عامل نمو Electrospinning الافراج الجزئي في الليفية السقالات

أحد التحديات المستمرة في هندسة الأنسجة العصبية هو خلق قناة العصبية (NC) الذي يحاكي مصفوفة الخلوية الإضافية، حيث تنمو الأعصاب بشكل طبيعي. وقد أظهرت الأبحاث أن الخلايا تستجيب إلى عدة عوامل في بيئتها بما في ذلك الميكانيكية، والطبوغرافية، لاصق وإشارات كيميائية ^1-3. أحد التحديات الرئيسية في هذا المجال وتحديد توليفة مناسبة من الإشارات وافتعال النظام الذي يمكن الحفاظ العظة لفترة طويلة لدعم نمو الخلايا ^4. ومن المعروف أن الخلايا العصبية الطرفية يفضلون ركيزة لينة، يتم إخراج الألياف الانحياز، واستجابة لعامل نمو الأعصاب (NGF) ^5-7. وقد ثبت أن البلاغات التي يمكن أن توفر الاشارات الكيميائية لأسابيع لتوفير وتحسين الانتعاش وظيفية أقرب إلى أن من المغايرة، المعيار الذهبي الحالي للإصلاح العصبية ^8،9.

المواد وطرق الإنتاج المختلفة يمكن استخدامها لإنتاج الميكانيكية والطبوغرافيةآل العظة ^10-13. العظة الميكانيكية هي الملازمة لاختيار المواد، مما يجعل اختيار المواد المناسبة لتطبيق الحرج ^1،13. أساليب الإنتاج للسيطرة وتشمل العظة الطبوغرافية مرحلة الانفصال، التجميع الذاتي وelectrospinning ^1،13. لتطبيقات الميكروسكيل، على microfluidics، photopatterning، الحفر، الترشيح الملح، أو الرغاوي الغاز يمكن أن تستخدم أيضا ^14-17. وقد برز Electrospinning باعتبارها السبيل الأكثر شعبية لهندسة ركائز لزراعة الأنسجة الليفية بسبب مرونته وسهولة إنتاج ^13،18-23. هي ملفقة ألياف النانو Electrospun عن طريق تطبيق الجهد العالي إلى حل البوليمر الامر الذي ادى الى صد نفسها وتمتد عبر فجوة قصيرة لأداء ^24. يمكن إنشاء سقالة الانحياز عن طريق جمع الألياف على مغزل بالتناوب على الارض ويتم جمع السقالات عدم الانحياز على لوحة ثابتة ^25. ويمكن تحقيق التصاق الإشارات بواسطة طلاء سقالة الطرافة ليفيةح فبرونيكتين أو التصريف على التصاق الببتيد، مثل RGD، إلى HA قبل electrospinning ^26.

الإشارات الكيميائية، مثل عوامل النمو، هي الأكثر صعوبة في الحفاظ على مدى فترات طويلة لأنهم بحاجة إلى مصدر للافراج رقابة. وقد حاول العديد من أنظمة لإضافة الافراج تسيطر على شبكات ليفية electrospun مع مستويات متفاوتة من النجاح. وتشمل هذه الأساليب electrospinning مزيج، مستحلب electrospinning، قذيفة الأساسية electrospinning والبروتين اقتران ^27. بالإضافة إلى ذلك، يتم electrospinning تقليديا في مذيب متطاير، والتي يمكن أن تؤثر على صلاحية البروتين ^28، لذلك يجب النظر في الحفاظ على النشاط الحيوي للبروتين.

