مقالة منهجية

طريقتين لإنشاء أولي خلايا وانسجة بطانة الرحم الإنسان من استئصال الرحم العينات

DOI:

10.3791/51513

⸱

مايو 23, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Virginia, 2Department of Obstetrics & Gynecology, University of Virginia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنشاء نظم الثقافة الابتدائية بطانة الرحم انسجة الخلايا من عينات استئصال الرحم هي تقنية البيولوجية قيمة وخطوة حاسمة قبل متابعة مجموعة واسعة من ويهدف البحث. هنا، نحن تصف طريقتين تستخدم لإنشاء الثقافات اللحمية من أنسجة بطانة الرحم جراحيا مقطوعة من المرضى من البشر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد كرس الكثير من الجهود لإنشاء نظم في خلية ثقافة المختبر. تم تصميم هذه النظم في تصميم نموذج لعدد كبير من العمليات في الجسم الحي. نظم زراعة الخلايا الناشئة من عينات بطانة الرحم الإنسان ليست استثناء. وتتراوح التطبيقات من العمليات الفسيولوجية دوري طبيعية لأمراض الرحم مثل سرطانات أمراض النساء، والأمراض المعدية، وأوجه القصور الإنجابية. هنا، ونحن نقدم طريقتين لإنشاء خلايا انسجة بطانة الرحم الأساسي من مقطوعة جراحيا العينات استئصال الرحم بطانة الرحم. يشار الأسلوب الأول باسم "أسلوب تجريف"، ويتضمن تجريف الميكانيكية باستخدام شفرات الحلاقة أو الجراحية في حين يسمى الطريقة الثانية "طريقة التربسين." يستخدم هذا الأسلوب الأخير في النشاط الأنزيمي من التربسين لتعزيز الفصل بين الخلايا الأولية و ثمرة الخلية. نحن لتوضيح خطوة بخطوة منهجية من خلال الصور الرقمية والمجهري. ونحن كما قدمأمثلة الإلكترونية للتحقق من صحة بطانة الرحم خطوط الخلايا اللحمية في الوقت الحقيقي عبر تفاعلات البلمرة الكمية (QPCR) والمناعي (IF).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتكون جسم الإنسان الرحم من ثلاث طبقات، وperimetrium (أو المصلية)، وعضل الرحم، وبطانة الرحم. تميز كل من هذه الطبقات هي خطوة مهمة لإنشاء خطوط الخلايا بطانة الرحم. وperimetrium هو الأكثر الخارجي طبقة من الرحم ويتكون من خلايا المصلية رقيقة. عضل الرحم هو، طبقة وسطى سميكة من الرحم وتتألف من خلايا العضلات الملساء. يتم التعرف على بطانة الرحم والطبقة الداخلية للرحم، ويشمل الظهارية وخلايا انسجة السكان.

تنقسم بطانة الرحم الى مزيد من الطبقة القاعدية التي هو الافتراض السكان الخلية لإعادة ملء طبقة طبقة وظيفية كل ما يقرب من 28 أيام 1 الجذعية. طبقة من بطانة الرحم وظيفي الإنسان يخضع لتغيرات كيميائية حيوية والصرفية كبير في استجابة لتعميم الهرمونات. وتستمد هذه الهرمونات من الغدة النخامية والمبايض.

