يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

12.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

يوليو 24, 2014

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولات زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) ، بناء على نمو أحادي الطبقة من النوع غير المستعمري (NCM) للخلايا المفردة المنفصلة. هذه الطريقة الجديدة ، باستخدام مثبطات كيناز مرتبطة بالروي أو الشكل الإسوي اللامينين 521 (LN-521) ، مناسبة لإنتاج كميات كبيرة من hPSCs المتجانسة ، والتلاعب الجيني ، واكتشاف الأدوية.

الملخص

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) تحمل وعدا كبيرا للطب التجديدي وتطبيقات المستحضرات الصيدلانية الحيوية. حاليا ، تعد الثقافة المثلى والتوسع الفعال لكميات كبيرة من hPSCs من الدرجة السريرية من القضايا الحرجة في العلاجات القائمة على hPSC. تقليديا ، يتم نشر hPSCs كمستعمرات على كل من أنظمة الاستزراع المغذية والخالية من التغذية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها العديد من القيود الرئيسية ، بما في ذلك انخفاض إنتاجية الخلايا وتوليد خلايا متمايزة بشكل غير متجانس. لتحسين طرق زراعة hPSC الحالية ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة جديدة تعتمد على ثقافة أحادية الطبقة من النوع غير المستعمري (NCM) للخلايا المفردة المنفصلة. هنا ، نقدم بروتوكولات NCM التفصيلية بناء على مثبط كيناز المرتبط ب Rho (ROCK) Y-27632. نقدم أيضا معلومات جديدة بخصوص ثقافة NCM مع جزيئات صغيرة مختلفة مثل Y-39983 (مثبط ROCK I) ، فينيل بنزوديوكسان (مثبط ROCK II) ، وثيازوفيفين (مثبط جديد ل ROCK). نقوم بتوسيع بروتوكولنا الأساسي لزراعة hPSCs على بروتينات محددة خارج الخلية مثل الشكل الإسوي اللامينين 521 (LN-521) دون استخدام مثبطات ROCK. علاوة على ذلك ، استنادا إلى NCM ، أظهرنا تعداء أو نقل فعال للحمض النووي البلازميد ، وجزيئات الفيروسات ، والحمض النووي الريبي الصغير القائم على قليل النوكليوتيدات إلى hPSCs من أجل تعديل هذه الخلايا وراثيا للتحليلات الجزيئية واكتشاف الأدوية. تتغلب الطرق القائمة على NCM على أوجه القصور الرئيسية في الثقافة من نوع المستعمرة ، وبالتالي قد تكون مناسبة لإنتاج كميات كبيرة من hPSCs المتجانسة للعلاجات السريرية المستقبلية وأبحاث الخلايا الجذعية واكتشاف الأدوية.

المقدمة

قدرة hPSCs للتمييز نحو أنسجة البالغين multilineage فتحت آفاقا جديدة لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية الشديدة التي تنطوي، الكبد، البنكرياس، والنظم العصبية 1-4. أن مختلف أنواع الخلايا المشتقة من hPSCs أيضا توفير منصات الخلوية قوية لنمذجة المرض، والهندسة الوراثية، وفحص المخدرات، واختبار السمية 1،4. القضية الرئيسية التي تضمن التطبيقات السريرية والدوائية مستقبلهم هو الجيل أعداد كبيرة من hPSCs السريرية الصف من خلال زراعة الخلايا في المختبر. ومع ذلك، ونظم الثقافة الحالية هي إما غير كافية أو متغيرة بطبيعتها، تضم مختلف المغذية وخالية من تغذية ثقافات hPSCs كما المستعمرات 5،6.