ويتناول هذا النهج تحديدا الجمع، الطبوغرافية، وإشارات لاصقة الكيميائية والميكانيكية لإنشاء سقالة الانضباطي للنمو الأعصاب الطرفية. يتم التحكم الميكانيكا سقالة بدقة عن طريق تجميعحمض هيالورونيك methacrylated (HA). وتستخدم المواقع methacrylation إرفاق صورة crosslinkers رد الفعل. المواد crosslinked لم يعد للذوبان في الماء، ويتم تقسيم حصرا بنسبة ²⁹ الانزيمات. كمية يشابك يتغير معدل التحلل، والميكانيكا وغيرها من الخصائص الفيزيائية للمادة. باستخدام HA مع 30٪ methacrylation، التي لديها معامل الشد من ~ 500 باسكال، ويخلق ركيزة الناعمة التي هي قريبة من الميكانيكا الأم من الأنسجة العصبية ويفضل عادة من قبل الخلايا العصبية ^26،29. Electrospinning على مغزل بالتناوب يتم استخدامها لإنشاء ألياف الانحياز لجديلة الطبوغرافية. باستخدام electrospinning مع المجهرية يوفر إشارات الكيميائية داخل السقالة على مدى فترات طويلة. لدعم النمو محوار المجهرية تحتوي على NGF يتم استخدامها لإنشاء إشارة كيميائية. وخلافا لمعظم المواد electrospun HA قابل للذوبان في الماء لذلك NGF لا تواجه المذيبات قاسية أثناء الإنتاج. لإضافة إشارة لاصقة، وهيئة السلع التموينيةوهي مغلفة مع فبرونيكتين ffold. يحتوي على نظام الانتهاء من جميع الأنواع الأربعة من الإشارات المذكورة أعلاه: لينة (الميكانيكية) محاذاة (الطبوغرافية) الألياف مع NGF الإفراج المجهرية (الكيميائية) المغلفة مع فبرونيكتين (لاصق). يوصف إنتاج واختبار هذا النظام في هذا البروتوكول.

العملية تبدأ إنتاج المجهرية مع مزدوجة مستحلب المياه في والنفط في المياه. واستقرت مستحلب مع السطحي، كحول البولي فينيل (PVA). المرحلة المياه الداخلية تحتوي على البروتين. كما يتم إضافته إلى مرحلة النفط، التي تحتوي على المواد قذيفة PLGA حله في ثاني كلورو ميثان (DCM)، والسطحي يخلق حاجزا بين المراحل حماية البروتين من DCM. هذا هو مستحلب من المياه فرقت في مرحلة أخرى تحتوي على PVA لإنشاء السطح الخارجي للالمجهرية. يحرك مستحلب مستقر للسماح للDCM لتتبخر. بعد الشطف وlyophilizing كنت مع ترك المجهرية تابع الجافaining البروتين.

بعد الانتهاء من المجهرية التي تكون جاهزة للelectrospun في السقالات. أولا أنت تعد الحل electrospinning. اللزوجة من حل أمر حاسم لتشكيل الألياف المناسب. حلول النقي HA لا تلبي هذا المطلب. يضاف PEO كما البوليمر الناقل للسماح electrospinning. تضاف المجهرية في حل وelectrospun مما أدى إلى سقالة ليفية مع المجهرية وزعت في جميع أنحاء.

مرة واحدة إنتاج كاملة، ينبغي اختبار البروتين للتحقق من قدرتها على البقاء. للقيام بذلك، والخلية الأولية التي تستجيب لNGF يمكن استخدامها. يستخدم هذا البروتوكول الجذر الظهرية العقد (DRG) من أجنة الدجاج يوم 8-10 القديمة. هي المصنفة حزم الخلايا على السقالات التي تحتوي على المجهرية مليئة NGF أو تلك التي هي فارغة. إذا كان NGF لا يزال قابلا للتطبيق سترى تعزيز النمو محوار على السقالات التي تحتوي على NGF. إذا كان NGF لم يعد قابلا للتطبيق وسوفلا تعزيز neurites التي لتوسيع ويجب أن تظهر مشابهة لعنصر التحكم.

ويتركز الإجراء المحدد الموصوفة هنا على دعم العصبي، ومع ذلك، مع تعديلات بسيطة على المواد، طريقة electrospinning، وبروتينات نظام يمكن أن يكون الأمثل لمختلف أنواع الخلايا والأنسجة.