الإنتاج منسقة والإفراج عن نتائج الهرمونات في دورة الإنجابية. تم تصميم دورة التكاثر لتحضير بطانة الرحم لغرس الجنين الأحداث المحتملة. في البشر، ومن المعروف أن دورة التكاثر باسم "الدورة الشهرية" وينقسم إلى ثلاث مراحل - التكاثري، إفرازية، والحيض. المرحلة التكاثري ينطوي على انتشار وظيفي طبقة بطانة الرحم في حين وضعت المرحلة إفرازية بواسطة ظيفي النضج. على وجه التحديد، والتعديلات خارج الخلية، إفرازات، وتمايز الخلايا يشير إلى غرس المحتملة. إذا لم تحدث زرع قبل نهاية المرحلة إفرازية، وتسليط طبقة بطانة الرحم وظيفي أثناء مرحلة الحيض. لا تزال قيد المناقشة على أهمية الحيض والأحداث التي تؤدي إلى سفك طبقة طبقة وظيفية. في البشر، وقد طرحت أن الحيض هو نتيجة لحدث معين منتصف المرحلة إفرازية التمايز المعروفكما "decidualization عفوية" 2. في هذا المخطوط، ونحن نقدم منهجية مفصلة لكلتا الطريقتين العزلة خلية انسجة بطانة الرحم، واستخدام مزيج من المناعي والصور الرقمية لإثبات فعالية هذه النهج. بالإضافة إلى ذلك، نحن نطبق التي يشيع استخدامها في نموذج المختبر من decidualization عفوية لتأكيد بطانة الرحم العزلة الخلايا اللحمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع عينات استئصال الرحم المستخدمة في هذه المخطوطة في التوافق مع بروتوكول الأخلاق وافق الاتحاد الدولي للرجبي IRB الجامعة مرقمة-HSR # 14424.

1. شراء عينة من المصدر السريرية

  1. الحصول الحكومة والمبادئ التوجيهية الأخلاقية المستندة إلى المؤسسة وثائق الموافقة قبل بداية.
  2. إجراء جميع الخطوات في ظروف معقمة.
  3. الحفاظ على الأنسجة المشتقة من المريض في وسائل الإعلام (RPMI أو DMEM / ارتفاع الجلوكوز) في أنبوب 50 مل في 4 درجات مئوية إذا لا يمكن معالجة العينة في الثقافة على الفور. ويمكن تخزين العينات في هذه الدولة لمدة أقصاها 24 ساعة.
  4. غسل عينة الأنسجة ثلاث مرات مع 1X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتجاهل الحل بين يغسل.

2. إعداد خطوط الخلية الأولية باستخدام طريقة القشط

  1. إضافة 4-10 مل من وسائط النمو (أو RPMI DMEM / ارتفاع الجلوكوز تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين، streptomyCIN) للأنسجة وإضافة Fungizone (0.25 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) لمدة 30 دقيقة.
  2. تجاهل وسائل الاعلام النمو.
  3. غسل الأنسجة مرتين مع 1X PBS.
  4. وضع النسيج على لوحة الثقافة 6 سم خلية للتمييز بين عضل الرحم وبطانة الرحم طبقات (يرجى الرجوع إلى الأرقام 2A-2C لمزيد من الوصف). فصل بطانة الرحم.
  5. باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة، القطع الأنسجة الى قطع صغيرة في حين الخدش على طبق ثقافة 6 سم الخلية. هذه الخدوش تيسير المرفق من خلايا بطانة الرحم الأولية الناشئة. مقارنة لطريقة التربسين، هناك حاجة إلى المزيد من الأنسجة (انظر الشكل 2D لتقريب).
  6. بلطف، إضافة 2 مل من وسائط النمو إلى طبق خدش (لن تكون مرئية شظايا الأنسجة ويجمد مثالي من الحركة الخدش).
  7. نقل لوحة (ق) إلى حاضنة الثقافة الخلية المعينة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2). تعيين مكان لخطوط الخلية الأولية، بعيدا عن الغيرإيه الأطباق ثقافة الخلية. الثقافات الأولية هي أكثر حساسية للعدوى والتلوث.
  8. فحص الخلايا تحت المجهر ضوء اليومية. يجب أن المجموعات الصغيرة من الخلايا تظهر بعد يوم اثنين أو ثلاثة من مختلف شرائح الأنسجة (انظر الشكل 3B).
  9. للحفاظ على الثقافات، وغسل بلطف مع 1X PBS وإضافة وسائط النمو الطازجة (2ML) كل ثلاثة أيام. عندما يزيد معدل الانتشار، وسائل الاعلام نمو إضافية (3-4 مل) يمكن أن تضاف إلى لوحة الثقافة 6 سم (ق).
    ملاحظة: أثناء الغسيل وسائل الاعلام التغييرات، ومن المحتمل أن يستنشق قطعة من الأنسجة. هذا لن يؤثر على نمو الخلايا الملتصقة. يجب أن يستنشق قطعة من الأنسجة التي كتبها الخطوة اللاحقة (2.10) كما من غير المرجح أن تظهر بعد أسبوع واحد مستعمرات جديدة.
  10. عندما 6 سم لوحة ما يقرب من 75-80٪ متموجة (انظر الشكل 3B)، والمرور باستخدام التربسين 0.05٪. الخلايا الأولية لا يمكن passaged إلى أجل غير مسمى - تجميد أسفل لوحة واحدة من الخلايا في أقرب وقت سنتين أو ثلاث لوحات أماهintained. إذا كانت هناك حاجة أكثر الممرات، اتبع بروتوكول تخليد (إعادة النظر في المرجع 3).

