب مخروطي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لتكوير الخلايا. حساب دائما ل25٪ أكثر من اللازم العدوى.
  5. وسائل الاعلام نضح بعناية وresuspend في cRPMI بتركيز 5 × 10 5 خلية / 100 ميكرولتر.
  6. خلايا ماصة في حوض معقم وتخلط جيدا. باستخدام ماصة متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من 96 لوحة جيدا تحتوي على الفيروس المخفف. ميلس بدقة.
  7. إضافة 2 ميكرولتر من 5 ملغ / مل (100X) حل polybrene إلى كل بئر والخلايا تخلط جيدا.
  8. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة حاضنة مع CO 2 5٪ لمدة 3 ساعة.
  9. من أجل غسل الخلايا المصابة، الطرد المركزي 96-V-جيدا لوحة أسفل لتكوير الخلايا. ثم إزالة بعناية 150 ميكرولتر من المتوسطة واستبدالها مع 150 ميكرولتر جديدة من cRPMI دون إزعاج بيليه الخلية. كرر 2 مرات أكثر (بما في ذلك الطرد المركزي) بما فيه الكفاية لغسل الخلايا.
  10. بعد الطرد المركزي الماضي وإضافة 150 ميكرولتر cRPMI، resuspend الكرية خلية مع ماصة الأقنية وإضافة خليط كامل الخلية / فيروس (حوالي 200 ميكرولتر) من كل بئر مستقل إلى 800 ميكرولتر من cRPMI في بئر من نسيج 24 أيضا لوحة الثقافة.
  11. مكان لوحة في 5٪ CO 2 نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  12. كل يومين، وإزالة 100 ميكرولتر من طاف من سطح الثقافة جيدا ونقل إلى 96 جيدا Uلوحة القاع ومخزن تجميد في -80 درجة مئوية حتى تشغيل فيروس الكميات الفحص. ملاحظة: الترتيب الدقيق لsupernatants في لوحات 96 بشكل جيد يسمح للنقل متعدد القنوات ماصة من supernatants الثقافة خلال الفيريون الكمي عبر رديولبلد الناسخ العكسي (RT) فحص. يجب أن تحتوي كل لوحة عينات من مستوى الإصابة من أجل تطبيع بين لوحة التباين في قراءات فحص RT.
  13. بعد إزالة كل عينة 100 ميكرولتر، وخلايا تقسيم 1: 2 بواسطة الخلايا إعادة التعليق بدقة وإزالة نصف حجم المتبقية (450 ميكرولتر). استعادة حجم الأصلي (1 مل) من خلال إضافة 550 ميكرولتر من cRPMI جديدة إلى كل بئر.

7. تحليل الناسخ العكسي (RT) في خلية ثقافة Supernatants

بروتوكول تكييفها من اوستروفسكي وآخرون 40.

  1. إنشاء غطاء السلامة البيولوجية في منشأة BSL-3 للاستخدام مع المواد المشعة.
    1. وضع ورقة ماصة في هوود واستبدال الشافطة لالشافطة المخصصة لاستخدام الإشعاعي. ملاحظة: يجب أن يتم التخلص منها بطريقة صحيحة جميع النفايات المشعة مع فقا للوائح السلامة.
  2. إضافة 1-2 ميكرولتر من 10 ميلي كوري / مل من [α- 33 P] dTTP و 4 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol (DTT) لكل 1 مل قسامة من مزيج الرئيسي RT (انظر الجدول 10 واوستروفسكي وآخرون 40).
  3. مزيج بعناية كل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل من مزيج الرئيسي RT، DTT، و[α- 33 P] dTTP مع ماصة 1،000 ميكرولتر ونقل إلى حوض العقيمة.
  4. الاستغناء عن 25 ميكرولتر من مزيج المسمى RT في كل بئر من 96 جيدا رقيقة الجدران لوحة PCR. ملاحظة: تشمل مساحة لمراقبة إيجابية (MJ4 العدوى WT) والسيطرة السلبية (العدوى وهمية).
  5. إضافة 5 ميكرولتر من كل طاف لوحة PCR يحتوي على مزيج الرئيسي RT.
  6. ختم PCR لوحة مع غطاء احباط لاصقة واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في thermocycler. لأسباب تتعلق بالسلامة، رينحد ذاتها نصائح ماصة مع Amphyl والتخلص من النصائح في حاوية صغيرة تحتوي النفايات Amphyl، والتي سوف يتم التخلص منها في وقت لاحق في النفايات المشعة.