مستعمرة من نوع نمو أسهم hPSCs العديد من الميزات الهيكلية من كتلة الخلايا الداخلية (ICM) الأجنة الثدييات المبكرة. الحركة الدستورية هو عرضة للتمييز في طبقات الجرثومية الثلاثفي بيئة متعددة الخلايا بسبب وجود تدرجات إشارات غير المتجانسة. وبالتالي، يعتبر اكتساب التجانس في التطور الجنيني المبكر كعملية المطلوبة للتمايز، ولكن ميزة غير المرغوب فيها من ثقافة hPSC. وغالبا ما يسببها عدم التجانس في الثقافة hPSC بواسطة إشارات أفكارك المفرطة والتمايز عفوية بسبب ظروف النمو الأمثل. وهكذا، في مستعمرة من نوع الثقافة، وكثيرا ما لوحظ الخلايا غير المتجانسة في محيط المستعمرات 7،8. وقد تبين أيضا أن الخلايا الجنينية البشرية في الخلايا الجذعية (HESC) مستعمرات الردود التفاضلية المعرض إلى إشارات الجزيئات مثل BMP-4 9. وعلاوة على ذلك، وأساليب الثقافة مستعمرة تنتج غلة الخلية المنخفض، وكذلك معدلات الاسترداد الخلية منخفضة جدا من الحفظ بالتبريد نظرا لمعدلات النمو لا يمكن السيطرة عليها وإشارات أفكارك مسارات 6،9. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت مختلف الثقافات تعليق لhPSCs زراعة، particulآرلي للتوسع كميات كبيرة من hPSCs في وحدة تغذية خالية من مصفوفة الشروط 6،10-13. من الواضح، ونظم الثقافة المختلفة لها مزاياها وعيوبها. بشكل عام، وطبيعة غير متجانسة من hPSCs تمثل واحدة من العوائق الرئيسية في مستعمرة من نوع والثقافة المجمعة الأساليب، والتي هي دون المستوى الأمثل لتقديم مواد الحمض النووي والحمض النووي الريبي في hPSCs للهندسة الوراثية 6.

ومن الواضح أن هناك حاجة ملحة لتطوير نظم جديدة أن تحايل بعض أوجه القصور في أساليب الثقافة الحالية. اكتشافات مثبطات جزيء صغير (مثل مثبط ROCK Y-27632 وJAK المانع 1) التي تعمل على تحسين البقاء على قيد الحياة وحيدة الخلية تمهيد الطريق للثقافة فصلها-hPSC 14،15. مع استخدام هذه الجزيئات الصغيرة، وقد وضعنا في الآونة الأخيرة طريقة ثقافة قائمة على نوع غير مستعمرة (NCM) نمو فصلها-hPSCs 9. هذا الأسلوب يجمع بين كل من الثقافة رواية الركض وحيدة الخلية وذات الكثافة السكانية العاليةأساليب الطلاء، مما يسمح لنا لإنتاج كميات كبيرة من hPSCs متجانسة في إطار دورات نموا ثابتا دون شذوذ الكروموسومات الرئيسية 9. بدلا من ذلك، يمكن أن تنفذ الثقافة NCM مع جزيئات صغيرة ومصفوفات محددة (مثل laminins) المختلفة من أجل تحسين الأسلوب الثقافة لتطبيقات واسعة. هنا، نقدم عدة بروتوكولات مفصلة على أساس الثقافة NCM وتحدد الإجراءات التفصيلية للهندسة الوراثية. للتدليل على براعة بروتوكولات NCM، ونحن أيضا اختبار الثقافة NCM مع مثبطات ROCK المتنوعة ومع laminin الإسوي واحد 521 (أي LN-521).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

خلية واحدة غير القائمة على مستعمرة من نوع أحادي الطبقة (NCM) ثقافة hPSCs.