3. إعداد خطوط الخلية الأولية باستخدام الأسلوب التربسين

  1. وضع قطعة صغيرة من أنسجة بطانة الرحم (انظر الشكل 2D لتقريب) في 2 مل من 0.25٪ التربسين تستكمل مع كاناميسين (0.03 ملغ / مل تركيز النهائي).
  2. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية على منصة دوارة لمدة 30 دقيقة.
  3. لفترة وجيزة دوامة الأنسجة.
  4. أجهزة الطرد المركزي في العينة 200-400 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف.
  5. إضافة التربسين الطازجة وكاناميسين.
  6. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية في حين تناوب لساعة.
  7. دوامة النسيج لمدة 5-10 ثانية.
  8. إضافة 2ML من وسائط النمو (تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين الستربتوميسين) لتنشيط التربسين.
  9. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا 200-400 x ج لمدة 2-3 دقيقة.
  10. تجاهل طاف وإضافة 2 مل من التربيةوسائل الإعلام عشر إلى الخلايا مكعبات.
  11. لوحة على طبق ثقافة 6 سم الخلية. تجريف لوحة كما في الخطوة 2.5 من إعداد خطوط الخلية الأولية باستخدام طريقة القشط ليست ضرورية، ولكن من شأنه أن يعزز المرفق وثمرة من الثقافات الأولية.
  12. مراقبة الخلايا تحت المجهر ضوء اليومية. وعادة ما تكون الخلايا مرئية تحت المجهر ضوء بعد 24-48 ساعة (انظر الشكل 3C).
  13. للحفاظ على الثقافات، ورصد الخلايا وسائل الإعلام تغيير كل 2-3 أيام كما في الخطوة 2.9.
  14. لمرور الخلايا، استخدم 0.05٪ أو 0.25٪ التربسين عندما تصل خلايا 75-80٪ confluency (انظر الشكل 3C).

4. حفظ الأنسجة إضافية لتحليل (عض التجميد والتثبيت الفورمالين)

  1. غسل العينة مرتين مع 1X PBS.
  2. نضح السائل بقدر الإمكان.
  3. التقط لتجميد، ضع عينة أنسجة بطانة الرحم في أنبوب الطرد المركزي 1.7 (انظر الأرقام و2F 2G). وضع 1.7أنبوب الطرد المركزي في النيتروجين السائل لمدة 10 ثانية أو حتى يمكن أن نرى أن الأنسجة جمدت أسفل.
    ملاحظة: الحرص على عدم لمس مباشرة النيتروجين السائل عند إعداد العينات. ويمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة أو التحليل.
  4. لالفورمالين التثبيت، وقطع قطعة صغيرة من أنسجة بطانة الرحم (انظر الشكل 2H)، ويغرق في 10٪ مخزنة الفورمالين الزنك. بعد 24 ساعة، تجاهل الفورمالين وإضافة الايثانول 70٪ لعينات الأنسجة حتى مزيد من المعالجة.