  7. بعد الحضانة، وجعل ثقوب صغيرة في غلاف احباط باستخدام 200 ميكرولتر متعدد القنوات ماصة. ملاحظة: إذا نصائح ماصة لمس السائل بشكل جيد، واستبدال نصائح قبل أن ينتقل إلى العمود أو الصف التالي.
  8. مزيج عينات 5X ونقل 5 ميكرولتر من كل عينة إلى ورقة DE-81. الهواء الجاف 10 دقيقة.
  9. البقع غسل 5X مع 1X SSC (كلوريد الصوديوم، سيترات الصوديوم)، ثم 2X مع 90٪ من الإيثانول في 5 دقائق لكل يغسل. السماح للهواء الجاف.
    1. وضع كل وصمة عار في وعاء الغسيل منفصلة، ​​مثل مربع تخزين شطيرة، إضافة ما يكفي من غسل العازلة (1X SSC أو 90٪ ETOH) لتغطية وصمة عار، ويهز لمدة 5 دقائق.
    2. تخلصي غسل العازلة في حاوية منفصلة، ​​وتكرار. ملاحظة: وتعتبر يغسل 3 الأولى المشعة ويجب التخلص منها بشكل صحيح. 2 يغسل مشاركة يمكن التخلص منها بشكل منتظم.
  10. مرة واحدة جافة، سيارةالتفاف efully صمة عار في ساران التفاف وتعرض إلى phosphoscreen في شريط مغلقة بإحكام بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  11. تحليل phosphoscreens مع phosphorimager وتحديد النصوص المشعة.
  12. رسم دائرة حول كل إشارة المشعة باستخدام برنامج OptiQuant. الرسم البياني قيم الوحدة الرقمية الخفيفة (DLU) لتوليد منحنيات النسخ المتماثل.
  13. من أجل توليد القدرة عشرات النسخ المتماثل كانت قيم DLU سجل 10 -transformed وحسبت المنحدرات باستخدام يوم 2 و 4 و 6 نقاط الوقت. ثم تنقسم منحدرات التكرار من قبل المنحدر من WT MJ4 من أجل توليد تكرار عشرات القدرات. من المهم لتطبيع على أساس القيم MJ4 WT تم الحصول عليها من نفس RT لوحة للحد من تقلب داخل الفحص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، مما يخلق البلازميد proviral قادرة على تجميع وظيفية بالكامل، المعدية الوهم الكمامة-MJ4، يجب توخي الحذر الشديد لتوليد amplicons PCR المناسبة. تحديد ما إذا كان PCR ولدت في amplicon هفوة بحجم مناسب أمر بالغ الأهمية. يجب أن تكون المنتجات ضمن 100 زوج قاعدي (بي بي) من amplicon حوالي 1،700 بي بي مبين في الشكل 1A. وطول هذا الجزء الدقيق تختلف تبعا الجين هفوة قيد الدراسة. المقبل، يجب تضخيمه 5 'طويلة تكرار محطة (LTR) جز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بسبب طول وطبيعة التقنية لهذا البروتوكول، وهناك العديد من الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لكل من البناء الناجح خيالية البلازميدات الكمامة-MJ4 وكذلك لتقدير حجم القدرة تكاثر الفيروس. على الرغم من أن استراتيجية استنساخ انزيم التقييد استنادا لإدخال الجينات هفوة الأجانب إلى MJ4 المبينة في هذا البروتوكول ديها مزايا عديدة أكثر من الطرق المستخدمة سابقا إعادة التركيب القائم، يمكن للبروتوكول أن يكون تحديا تقنيا إذا لم يتم اتباع الخطوات الحاسمة على وجه التحديد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر الباحثون جميع المتطوعين في زامبيا الذين شاركوا في هذه الدراسة وجميع الموظفين في مشروع أبحاث فيروس نقص المناعة البشرية في زامبيا إيموري في لوساكا الذين جعلوا هذه الدراسة ممكنة. يود المحققون أن يشكروا جون ألين وسميتا شافان وماكنزي هيرلستون على المساعدة الفنية وإدارة العينات. نود أيضا أن نشكر الدكتور مارك بروكمان على مناقشاته وتبرعه السخي لخلايا GXR25.

