هنا ، نقدم بروتوكولات زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) ، بناء على نمو أحادي الطبقة من النوع غير المستعمري (NCM) للخلايا المفردة المنفصلة. هذه الطريقة الجديدة ، باستخدام مثبطات كيناز مرتبطة بالروي أو الشكل الإسوي اللامينين 521 (LN-521) ، مناسبة لإنتاج كميات كبيرة من hPSCs المتجانسة ، والتلاعب الجيني ، واكتشاف الأدوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) تحمل وعدا كبيرا للطب التجديدي وتطبيقات المستحضرات الصيدلانية الحيوية. حاليا ، تعد الثقافة المثلى والتوسع الفعال لكميات كبيرة من hPSCs من الدرجة السريرية من القضايا الحرجة في العلاجات القائمة على hPSC. تقليديا ، يتم نشر hPSCs كمستعمرات على كل من أنظمة الاستزراع المغذية والخالية من التغذية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها العديد من القيود الرئيسية ، بما في ذلك انخفاض إنتاجية الخلايا وتوليد خلايا متمايزة بشكل غير متجانس. لتحسين طرق زراعة hPSC الحالية ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة جديدة تعتمد على ثقافة أحادية الطبقة من النوع غير المستعمري (NCM) للخلايا المفردة المنفصلة. هنا ، نقدم بروتوكولات NCM التفصيلية بناء على مثبط كيناز المرتبط ب Rho (ROCK) Y-27632. نقدم أيضا معلومات جديدة بخصوص ثقافة NCM مع جزيئات صغيرة مختلفة مثل Y-39983 (مثبط ROCK I) ، فينيل بنزوديوكسان (مثبط ROCK II) ، وثيازوفيفين (مثبط جديد ل ROCK). نقوم بتوسيع بروتوكولنا الأساسي لزراعة hPSCs على بروتينات محددة خارج الخلية مثل الشكل الإسوي اللامينين 521 (LN-521) دون استخدام مثبطات ROCK. علاوة على ذلك ، استنادا إلى NCM ، أظهرنا تعداء أو نقل فعال للحمض النووي البلازميد ، وجزيئات الفيروسات ، والحمض النووي الريبي الصغير القائم على قليل النوكليوتيدات إلى hPSCs من أجل تعديل هذه الخلايا وراثيا للتحليلات الجزيئية واكتشاف الأدوية. تتغلب الطرق القائمة على NCM على أوجه القصور الرئيسية في الثقافة من نوع المستعمرة ، وبالتالي قد تكون مناسبة لإنتاج كميات كبيرة من hPSCs المتجانسة للعلاجات السريرية المستقبلية وأبحاث الخلايا الجذعية واكتشاف الأدوية.
المقدمة
قدرة hPSCs للتمييز نحو أنسجة البالغين multilineage فتحت آفاقا جديدة لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية الشديدة التي تنطوي، الكبد، البنكرياس، والنظم العصبية 1-4. أن مختلف أنواع الخلايا المشتقة من hPSCs أيضا توفير منصات الخلوية قوية لنمذجة المرض، والهندسة الوراثية، وفحص المخدرات، واختبار السمية 1،4. القضية الرئيسية التي تضمن التطبيقات السريرية والدوائية مستقبلهم هو الجيل أعداد كبيرة من hPSCs السريرية الصف من خلال زراعة الخلايا في المختبر. ومع ذلك، ونظم الثقافة الحالية هي إما غير كافية أو متغيرة بطبيعتها، تضم مختلف المغذية وخالية من تغذية ثقافات hPSCs كما المستعمرات 5،6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
خلية واحدة غير القائمة على مستعمرة من نوع أحادي الطبقة (NCM) ثقافة hPSCs.