5. المناعي (IF)

  1. تثبيت الخلية
    1. إعداد الخلايا على شريحة ثقافة أو لوحة.
    2. بلطف، وغسل الخلايا مع 1X PBS.
    3. إضافة قبل المبردة (4 ° C) الميثانول والأسيتون (مختلطة في نسبة 1:1) لمدة 5 دقائق.
    4. الهواء الجاف الشريحة قبل المتابعة. ويمكن تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع إذا لزم الأمر.
  2. تجهيز IF
    1. ترطيب الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. لFOالنماذج التالية الخطوات 1-6، وإجراء جميع يغسل وحضانات على منصة دوارة.
    2. كتلة باستخدام 1X PBS تستكمل مع 1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) والأنواع 1٪ مصل محددة (مصدر 2 الثانية الضد) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. احتضان في الأجسام المضادة الأولية (انظر المصنعين توصيات لالتخفيفات الضد). الرجوع إلى مواد محددة الأجسام المضادة. تمييع الأجسام المضادة الأولية في عازلة تمنع جديدة كما في الخطوة 5.2.2. ويمكن إجراء هذه الحضانة لا يقل عن 2 ساعة على RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. احتضان في الضد الثانوية (انظر المصنعين توصيات لالتخفيفات الضد). تمييع الضد الثانوية في عازلة تمنع جديدة كما في الخطوة 5.2.2. لمنع الصور تبيض، فمن المهم إجراء هذه الخطوات اللاحقة وفي غياب الضوء.
    6. يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    7. Thoroughlذ تجفيف الشرائح.
    8. إضافة تصاعد وسائل الإعلام ودابي الحل counterstaining.
    9. تطبيق ساترة وختم الحواف باستخدام تسرب (ق). ويمكن تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل الى 2 أسابيع.

6. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. بيليه 1 × 10 7 الخلايا بواسطة الطرد المركزي. جميع المواد والكواشف في هذا البروتوكول يجب ريبونوكلياز الحرة.
  2. ليز الخلايا في 1 مل TRIZOL الكاشف، واحتضان العينات المتجانس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاستكمال تفارق المجمعات البروتين النووي.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم لكل 1 مل من TRIZOL. هزة بقوة باليد لمدة 15 ثانية، واحتضان لمدة 2-3 دقيقة في RT.
  4. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة (15،000 x ج) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. وسوف ينتج ثلاث طبقات.
  5. نقل المرحلة المائية الأعلى في أنبوب microcentrifuge الطازجة. إضافة 1 ميكرولتر الجليكوجين لزيادة الغلة RNA؛ ومع ذلك، هذه الخطوة كانت ضرورية فقط عندما تكون صغيرةومن المتوقع كمية من الحمض النووي الريبي.
  6. إضافة 0.5 مل من ايزوبروبيل إلى الطبقة المائية، وعكس العينات 3-5 مرات. احتضان العينات في RT لمدة 10 دقيقة. لزيادة الغلة، وعينات يمكن وضعها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. عند هذه النقطة، يجب أن يكون بيليه صغيرة من الحمض النووي الريبي مرئية. تجاهل طاف.
  9. غسل الحمض النووي الريبي مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪.
  10. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. يمكن غسلها العينات مرة أخرى لتخليص الملوثات غير العضوية، ولكن هذه الخطوة ليست ضرورية.
  11. لفترة وجيزة، وتجفيف بيليه الحمض النووي الريبي RNA حتى بيليه جافة (عادة ما يستغرق 7-10 دقيقة).
    ملاحظة: هناك خطوة إضافية يمكن استخدامها لتقليل المسألة غير العضوية وتقليل وقت التجفيف. بعد التخلص من طاف من غسل الإيثانول، وعينات تدور في أقصى سرعة لدقيقة إضافية ونضح السائل المتبقي. والحرص على عدم نضح بيليه.
  12. تذوب في الماء الحمض النووي الريبي ريبونوكلياز خالية، وهذا يتوقف على حجم بيليه الحمض النووي الريبي. وتتراوح أحجام عادة 10-50 ميكرولتر.
  13. احتضان العينات في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وقياس تركيز الحمض النووي الريبي.
  14. مخزن العينات في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