1. الاستعدادات

  1. جعل 500 مل من المتوسط ​​للثقافة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs): المتوسطة DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، و 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
  2. عزل الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) الخلايا المشتقة من سلالة CF1 بعد بروتوكول روتيني 16 و ثقافة MEFs على 0.1٪ 6 جيدا لوحة خلية ثقافة المغلفة الجيلاتين في DMEM المتوسطة. بدلا من ذلك، شراء أسهم في مرور 3 MEF من الموارد التجارية.
  3. إعداد لوحات Matrigel.
    1. تمييع 5 مل من HESC المؤهلين Matrigel الأسهم مع 5 مل من DMEM/F12 المتوسطة (برود في ~ 4 ° C) وتخزين 50٪ مأخوذة في الفريزر -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في الأسهم Matrigel المجمدة في الثلاجة (4 ~ ° C) O / N والمزيد من تمييع Matrigel في البرد المتوسطة DMEM/F12 (أن تؤدي إلى تركيز العمل 2.5٪).
      2. معطف 6 جيدا لوحات زراعة الخلايا مع 1.5 مل من 2.5٪ Matrigel لكل بئر، وتخزين لوحات مغلفة في الثلاجة O / N (ملاحظة: استخدام لوحة Matrigel المغلفة في غضون 2 أسابيع).
    2. إزالة لوحة Matrigel من الثلاجة، والسماح لوحة لتدفئة في RT في هود زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 30 دقيقة (ملاحظة: لا تدفئة لوحة في حاضنة الثقافة الخلية)، ونضح DMEM المتوسطة قبل الطلاء hPSCs.
  4. جعل 500 مل HESC المتوسطة: 80٪ DMEM/F12 المتوسطة، و 20٪ KSR، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 0.1 ملم β المركابتويثانول، و 4 نانوغرام / مل من جمعية جيل المستقبل-2.
  5. تحضير 10 مل من 2X hPSC تجميد المتوسطة: 60٪ FBS، 20٪ DMSO و 20 ميكرومتر Y-27632 في mTeSR1 المتوسطة، تعقيم عن طريق الترشيح، واستخدام المتوسط ​​في حدود 1 في الاسبوع.

2 بروتوكول 1 (الأساسية): تنمو المستعمرات hPSC على مغذيات

  1. استخدام أرقام مرور MEF في 5 أو 6 (تسمى P5 P6 و) للثقافة hPSC من أجل الحصول على بالنتيجه متسقةنهاية الخبر. ميتوتيكلي تعطيل MEFs عن طريق علاج الخلايا مع 10 ميكروغرام / مل C ميتوميسين لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا 3x أخرى مع 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS)، ثم فصل MEFs مع 0.05٪ التربسين في 0.53 ملم EDTA. بدلا من ذلك، أشرق MEFs بجرعة 8،000 راد مع irradiator الأشعة السينية.
  2. حساب الأرقام الخلية باستخدام التريبان الأزرق طريقة وصمة عار الإقصاء تحت المجهر. بدلا من ذلك، استخدام عداد الخلايا التلقائي.
  3. لوحة MEFs المشع على لوحات البوليسترين 6 جيدا المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪ في كثافة 1.88 × 10 5 خلايا لكل بئر (أي 1.96 × 10 4 خلية / سم 2). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
  4. إزالة مستنبت MEF بواسطة الشفط مع ماصة باستور (ملاحظة: لا يغسل الخطوات اللازمة في هذا الوقت).
  5. المستعمرات يسحن hPSC من الثقافة السابقة في كتل صغيرة، ودراسة كتل تحت المجهر لضمان أحجامها تتراوح الابام 50-100 ميكرون في أقطار، وكتل لوحة hPSC على الجزء العلوي من طبقات MEF المغذية في واحدة تحتوي أيضا 2 مل من hPSC المتوسط.
  6. تغيير HESC المتوسطة يوميا لمدة 3 إلى 5 أيام، والنمو مستعمرة سجل عن طريق الصورة، علامة على أي مستعمرات تغييرها شكليا أو متمايزة (~ 5٪)، ويدويا إزالة المستعمرات التي تميزت تطلع بلطف مع ماصة باستور.
  7. شطف المستعمرات المتبقية على MEFs مرتين (2 دقيقة لكل منهما مع مد برنامج تلفزيوني)، واحتضان المستعمرات مع 2 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع في hPSC متوسطة لمدة 10 إلى 30 دقيقة)، ودراسة مفرزة من المستعمرات hPSC من سطح MEF المغلفة (ملاحظة: استخدام مكشطة للمساعدة في عملية مفرزة إلا إذا تعلق المستعمرات بإحكام لوحة).
  8. إضافة 5 مل من hPSC المتوسطة إلى كل بئر للحد من التفاعلات الإنزيمية، المستعمرات نقل إلى أنبوب 15 مل، والسماح للمستعمرات hPSC الرواسب لمدة 3 إلى 5 دقائق على RT، وضمان الترسيب من المستعمرات التي كتبها التصور المباشر من جأذرع في الجزء السفلي من الأنبوب (ملاحظة: لا أنبوب الطرد المركزي في هذه الخطوة).
  9. إزالة supernatants تحتوي على MEFs المتبقية وفصل الخلايا واحد، resuspend والمستعمرات مع 5 مل من HESC المتوسطة، وكرر الخطوة الترسيب مرتين.
  10. إزالة المتوسطة، المستعمرات hPSC يسحن إلى كتل صغيرة، وتخزينها في 1X hPSC تجميد المتوسطة (أو CryoStore CS10 المتوسطة التجميد) لحفظ البرودة (1 متكدسة جيدا في قنينة مجمدة) أو لوحة على لوحة 6 جيدا لالركض الخلية.