1. المياه / النفط / المياه مستحلب مزدوجة المكروية الإنتاج

1. أولا إعداد 2٪ و 0.5٪ ث / حلول v من الكحول البولي فينيل (PVA) في الماء منزوع الأيونات. تحريك الحلول عند 50 درجة مئوية حتى واضح، وهذا قد يستغرق عدة ساعات. تحضير محلول 2٪ V / V الآيزوبروبيل الكحول في الماء منزوع الأيونات.
2. تحضير محلول مائي من البروتين المطلوب ماء. ويقدم الجدول أدناه سبيل المثال تركيبات.

الجدول 1: مثال حلول البروتين تم تغليف البروتين الحلول التالية بنجاح وelectrospun يستخدم هذا البروتوكول. حلول البروتين ماء أخرى يمكن استخدامها حسب الحاجة.

3. وضع 40 مل من محلول PVA 0.5٪ في أنبوب 50 مل الطرد المركزي وتوضع جانبا.
4. في أنبوب الطرد المركزي 15 مل حل 300 ملغ من 65:35بولي (حمض اللبنيك-CO-الجليكوليك) (PLGA) في 3 مل من ثاني كلورو ميثان. وخلاط دوامة يمكن أن تستخدم لتسريع PLGA الحل.
5. الجمع بين 200 ميكرولتر من محلول البروتين و 4 ميكرولتر من 2٪ من محلول PVA. صب خليط من البروتين في حل PLGA (الخطوة 1.4). ستبقى الحلول في الغالب منفصل.
6. وضع أنبوب في كوب من الماء المثلج. باستخدام sonicator عصا في ~ 10 واط (RMS)، تستنهض الهمم الحل لبضع ثوان (5-10) حتى يتم إنشاء مستحلب أبيض دسم موحد.
7. صب مستحلب في أنبوب 50 مل تحتوي على 0.5٪ PVA (الخطوة 1.3). مزيج الحل بسرعة عالية على خلاط دوامة لمدة 20 ثانية ~. فإن الحل تطوير مظهر غائم.
8. نقل مستحلب لكوب 200 مل ومكان على طبق من ضجة في 350 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. إضافة 50 مل من 2٪ ايزوبروبيل إلى الدورق على لوحة ضجة. السماح للخليط أن يستمر التحريك لمدة لا تقل عن 1 ساعة للسماح للDCM لتتبخر وPLGA لتتصلب.
9. نقل رانه المكروية الحل في أنابيب الطرد المركزي.
10. أجهزة الطرد المركزي في 425 x ج لمدة 3 دقائق. سوف المجهرية جمع في أسفل الأنبوب وتظهر بيضاء. إزالة بعناية طاف من الأنبوب، فوق المجهرية، وتخزينها في زجاجة 500 مل.
11. شطف مع الماء منزوع الأيونات المجهرية عن طريق ملء الأنبوب ثلاثة أرباع بالكامل والهز إعادة توزيع المجهرية في السائل.
12. كرر الخطوات 1.10 و 1.11 أربع مرات.
13. بعد شطف النهائي، وإزالة طاف مرة أخرى ووضعه في زجاجة 500 مل مع عينات أخرى. تجميد المجهرية التي تم جمعها في أنبوب الطرد المركزي، ثم يجفد لمدة 24 ساعة على الأقل.
14. تصور المجهرية تحت المجهر ضوء أو مع الكترون المجهر الضوئي. المجهرية أي أكبر من 60 ميكرون هي لelectrospinning فعالة. إذا المجهرية كبيرة جدا، قد تكون هناك حاجة sonicating أو vortexing لمرات أطول في الخطوة 1.6 أو 1.7.
<لى> المتجر المجهرية المجففة في الثلاجة -20 درجة مئوية.
15. اختياري: استخدام فحص البروتين، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، لاختبار كمية البروتين في زجاجة 500 مل من الخطوة 1.10 ^30. ويستخدم هذا لحساب النسبة المئوية للبروتين مغلفة في المجهرية، وذلك بطرح المبلغ في حل من ما تم استخدامه في عملية الإنتاج.