1. الاستعدادات
- جعل 500 مل من المتوسط للثقافة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs): المتوسطة DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، و 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
- عزل الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) الخلايا المشتقة من سلالة CF1 بعد بروتوكول روتيني 16 و ثقافة MEFs على 0.1٪ 6 جيدا لوحة خلية ثقافة المغلفة الجيل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
والمخطط العام للثقافة NCM
يمثل الشكل 1 نموذجي NCM الثقافة مخطط يوضح التغيرات الدينامية من hPSCs بعد ارتفاع الكثافة الطلاء وحيدة الخلية في وجود المانع ROCK Y-27632. وتشمل هذه التغييرات المورفولوجية وصلات بين الخلايا بعد الطلاء، وتشكيل مجموعات الخلوية، ونمو الخلايا الأسي تليها التكثيف الخلية (الشكل 1A). تجربة تمثيلية يشير WA01 (H1) hESCs، مطلي على شكل خلايا وحيدة ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك طريقتان الرئيسية لhPSCs الثقافة في المختبر: الثقافة التقليدية مستعمرة من نوع (الخلايا على مغذيات أو مصفوفات خارج الخلية) والثقافة تعليق hPSCs كما المجاميع دون مغذيات 6. وتشمل القيود المفروضة على حد سواء من نوع المستعمرة وتعليق وسائل الثقافة التجانس المتراكمة وتغييرات جينية للتوريث. ثقافة NCM، استنادا إلى كل من الركض وحيدة الخلية وذات الكثافة السكانية العالية والطلاء الخلية، يمثل طريقة جديدة للثقافة hPSC نمو 6،18. على الرغم من أن تم توثيق مختلف أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) في المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية. نود أن نشكر الدكتور رونالد د. مكاي على مناقشته وتعليقاته على هذا المشروع.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| عداد الخلايا الآلي للكونتيسة | Invitrogen Inc. | C10227 | عد الخلايا الأوتوماتيكي |
| الأشعة السينية لخزانة | الفاكسيترون شركة الأشعة السينية ، ويلنج ، إلينوي & nbsp ؛ | الموديل RX-650 | تشعيع الأشعة السينية لألواح MEFs |
| MULTIWELL ذات 6 آبار | Becton Dickinson Labware | 353046 | ألواح البوليسترين |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965 – 092 | بالنسبة لوسيط MEF |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | مثبط الانقسام |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | لتفكك |
| MEF DMEM / F12 | Invitrogen Inc. | 11330 &ndash ؛ 032 | ل hPSC المتوسطة |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | شركة Invitrogen | 31985-062 | لتعداء hPSC تعدين |
| FBS | Invitrogen Inc. | 16000 & ndash ؛ 044 | مكون من MEF |
| متوسط خروج المغلوب مصل | استبدال Invitrogen Inc. | 10828 &ndash ؛ 028 | KSR ، مكون hPSC المتوسطة |
| Dulbecco s المحلول الملحي المخزنة بالفوسفات | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS ، خالي من Ca2 + < / sup> / Mg 2 + < / sup> |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | Invitrogen | 11140 & ndash ؛ 050 | NEAA ، مكون من hPSC متوسط |
| L-Glutamine | Invitrogen ؛ | 25030 – 081 | مكون hPSC متوسط |
| mTeSR1 & المكملات | الغذائية StemCell Technologies | 5850 | TeSR2 الخالية من البروتين الحيواني |
| & المكملات | الغذائية StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | مكون hPSC المتوسط |
MEF (CF-1) ATCC | مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC) | SCRC-1040 | لثقافة التغذية لمركبات hPSCs |
| المؤهلة من hESC Matrigel | BD Bioscience | 354277 | للاستزراع الخالي من التغذية لمركبات السلم والأوعية الدموية |
| الشاملة Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | البروتين المؤتلف البشري |
| FGF-2 (FGF المؤتلف ، أساسي) | R & D Systems ، MN | 223-FB | عامل النمو في hPSC المتوسطة |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X محلول إنزيمي مختلط |
| مثبط JAK I | EMD4 Biosciences | 420099 | مثبط لمثبط Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I مثبط |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | مثبط ROCK II |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | مثبط جديد ل ROCK |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 & مصفاة الخلايا m |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 & deg ؛ ج | ثيرمو علمية | C6516F-1 | "السيد فروستي" حاوية التجميد |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | كواشف التعداء |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | كاشف التعداء |
| غير المستهدف miRIDIAN miRNA التحكم في التعداء | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | المسمى ب Dy547 ، لمراقبة تسليم microRNAs ؛ |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | ليتم تحديده | ناقلات Lentiviral |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | مدرجة في كل مجموعة تعدين | بلازميد التعبير للتحكم في التعدي |
| أكتوبر -4 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-5279 | الماوس IgG2b ، علامة متعددة القدرات |
| SSEA-1 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-21702 | الماوس IgM ، علامة التمايز |
| SSEA-4 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-21704 | الماوس IgG3 ، علامة متعددة القدرات |
| Tra-1-60 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-21705 ؛ | IgM للفأر ، علامة متعددة القدرات |
| Tra-1-81 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-21706 | Mouse IgM ، علامة متعددة القدرات |
| CK8 (C51) سانتا | كروز للتكنولوجيا الحيوية | sc-8020 | Mouse IgG1 ، ضد السيتوكيراتين 8 |
| & ألفا بروتين | فيتوبروتين سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-8399 | AFP ، الماوس IgG2a |
| HNF-3 & beta ؛ (ف-19) | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-9187 | FOXA2 ، الأجسام المضادة متعددة النسيلة للماعز |
| تروبونين T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc ، اليابان | RCAB0004P-F | الأجسام المضادة متعددة النسيلة ؛ |
| الفئران المضادة ل GFAP | Zymed | 13-0300 | البروتين الحمضي الليفي الدبقي |
| الألبومين (استنساخ HSA1 / 25.1.3) | مختبرات Cedarlane المحدودة. | CL2513A | الفأر IgG1 |
| أكتين العضلات الملساء (استنساخ 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611 / IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1 ، الماوس IgG2a |
| HNF4 & alpha ؛ (C11F12) | تقنيات إشارات الخلية | 3113 | الأرانب الأجسام المضادة أحادية النسيلة |
| بارافورمالدهيد (محلول) | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | PFA ، مثبت ، مخفف في D-PBS |
المراجع
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