3 بروتوكول 2: تحويل hPSC المستعمرات من مغذيات لNCM

  1. شطف الكريات hPSC في مد PBS مرة واحدة، واحتضان الكريات مع 1 مل من 1X Accutase لمدة 10 دقيقة، ودراسة رد الفعل الأنزيمية تحت المجهر للتأكد من التفكك وحيدة الخلية.
  2. إنهاء التفاعلات الإنزيمية عن طريق إعادة التعليق بلطف الخلايا في 5 مل من mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 تليها الطرد المركزي في 200 x ج في RT لمدة 5 دقائق(ملاحظة، لا تستخدم القوات الطرد المركزي المفرطة التي تسبب تلف الخلايا).
  3. إضافة 5 مل من mTeSR1 المتوسطة إلى بيليه، resuspend الكرية كما الخلايا واحدة، ومرشح فصل الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر (لإزالة أي خلايا المجاميع المتبقية).
  4. البذور 1،3-2 × 10 6 hPSCs في بئر واحدة (1،4-2،1 × 10 5 خلية / سم 2) من لوحة 6 جيدا المغلفة مع 2.5٪ HESC المؤهلين Matrigel، إضافة mTeSR1 المتوسطة ما يصل الى 2.5 مل، وتشمل 10 ميكرومتر Y-27632 في المتوسط ​​(لتسهيل الأولي 24 ساعة الطلاء وحيدة الخلية). بدلا من ذلك، استخدام الجزيئات الصغيرة التالية لاستبدال 10 ميكرومتر Y-27632 لتعزيز وحيدة الخلية تصفيح: 1 ميكرومتر Y-39983 (ROCK أنا المانع)، 1 ميكرومتر phenylbenzodioxane (ROCK الثاني المانع)، 1 ميكرومتر thiazovivin (أ ROCK المانع رواية) ، و 2 ميكرومتر المانع JAK 1.
  5. استبدال المتوسطة مع خالية من المخدرات mTeSR1 المتوسطة في اليوم التالي (في غضون 24 ساعة)، فصل الخلايا من واحد إضافيأيضا، وحساب عدد الخلايا لتحديد خلية واحدة كفاءة الطلاء (ملاحظة: حوالي 50 إلى 90٪ من خلية واحدة والطلاء الكفاءة التي يمكن تحقيقها في هذه المرحلة).
  6. تسمح للخلايا أن تنمو باعتبارها شكلت خلية واحدة أحادي الطبقة لبضعة أيام مع 3 مل من mTeSR1 المتوسط. تغيير المتوسطة اليومية.
  7. تجريبيا تحديد جدول زمني لالركض تكييفها NCM اعتمادا على كثافة الخلية. مرور عندما يصل نمو الخلايا التقاء في اليوم 3 أو 4 أيام، أو في نقطة زمنية 4 ساعة بعد اختفاء الخلية الى خلية الحدود. فصل الخلايا في 1 مل من Accutase، استخدم 1-3 نسبة تقسيم (أي 1 متكدسة جيدا من الخلايا مطلي في 3 آبار من لوحة 6 جيدا) لالركض الخلايا، وتحقيق الاستقرار تكييفها NCM بنسبة 5 مقاطع.
  8. تجميد الخلايا
    1. الاستفادة من بئر واحدة متموجة (5-6 ~ X10 6 خلايا) لقنينة واحدة مجمدة: فصل خلايا متكدسة من بئر واحدة مع 1 مل من Accutase لمدة 10 دقيقة.
    2. تمييع ثإيث 5 مل من الخلايا المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي mTeSR1 كما هو موضح أعلاه.
    3. resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من mTeSR1 المتوسطة ثم قم بإضافة ببطء 500 ميكرولتر من 2X hPSC تجميد المتوسطة (التي تحتوي على 20 ميكرومتر Y-27632) في قارورة الحفظ بالتبريد. بدلا من ذلك، resuspend الخلايا في 1X hPSC تجميد المتوسطة التي تحتوي على 2 ميكرومتر المانع JAK 1 أو 1X CryoStor CS10 المتوسطة في وجود إما 10 ميكرومتر Y-27632 أو 2 ميكرومتر المانع JAK 1.
    4. وضع قارورة المجمدة إلى cryocontainer الجليد المبرد (شغل القاع مع isopranol) ونقل cryocontainer إلى -80 ° C الثلاجة على الفور.
    5. نقل الخلايا من الفريزر -80 درجة مئوية إلى خزان النتروجين السائل (في اليوم التالي) لحفظ البرودة على المدى الطويل.
  9. ذوبان الخلية
    1. استخدام واحد قارورة الحفظ بالتبريد لتصفيح 1 بئر من لوحة 6 جيدا.
    2. قبل الدافئة المتوسطة mTeSR1 في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وخلايا ذوبان الجليد في نفس الحمام المائي لمدة 2 دقيقة،إسقاط الحكيم إضافة خلايا إلى 5 مل من قبل تحسنت المتوسطة mTeSR1 تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632، وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
    3. resuspend بلطف الخلايا الكريات مع 2 مل من mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 وببطء نقل الخلايا إلى بئر المغلفة مسبقا مع Matrigel (ملاحظة: تجنب إنتاج فقاعات الهواء).
    4. تغيير متوسطة يوميا ونتوقع نموا hPSC للوصول إلى نقطة التقاء في اليوم 3 أو 4.