ملاحظة: لتصور المكان البروتين في المكروية إضافة رودامين 2 ميكروغرام / مل في حل PLGA ³¹ و تغليف البروتين مترافق FITC الشكل 1 يبين مثال.

2. Electrospinning مع المجهرية

1. قبل إعداد حل electrospinning، إنشاء 0.5٪ ث / ت حل photoinitiator، في الماء منزوع الأيونات عن طريق إذابة عند 37 درجة مئوية. قد تستغرق هذه العملية عدة ساعات.
2. إنشاء 2٪ ث / ت methacrylated حمض الهيالورونيك (MEHA) (انظر Burdick وآخرون لتخليق) ^29، 3٪ث / ت 900 دينار بولي (أكسيد الاثيلين) (PEO) و 0.05٪ ث / ت حل صورة البادئ في الماء منزوع الأيونات.
   1. حساب المبلغ الصحيح للMEHA وPEO للحجم المطلوب. على سبيل المثال، 10 مل من حل electrospinning تتطلب 200 ملغ من MEHA و 300 ملغ من PEO.
   2. حل PEO في الماء منزوع الأيونات في 90٪ من الحجم النهائي المطلوب (9 مل لهذا المثال). قد يستغرق هذا عدة ساعات، لوحة اثارة ساخنة أو حمام الماء عند 37 درجة مئوية يمكن استخدامها لتسريع العملية.
   3. التالي إضافة MEHA واستخدام خلاط دوامة لتحريك الحل حتى اضحة. وهذا سوف يستغرق سوى بضع دقائق.
   4. أخيرا إضافة 0.5٪ الحل صورة المبادر لملء حجم 10٪ المتبقية (1 مل لهذا المثال).
3. إضافة المجهرية في التركيز المطلوب يصل إلى 400 ملغ / مل. مزيج الحل على خلاط دوامة حتى يتم توزيعها بالتساوي المجهرية في الحل.
4. نقل الحل إلى حقنة وإرفاق قياس 18 بوصة 6 BLالاتحاد الوطني للعمال إبرة معلومات سرية.
5. وضع الحقنة في ضخ حقنة وضعه على الاستغناء عند 1.2 مل / ساعة.
6. الشريط طبقة من رقائق الألومنيوم على لوحة أو جمع مغزل. وهذا يسمح لسهولة تنظيف وتخزين السقالة النهائية. ويستخدم مغزل بالتناوب لخلق ألياف الانحياز. وهناك لوحة مسطحة أو مغزل ثابتة يؤدي إلى الألياف رتبت عشوائيا.
7. بتوصيل سلك الأرض من مصدر الطاقة العالية الجهد لجهاز التحصيل. ربط قيادة إيجابية للإبرة.
8. ضبط ضخ حقنة وجمع السطح حتى لا يكون هناك 15 سم بين رأس الإبرة وسطح المجموعة.
9. بدء ضخ البوليمر، عندما حل مرئيا في نهاية الحقنة، بدوره على مصدر الجهد وضبط الجهد إلى 24 كيلو فولت تنبيه: بمجرد تشغيل التيار الكهربائي عن لا تلمس أي جزء معدني للنظام. قد تهمة أيضا القفز مسافات قصيرة من أجزاء المكهربة على الجلد.
10. تشغيل حل حتى دويتحقق سمك سقالة esired. عند اكتماله إيقاف مصدر الجهد وضخ حقنة.
11. إزالة احباط مع سقالة المرفقة. يتم تخزين السقالات الانتهاء تحتوي على البروتين في الثلاجة -20 درجة مئوية.