7. عكس النسخ

  1. إحضار عينة الحمض النووي الريبي (1-3 ميكروغرام) إلى وحدة تخزين من 9 ميكرولتر مع H 2 O.
  2. RNA الحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. لإنشاء مزيج الرئيسي AMV، والجمع بين الكواشف التالية: 5 ميكرولتر من dNTP (تركيز العمل من 50 ميكرومتر)، و 5 ميكرولتر من الحمض النووي oligos N6 (تركيز العمل من 80 ميكرومتر)، و 5 ميكرولتر من العازلة 5X AMV، و 1 ميكرولتر من AMV . تم تصميم هذا الحل مزيج الرئيسي في عينة واحدة.
  4. إضافة 16 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى RNA ساخنة. فإن حجم رد الفعل النهائي سيكون رد فعل 25 ميكرولتر.
  5. استخدام الشروط التالية لPCR النسخ العكسي: (المرحلة 1) 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، (ستاجنرال الكتريك 2) 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و(المرحلة 3) 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.

8. في الوقت الحقيقي PCR

  1. إجراء تفاعلات PCR باستخدام بادئات، ودرجات حرارة الصلب، وأرقام الدورة، والكواشف وجدت في الجدول 1.
    ملاحظة: هذا هو المثل الأعلى لاتباع إرشادات الشركة المصنعة عند استخدام الكواشف PCR (يرجى الرجوع إلى الشركة وكتالوج الأرقام في المواد).

9. في المختبر بروتوكول Decidualization (مشتقة من الرقم 4 و 5)

  1. لوحة خلايا بطانة الرحم.
  2. تنمو إلى confluency من 75-85٪.
  3. بعد أن تصبح خلايا متكدسة، ويغسل مرة واحدة مع 1X PBS.
  4. بسرعة، وإضافة وسائط خالية من هرمون (تستكمل الفينول RPMI مجانا مع 5٪ من الفحم قطاع FBS و 1٪ البنسلين الستربتوميسين).
  5. بعد 24 ساعة، إضافة هرمون حرة وسائل الإعلام تستكمل مع خلات ميدروكسي (MPA) في تركيز النهائي من 1 ميكرومتر و 8 bromoadenosine 3 '، 5'أحادي-دوري (المخيم) في تركيز النهائي من 0.5 ملم.
  6. بعد 48 ساعة على الأقل، ووقف رد الفعل وحفظ لوحة (ق) لمزيد من المعالجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما أكد في قسم البروتوكول، يجب التأكد من إجراء جميع الأساليب في ظل حكومة والمؤسسية، والمبادئ التوجيهية الأخلاقية عند التعامل مع وإعداد الأنسجة البشرية.

المدرجة في هذا المخطوط هو التوضيح من سير العمل العام "أسلوب تجريف" (الشكل 1A) و "طريقة التربسين" (الشكل 1B) تستخدم لإنشاء الثقافات بطانة الرحم الأولية. يتم وصف هذه الأساليب بالتفصيل في قسم البروتوكول

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وصفت جماعات أخرى وتكييفها منهجية لإعداد الثقافات انسجة بطانة الرحم، وهي في معظمها تستخدم كولاجيناز 4،12،13،15-18. في هذا المخطوط، قدمنا ​​المنهجية والدليل على طريقتين مبسطة الأولية بطانة الرحم الثقافة اللحمية، وكلاهما تستخدم من قبل مختبرنا لأسباب اقتصادية وتوافر مريحة من التربسين و / أو شفرة حلاقة.