4 بروتوكول 3: تحويل hPSC المستعمرات على Matrigel لNCM الثقافة

  1. إزالة لوحة Matrigel المغلفة من الثلاجة، ووضع لوحة في الثقافة هود الأنسجة لمدة 10 إلى 30 دقيقة، وإزالة المتوسطة من كل بئر من لوحة، وإضافة 2 مل من قبل تحسنت المتوسطة mTeSR1 إلى كل بئر.
  2. نقل كتل hPSC المسحوقة من الثقافة المغذية (الخطوة 2.10 البروتوكول الأساسية) إلى لوحة Matrigel أعلاه. إضافة mTeSR1 المتوسطة ما يصل الى 2.5 مل الحجم النهائي في كل بئر.
  3. تغيير متوسطة يوميا لمدة 3 إلى 4 أيامق حتى مستعمرات تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء.
  4. لالركض الخلية: شطف المستعمرات مع D-PBS مرتين، علاج الخلايا مع 1 مل من 2 ملغ / مل dispase عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة، والرواسب ومرور الخلايا كما كتل.
  5. للثقافة NCM: تكرار الخطوات 3،1-3،9 الموصوفة في البروتوكول 2.

5 بروتوكول 4: NCM ثقافة hPSCs على LN-521

  1. ذوبان الجليد في المؤتلف LN-521 الحل في 4 درجات مئوية قبل يوم من الاستخدام ويجعل الحل laminin طلاء (LCS) من خلال تمييع laminin إذابة مع 1X PBS-D (التي تحتوي على الكالسيوم 2 + / + 2 ملغ) إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
  2. إضافة 1 مل من LCS لاحد جيد في لوحة 6 جيدا (ملاحظة: تجنب الجفاف من خلال عملية الطلاء).
  3. ختم لوحة المغلفة مع parafilm لمنع التبخر وتخزينها في الثلاجة لوحة (4 ° C) O / N (ملاحظة: استخدام لوحة في حدود 1 في الاسبوع).
  4. بلطف إزالة LCS مع ماصة باستور دون لuching السطح المطلي وإضافة 2 مل من mTeSR1 المتوسط ​​إلى واحد أيضا.
  5. تدفئة جميع الحلول الثقافة (بما في ذلك مد PBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
  6. تحويل المستعمرات إلى hPSC NCM
    1. فصل الركام الخلية إلى الخلايا واحد مع Accutase كما هو موضح في البروتوكول 2.
    2. البذور 1،3-2 × 10 6 hPSCs في واحدة LN-521-المغلفة جيدا (1،4-2،1 × 10 5 خلية / سم 2) من دون وجود مثبطات ROCK.
    3. تغيير متوسطة يوميا لمدة 3 إلى 4 أيام.
    4. فصل الخلايا في 1 مل من Accutase في اليوم 3 أو 4 لالركض الخلية التالية باستخدام 1-3 نسبة تقسيم.