تم تمويل هذه الدراسة من قبل R01 AI64060 و R37 AI51231 (EH) والمبادرة الدولية للقاح الإيدز. وقد أمكن تحقيق هذا العمل جزئيا بفضل الدعم السخي من الشعب الأمريكي من خلال وكالة التنمية الدولية التابعة للولايات المتحدة. وتقع مسؤولية محتويات الدراسة ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر الوكالة الأمريكية للتنمية الدولية أو حكومة الولايات المتحدة. كما تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل مركز علم الفيروسات في مركز إيموري لأبحاث الإيدز (Grant P30 AI050409). تم دعم DC و JP جزئيا من قبل زمالات Action Cyclings. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة قاعدة مركز أبحاث الرئيسيات الوطني في يركس (2P51RR000165-51). تم تمويل هذا المشروع جزئيا أيضا من قبل المركز الوطني لموارد البحوث P51RR165 ويدعمه حاليا مكتب برامج البنية التحتية للبحوث / OD P51OD11132.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الحلاقة لنظام التنظيف الحواف < td colspan = "4" >microbiology & كواشف الاستنساخ < / قوي > القاع td colspan = "4" > كواشف ثقافة الخلية< / قوي > معالجة مركزي <td colspan = "4"><قوي > كواشف فحص النسخ العكسي < / قوي > ضبط صغيرة

PCR Recodes< / strong>
GOF: 5 'ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol ، desalt القياسي
VifOR: 5 'TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol ، desalt القياسي
GagInnerF1: 5 'AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol ، desalt القياسي
BclIDegRev2: 5 'AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR3'IDT DNAمخصص أوليغو25 نانومول ، الملح القياسي
MJ4For1b: 5 'CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNAمخصص أوليغو25 نانومول ، الملح القياسي
MJ4Rev: 5 'CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNAمخصص أوليغو25 نانومول ، الملح القياسي
BclIRev: 5 'TCTATAAGTATTTTTGATCATACTGTCTCTCTT 3"IDT DNACustom Oligo25 nmol ، الملح القياسي
GagF2: 5 'GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol ، الملح القياسي
For3: 5 'CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol ، الملح القياسي
GagR6: 5 'CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol ، الملح القياسي
Rev3: 5 'GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNAمخصص أوليغو25 نانومول ، الملح القياسي
Rev1: 5 'AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDTDNAمخصص أوليغو25 نانومول ، الملح القياسي
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Nuclease المياه الخاليةمن الصحافة فيشرSH30538FSالمصنعة بواسطة Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Strip Tubes ، أزرق (غطاء مسطح)DaiggerEF3647BX
SuperScript III نظام RT-PCR بخطوةواحدة Life Technologies / Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA polymeraseFisherF-549L
PCR Nucleotide MixRoche4638956001
Agarose ، قوة هلام عاليةFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies / InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA ladderFisherPRG5711المصنعة بواسطة Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain ، 10،000xLife Technologies / InvitrogenS33102
Wizard SV Gel و شفراتPromegaA9282
PCR ، أحاديةFisher12-640المصنعة بواسطة Surgical Design
Thermocycler ، PTC-200MJ Research
رطل أجار ، ميلرفيشرBP1425-2
مرق رطل ، لينوكسفيشرBP1427-2
معقم 100 × 15 مم البوليسترين أطباق بتريفيشر08-757-12
ملح الصوديوم أمبيسلينسيجما ألدريتشA9518-5G
فالكون 14 مل أنابيب البولي بروبيلين المستديرةBD Biosciences352059
NgoMIV تقييد نوكليازداخلي نيو إنجلاند BioLabsR0564L
BclI تقييد نوكليازداخلي نيو إنجلاند BioLabsR0160L
HpaI تقييد نوكلياز داخلينيو إنجلاند BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase ، 5 U/&mu ؛ لRoche10799009001
JM109 الخلايا المختصة ، >108< / sup> cfu/&mu ؛ زنظام PromegaL2001
PureYield البلازميد miniprepPromegaA1222
Secure Imager 2.0 الضوء الأزرق TransilluminatorInvitrogenG6600
Microfuge 18 جهاز طرد مركزيBeckman Coulter367160<