3. البروتين اختبار النشاط الحيوي

1. إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام. إضافة 10٪ V / V مصل بقري جنيني، 1٪ V / V L-الجلوتامين، و 1٪ V / V البنسلين، الستربتوميسين إلى Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة.
2. اختر coverslips الزجاج التي تناسب تماما في لوحة جيدا.
3. استخدام 3- (Trimethoxysilyl) ميتاكريليت بروبيل لعلاج لل coverslips كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. Methacrylation يعزز سقالة التمسك لل coverslips.
4. إرفاق coverslips methacrylated إلى المنطقة مجموعة من electrospinner مع القابلة للإزالة الشريط مزدوجة من جانب قبل electrospinning. الغزل على لل coverslips يخفف المناولة والمشاهدة.
5. Electrospin للسمك المطلوب كما هو موضح أعلاه.
6. وأي fter electrospinning إزالة بعناية coverslips من مغزل. وضع السقالة coverslips المغلفة في غرفة النيتروجين واضحة والتأكد من أن جميع الأكسجين يتم إزالة.
7. وضع الغرفة والسقالة تحت 10 ميغاواط / سم ² 365 نانومتر ضوء لمدة 15 دقيقة. بعد يشابك المكان إلى لوحة جيدا بحجم مناسب. تأكد من أن الجانب سقالة يكون مواجها لها.
8. السقالات مكان تحت مصباح مبيد للجراثيم لمدة 30 دقيقة لتعقيم. إذا تم استخدام فبرونيكتين المطلوب أو غيرها من البروتين وطلاء لتعزيز التصاق الخلية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة إلى معطف السقالات.
9. الحصاد الجذر الظهرية العقد (DRG) كما هو موضح سابقا بواسطة نقل بيان عسكري ^32. وستكون هناك حاجة واحدة DRG لكل سقالة مغطاة ساترة اختبارها.
10. وضع 100-200 ميكرولتر من وسائل الإعلام على كل سقالة في لوحة جيدا. وضع بعناية DRG واحدة على كل سقالة في قطرة سائل الإعلام. للسقالة سميكة قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من وسائل الإعلام. DRG ينبغي غمرها بالكامل وليس floaتينغ.
11. احتضان السقالة وDRG عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة للسماح للخلايا التمسك السقالة.
12. ملء وسائل الإعلام إلى المستوى المناسب لوضع البئر والعودة إلى الحاضنة. مواصلة احتضان لمدة 4-6 أيام.
13. بعد فترة الحضانة إزالة بعناية وسائل الإعلام من كل بئر وغسل بلطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام 4٪ ث / ت امتصاص العرق.
14. خلايا صمة عار وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة للخيط عصبي. وهذا سوف يسمح تصور من ثمرة neurite للالكمي. ويمكن أيضا أن تستخدم دابي لعرض نوى الخلايا. وصفت بروتوكول سبيل المثال تلطيخ بواسطة Sundararaghavan وزملاؤه ^14.
15. تصور الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت.
    1. وضع لوحة جيدا على مسرح المجهر.
    2. تحديد كتلة الخلايا باستخدام إعدادات التصفية والإثارة للدابي.
    3. مرة واحدة الخلية هو تبديل فلتر لFITC لتصور neurites التي ممتدة. Uالغناء وظيفة غرزة على المجهر جمع والجمع بين العديد من الصور حسب الحاجة لرؤية هيكل كامل. أكرر للدابي، FITC والميدان مشرق.

المجهرية 50 ± 14 ميكرون في القطر مع أكثر من 85٪ بروتين التغليف وقد تم إنتاج باستمرار وelectrospun في السقالات. تم تحديد حجم بواسطة التصوير العينات المجهرية من إنتاج ثلاث دفعات منفصلة. الصور التي تم التقاطها بواسطة المجهر الضوئي حيث أطوال وقياسها باستخدام برنامج المختبر التجاري. الشكل 1 يظهر الرسم البياني للحجم التوزيع. تم اختبار معدل التغليف أيضا من ثلاث دفعات منفصلة المكروية، عن طريق قياس البروتين الذي هرب أثناء عملية الإنتاج.

ويبين الشكل 2 المجهرية التمثيلية مع رودامين (2 ميكروغرام / مل) في PLGA الزلال قذيفة والأبقار المصل (BSA) -FITC مغلفة داخل. وقد أخذت صور باستخدام مجهر فلوري. قذيفة يمكن رؤيتها بوضوح (الحمراء) مع البروتين تتركز في الداخل (الخضراء).