6 بروتوكول 5: NCM الثقافة للDNA البلازميد ترنسفكأيشن

  1. التكيف مع المستعمرات hPSC للثقافة NCM كما هو موضح في البروتوكولات 2-4.
  2. لوحة فصلها hPSCs في 12 لوحة جيدا مع كثافة خلية من 7.5 × 10 5 خلية / جيدا في mTeSR1 المتوسطة في ظل وجود 10 ميكرومتر Y-27632.
  3. استبدال mTeSR1 المتوسطة مع خالية من المخدرات mTeSR1 المتوسطة بين 4-8 ساعة بعد الطلاء الخلايا.
  4. لكل ترنسفكأيشن، وتمييع 2.5 ميكروغرام من البلازميدات التعبير (على سبيل المثال، pmaxGFP) و 5 ميكرولتر من Lipofectamine عام 2000 في أنابيب إيبندورف منفصلة في 125 ميكرولتر من كل غروب MEM المصل انخفاض متوسط.
  5. بعد 5 دقائق، مزج الكواشف المخفف واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT (على شكل مجمعات ترنسفكأيشن).
  6. إضافة 250 ميكرولتر المجمعات ترنسفكأيشن لتحتوي كل منها على hPSCs جيدا في 1 مل mTeSR1 المتوسطة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 24 ساعة.
  7. دراسة كفاءة ترنسفكأيشن تحت المجهر مضان وصورة عشوائيا لحساب كفاءة ترنسفكأيشن الفعلي.

7 بروتوكول 6: NCM الثقافة للترنسفكأيشن من MicroRNAs

  1. فصل hPSCs شبه متموجة في يوم 2 في ظل ظروف NCM بإضافة 1 مل من Accutase لكل بئر في 6 جيدا لوحة.
  2. إضافة 10 مل من mTeSR1 المتوسطة لتخفيف التفاعلات الإنزيمية وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. resuspend الكرية الخلية مع mTeSR1 المتوسطة، البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 7.5 × 10 5 خلايا لكل بئر في لوحة 12 جيدا في mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632، والسماح للخلايا نعلق لمدة 4 ساعة.
  4. استبدال المتوسطة مع خالية من Y27632 mTeSR1 المتوسط.
  5. استخدام المتاحة تجاريا microRNAs (على سبيل المثال، وعدم استهداف miRIDIAN ميرنا تحكم ترنسفكأيشن المسمى مع Dy547). يعاير بتركيزات تتراوح 0-160 نانومتر باستخدام الكواشف المقدمة واتباع تعليمات الصانعين.
  6. تحسين كفاءة ترنسفكأيشن لكل تركيز في خطوط hPSC عن طريق التصوير مضان Dy547 من الخلايا الحية تحت المجهر في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
  7. حساب الكفاءة ترنسفكأيشن على أساس النسبة المئوية للخلايا إيجابية Dy547 على جميع الخلايا المصورة.
. TLE "> 8 بروتوكول 7: NCM الثقافة للتنبيغ من ناقلات Lentiviral