عند المقارنة بين طريقتين لدينا، سواء بنجاح توليد الثقافات الأولية قابلة للحياة. الأسلوب المفضل لدينا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما الإفصاح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الجهود التعاونية الدكتور ثاو دانغ وأعضاء مختبر لها لاستخدام معدات التصوير والمجهر بهم. كما نشكر Biorepository والأنسجة مرفق البحوث (BTRF) الأساسية، جيف هاربر، والمقيمين في جامعة فيرجينيا لتزويدنا أنسجة الرحم. نشكر كارول Szlachta للمساعدة في تخطيطي لمحة عامة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25 تريبسين أو 0.05٪ تريبسين & nbsp ؛HycloneSH3023602 أو SH30004202
1.7 أنبوب الطرد المركزي الصغير    جينيسي العلمي22-272A
1 & micro; ل, 20 & لتر ، 200 مل و 1,000 ميكرو ؛ ل ماصة   ؛  جينيسي العلمية24-401،24-402 ، 24-412 ، 24-430
15 مل أنبوب مخروطي   ؛Hyclone339650
50 مل أنبوب مخروطي Hyclone339652
طبق ثقافة الخلية 6 سم   ؛Thermo Scientific12-556-002
8 آبار Chambers Thermo ScientificAB-4162
Acetate فيشر العلميC4-100
AMV RT إنزيم / عازلة   ؛Bio LabsM077L
ألبومين مصل الأبقار (BSA)  فيشر ساينتفيكBP-1605-100
فورمالين الزنك المخزن المؤقت Thermo59201ZF
شريط الفحم FBS فيشرNC9019735
كلوروفورم فيشر ScientificBP1145-1
غطاء زلة فيشر براند12-544D
أمبير دوري (cAMP) سيجماB7880
DMEM / ارتفاع الجلوكوز HycloneSH30243FS
dNTP BiolineBIO-39025
الحمار المضاد للماعز -TRITC سانتا كروزSC-3855
مصل الحمير جاكسون s lab017-000-002
E Cadherin Antibody   Epitomics1702-1
Ethanol فيشر ScientificBP2818-1
مصل الأبقار الجنينية (FBS) فيشر ساينتفيك03-600-511
Fungizone Amphotericin B & nbsp ;Gibco15290-018
مسبار GAPDH لايف تكنولوجيزHS99999905
الجليكوجين 5برايم2301440
الماعز المضاد للفأر - FITC جاكسون s Lab115-096-003
Isopropanol  فيشر العلميBP2618-1
Kanamycin   فيشر ScientificBP906-5
أسيتات ميدروكسي بروجستيرون (MPA)   ؛سيجماM1629
MeOH (الميثانول) فيشر ساينتفيكA4-08-1
تصاعد الوسائط (ث / DAPI) ناقلات المراعزH-1500
N6 DNA Oligos Invitrogen
   BD371615
عموم السيتوكيراتين   ؛ الماوس mAB إشارات الخلية4545
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)   ؛فيشر ساينتفيكBP-399-4
محلول الجلوتامين البنسلين والستربتومايسين 100X & nbsp ؛  HycloneSV30082.01
PML مضاد للماعز المضاد للجسم  سانتا كروزSC-9862
التمهيدي  Eurofins
RPMI HycloneSH30027FS
RPMI (خال من الفينول) Gibco11835
Sybr Green   ترمو ساينتيكAB-4162
Taqman ThermoAB-4138
Trizol لايف تكنولوجيز15596018
Vimentin Antibody الإيتوميكس4211-1
مكشطة رقم 15

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heller, D. in The endometrium: a clinicopathologic approach. Heller, D. , 56-75 (1994).
  2. Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
  3. Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
  4. Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
  5. Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
  6. Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
  7. Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
  8. Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
  9. Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
  10. Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
  11. Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
  12. Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
  13. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
  14. Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
  15. Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
  16. Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
  17. Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
  18. Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
  19. Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
  20. Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
  21. Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
  22. American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , Available from: http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322 (2013).
  23. Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

qPCR

مقالات ذات صلة