لتقييم التغليف، والمكرويةامتلأت ق مع BSA واختبار لاطلاق البروتين مع البروتين الفحص برادفورد. PLGA ينهار قبل التحلل من السندات استر، وخلق فجوات أكبر للبروتين الهروب. تستمر المجهرية الإفراج عن أكثر من 60 يوما (الشكل 3). يبدأ مع إطلاق ثم يستمر الاندفاع الأولي وكسر المجهرية أسفل.

بعد electrospinning المجهرية يمكن رؤيتها في جميع أنحاء هيكل ليفي 3D الشكل 4 يوضح صورة SEM من السقالة كاملة حيث يمكن رؤية المجالات في طبقات متعددة (المشار إليها السهام). وقد تم قياس توزيع المجهرية في السقالات لتكون 15.3 ± 3.6 المجالات / مم 2. السقالة تحمل المجهرية في مكان منع الهجرة بعيدا عن موقع الهدف. كما كسر أسفل المجهرية التي يطلقون NGF في سقالة لتشجيع النمو محوار 33،34. هذا يخلق تسليم المستمر من البروتين في جميع أنحاء سقالة لدعم نمو الخلايا وتشجيع الخلايا على التسلل إلى السقالة.

أخيرا، استخدمت الجذر الظهرية العقد (DRG) لاختبار جدوى NGF في المجهرية، داخل سقالة الشكل 5 يبين المصنف على DRG على السقالة التي تحتوي على المجهرية محملة NGF بجانب واحدة تحتوي على المجهرية مع عدم وجود البروتين في نفوسهم. هناك ملحقات محوار أطول مرئية تمتد من DRG على منصة الاعدام NGF، مشيرا الى ان NGF بقي قابلا للتطبيق وتحفيز النمو.

الرقم 1. توزيع حجم المكروية. المجهرية التي ينتجها هذا البروتوكول هي 50 ± 14 ميكرون في القطر. يظهر الرسم البياني الرسم البياني من القطر المكروية في 5 ميكرون صناديق.

2highres.jpg "/>
أدرج الرقم 2. صورة نيون من المجهرية. 2 ميكروغرام / مل رودامين في حل PLGA لتصور قذيفة المكروية (الحمراء) ومغلفة BSA-FITC لتصور البروتين (الخضراء). يمكن بوضوح أن ينظر البروتين داخل المجال. شريط النطاق = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. البروتين الإصدار المنحنى. الافراج عن BSA المجهرية تم قياس أكثر من 60 يوما باستخدام الفحص البروتين برادفورد. ومن المرجح بسبب BSA التي كانت تعلق على السطح الخارجي للانفجار الأولي. كما يكسر PLGA أسفل، يتم تحرير البروتين مع مرور الوقت.

/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
الرقم 4. سقالة تحتوي على المجهرية. تسمح عملية electrospinning لإدراجها المجهرية في جميع أنحاء عمق السقالة. (A) السهام تشير إلى موقع المجهرية. مقياس بار = 500 صورة ميكرون (B) عالية التكبير من المكروية واحد مع ألياف النانو من السقالة فوقه. شريط النطاق = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

كانت تحصد الرقم 5. NGF اختبار النشاط الحيوي. الظهرية جذر العقد الخلايا الأولية من يوم 8 البيض فرخ القديمة والمصنفة على السقالات مع المجهرية NGF شغل (A) أو المجهرية فارغة (B). DRGsكانت ملطخة مع الأجسام المضادة خيط عصبي، FITC الضد الثانوية ودابي لتصور نواة الخلية. الصور تظهر زيادة ثمرة neurite في حضور المجهرية NGF تحميلها كما يتبين من neurites التي ملطخة FITC (الخضراء). معارض صدر هذا NGF غير قابلة للحياة ويمكن أن تعزز النمو. وقد أخذت صور مع المجهر متحد البؤر. مقياس بار = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.