  1. كرر الخطوات من 7،1-7،4 البروتوكول 6.
  2. حساب كميات من الجسيمات الفيروسية لاستخدامها في تنبيغ: استخدام الصيغة التالية: = TU (وزارة الداخلية س CN) / VT، في حين TU يدل على العدد الإجمالي من وحدات تحويل، وزارة الداخلية يساوي تعدد المطلوب من العدوى في البئر (وزارة الداخلية أو TU / خلية)، CN يحدد عدد الخلايا في كل بئر، وVT يشير الأسهم التتر الفيروسية (TU / مل). على سبيل المثال، بالنظر إلى أن الأسهم التتر الفيروسية لSMART-shRNA ناقلات يساوي 1 × 10 9 TU / مل (وحدات تحويل لكل مل)، 7.5 × 10 5 خلايا لكل بئر في وقت تنبيغ، وزارة الداخلية المتوقعة من 20: استخدام 15 ميكرولتر من الأسهم الجسيمات الفيروسية لكل بئر (ملاحظة: ينصح هذا الشرط لعابرة lentiviral الاستقراء).
  3. قبل الدافئة 300 ميكرولتر من mTeSR1 المتوسطة مع 10 ملغ / مل من polybrene لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة 15 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية في الأسهمالمتوسط ​​mTeSR1 قبل حرارة تحتوي على polybrene والمزيج بلطف الحل.
  5. استبدال مستنبت الخلايا مع 300 ميكرولتر من المتوسطة prewarmed تحتوي على جسيمات فيروسية.
  6. بعد 4 ساعات الحضانة، دراسة turboGFP مضان (صانع للshRNA التعبير) لتحديد كفاءة تنبيغ.
  7. إضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة mTeSR1 إضافية إلى transducing بشكل جيد عندما تبدأ الخلايا في التعبير عن turboGFP.
  8. بعد 12-16 ساعة الحضانة، وإعادة النظر توربو GFP التعبير.
  9. أداء المطلوب التجارب المتابعة مع هذه الخلايا transduced في غضون 72 ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

والمخطط العام للثقافة NCM

يمثل الشكل 1 نموذجي NCM الثقافة مخطط يوضح التغيرات الدينامية من hPSCs بعد ارتفاع الكثافة الطلاء وحيدة الخلية في وجود المانع ROCK Y-27632. وتشمل هذه التغييرات المورفولوجية وصلات بين الخلايا بعد الطلاء، وتشكيل مجموعات الخلوية، ونمو الخلايا الأسي تليها التكثيف الخلية (الشكل 1A). تجربة تمثيلية يشير WA01 (H1) hESCs، مطلي على شكل خلايا وحيدة ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك طريقتان الرئيسية لhPSCs الثقافة في المختبر: الثقافة التقليدية مستعمرة من نوع (الخلايا على مغذيات أو مصفوفات خارج الخلية) والثقافة تعليق hPSCs كما المجاميع دون مغذيات 6. وتشمل القيود المفروضة على حد سواء من نوع المستعمرة وتعليق وسائل الثقافة التجانس المتراكمة وتغييرات جينية للتوريث. ثقافة NCM، استنادا إلى كل من الركض وحيدة الخلية وذات الكثافة السكانية العالية والطلاء الخلية، يمثل طريقة جديدة للثقافة hPSC نمو 6،18. على الرغم من أن تم توثيق مختلف أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) في المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية. نود أن نشكر الدكتور رونالد د. مكاي على مناقشته وتعليقاته على هذا المشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عداد الخلايا الآلي للكونتيسةInvitrogen Inc.C10227عد الخلايا الأوتوماتيكي
الأشعة السينية لخزانةالفاكسيترون شركة الأشعة السينية ، ويلنج ، إلينوي & nbsp ؛الموديل RX-650تشعيع الأشعة السينية لألواح MEFs
MULTIWELL ذات 6 آبارBecton Dickinson Labware353046ألواح البوليسترين
DMEMInvitrogen Inc.11965 – 092بالنسبة لوسيط MEF
Mitomycin CRoche107409مثبط الانقسام
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054لتفكك
MEF DMEM / F12Invitrogen Inc.11330 &ndash ؛ 032ل hPSC المتوسطة
Opti-MEM I Reduced Serum Medium شركة Invitrogen31985-062لتعداء hPSC تعدين
FBSInvitrogen Inc.16000 & ndash ؛ 044مكون من MEF
متوسط خروج المغلوب مصلاستبدال Invitrogen Inc.10828 &ndash ؛ 028KSR ، مكون hPSC المتوسطة
Dulbecco s المحلول الملحي المخزنة بالفوسفاتInvitrogen Inc.14190-144D-PBS ، خالي من Ca2 + < / sup> / Mg 2 + < / sup>
الأحماض الأمينية غير الأساسيةInvitrogen11140 & ndash ؛ 050NEAA ، مكون من hPSC متوسط
L-GlutamineInvitrogen   ؛25030 – 081مكون hPSC متوسط
mTeSR1 & المكملاتالغذائية StemCell Technologies5850TeSR2 الخالية من البروتين الحيواني
& المكملاتالغذائية StemCell Technologies5860Xeno-free medium
β-mercaptoethanolSigma M7522مكون hPSC المتوسط