منظف / مطهرفيشر22-030-394
Fugene HD ، 1 ملVWR PAE2311المصنعة من Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates ، 6 بئر ، مسطحةFisher07-200-83المصنعة بواسطة Corning Life
Costar Plates ، 24 بئر ، مسطحةFisher07-200-84المصنعة بواسطة Corning Life
ألواح كوستار، 96 بئر، دائريةفيشر07-200-95صنع بواسطة قوارير كورنينج
لايف، فلتر كورنينج علوي/رقبة معلقة، 75 سم2 فيشر10-126-37
قوارير، فلتر كورنينج علوي/رقبة معلقة، 150 سم2Fisher10-126-34صنع بواسطة Corning Life
Hoseical Tubes، 50 مل، غطاء أزرقFisher14-432-22صنع بواسطة BD Biosciences
Conical Tubes، 15 مل، غطاء أزرقFisher14-959-70Cصنع بواسطة BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIصنع بواسطة Mediatech
RPMI، 500 ملLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM، 500 ملLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicillin/ الستربتومايسين / الجلوتامين ، 100xLife Technologies / Invitrogen10378-016
PBS مع المغنيسيوم والكالسيوم ، 500 ملLife Technologies / Invitrogen14040-133
PBS بدون المغنيسيوموالكالسيوم Life Technologies / Invitrogen20012-050
أنابيب Sarstedt ، ألوان متنوعةSarstedt72.694.996
صواني الخزان ل متعدد القنوات ، 55 ملفيشر13-681-501
DEAE-DexterrnFisherNC9691007
Corning 96 صفيحة دقيقة لزراعة الأنسجة السفليةب Fisher07-200-96صنع بواسطة Corning Life
HEPES ، 1 M Buffer SolutionLife Technologies / Invitrogen15630-080
FBS ، محدد ، 500 ملفيشرSH30070 03
X-galVWR PAV3941المصنعة بواسطة Promega
Glutaraldehyde ، الدرجة الثانية ، 25٪ في H2< / sub>OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M محلول كلوريد المغنيسيومSigma-AldrichM1028-100ML
، للبيولوجيا الجزيئية ، 36.5٪Sigma-AldrichF8775-500ML
البوتاسيوم hexacyanoferrate (II) ثلاثي الهيدراتSigma-AldrichP9387-100G
سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (III)سيجما ألدريتشP8131-100G
Allegra X15-R جهاز طردبيكمان كولتر392932
TC10 عداد الخلايا الآليBio-Rad1450001
VistaVision المجهر المقلوبVWR
dTTP ، [&alpha ؛ - 33 < / sup> P] - 3000 Ci / mmol ، 10 mCi / مل ، 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl ، درجة الحموضة 8.0Life Technologies / Invitrogen15568025يجب تعديلها إلى درجة الحموضة 7.8 مع KOH
2 M كلوريد البوتاسيوم (KCl) LifeTechnologies / InvitrogenAM9640G إلى 1 م حل
0.5 م EDTALife Technologies / Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
حمض البولي أدينيليك (بولي رأ) ملح البوتاسيوم   ؛شركة ميدلاند ريكائنP-3001
Oligo d (T) برايمرلايف تكنولوجيز / إنفيتروجين18418-012
ديثيوثريتول (DTT)سيجما ألدريتش43815-1G
SR ، شاشة فوسفور فائقة الدقة ،Perkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell 96 بئر صفيحة موديل (M) بولي كربوناتفيشر07-200-245المصنعة بواسطة Corning Life
Corning 96-well Microplate الألومنيوم الختم الشريط ، غير معقمفيشر07-200-684المصنعة بواسطة Corning Life
DE-81 ورقة تبادل الأنيونWhatman3658-915
ثلاثي الصوديوم سترات ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشS1804-1KG
كلوريد الصوديومفيشرS671-3
كاسيت التصوير الشعاعيالذاتي فيشرFB-CA-810
إعصار تخزين فوسبور الشاشةباكارد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208(2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424(2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033(2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018(2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung'u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041(2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. 12 (Unit 12 15), Forthcoming.
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HIV 1 Replication CapacityGag MJ4 Chimeric VirusesRestriction Enzyme CloningSubtype C HIV 1CEM Based T Cell LineRadio Labeled Reverse Transcriptase AssayViral Stock TiteringNested RT PCR AmplificationBCL One Restriction DigestionGXR25 Cell Infection

مقالات ذات صلة