MEF (CF-1) ATCC		مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC) SCRC-1040لثقافة التغذية لمركبات hPSCs
المؤهلة من hESC MatrigelBD Bioscience354277للاستزراع الخالي من التغذية لمركبات السلم والأوعية الدموية
الشاملة Laminin-521BioLaminaLN521-02البروتين المؤتلف البشري
FGF-2 (FGF المؤتلف ، أساسي)R & D Systems ، MN223-FBعامل النمو في hPSC المتوسطة
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X محلول إنزيمي مختلط
مثبط JAK IEMD4 Biosciences420099مثبط لمثبط Janus kinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK
Y-27632Stemgent04-0012ROCK inhibitor
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I مثبط
PhenylbenzodioxaneStemgent04-0030مثبط ROCK II
ThiazovivinStemgent04-0017مثبط جديد ل ROCK
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 & مصفاة الخلايا m
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 & deg ؛ جثيرمو علمية C6516F-1"السيد فروستي" حاوية التجميد
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027كواشف التعداء
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02كاشف التعداء
غير المستهدف miRIDIAN miRNA التحكم في التعداءThermo ScientificIP-004500-01-05المسمى ب Dy547 ، لمراقبة تسليم microRNAs   ؛
SMART-shRNAThermo Scientific ليتم تحديدهناقلات Lentiviral
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)مدرجة في كل مجموعة تعدينبلازميد التعبير للتحكم في التعدي
أكتوبر -4سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-5279الماوس IgG2b ، علامة متعددة القدرات
SSEA-1سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-21702الماوس IgM ، علامة التمايز
SSEA-4سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-21704الماوس IgG3 ، علامة متعددة القدرات
Tra-1-60سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-21705   ؛IgM للفأر ، علامة متعددة القدرات
Tra-1-81سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-21706Mouse IgM ، علامة متعددة القدرات
CK8 (C51) سانتاكروز للتكنولوجيا الحيويةsc-8020Mouse IgG1 ، ضد السيتوكيراتين 8
& ألفا بروتينفيتوبروتين سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-8399AFP ، الماوس IgG2a
HNF-3 & beta ؛ (ف-19)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-9187FOXA2 ، الأجسام المضادة متعددة النسيلة للماعز
تروبونين T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Mouse IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Rabbit IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc ، اليابانRCAB0004P-Fالأجسام المضادة متعددة النسيلة   ؛
الفئران المضادة ل GFAPZymed13-0300البروتين الحمضي الليفي الدبقي
الألبومين (استنساخ HSA1 / 25.1.3)مختبرات Cedarlane المحدودة.CL2513Aالفأر IgG1
أكتين العضلات الملساء (استنساخ 1A4)DakoCytomation IncIR611 / IS611Mouse IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1 ، الماوس IgG2a
HNF4 & alpha ؛ (C11F12)تقنيات إشارات الخلية3113الأرانب الأجسام المضادة أحادية النسيلة
بارافورمالدهيد (محلول)علوم المجهر الإلكتروني15710PFA ، مثبت ، مخفف في D-PBS
نظام

المراجع

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167(2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدراتزراعة الطبقة الواحدةمثبط ROCK Y-27632زراعة اللامينين 521التعديل الوراثيترانسفكشن الخلاياتوسيع الخلايا الجذعيةزراعة البروتين المحددةمثبطات الجزيئات الصغيرةالزراعة الخالية من المستعمرات
الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.