Method Article

ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

DOI:

10.3791/51520

⸱

May 12th, 2014

 , 
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يوفر التصوير بفاصل زمني < p class = 'jove_content'> في الحي معلومات قيمة عن إعادة التنظيم الهيكلي في الدماغ السليم. هنا ، نقدم مستحضر جمجمة رقيق يسمح بالتصوير عبر الجمجمة للهياكل المشبكية المصنفة بالفلورسنت في قشرة الفأر الحي عن طريق الفحص المجهري ثنائي الفوتون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في القشرة الثدييات، الخلايا العصبية تشكيل شبكات معقدة للغاية، وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي. التغيرات في قوة متشابك، فضلا عن إضافة / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، تحدث بطريقة تعتمد على الخبرة، وتوفير الأساس الهيكلي للاللدونة العصبية. كمكونات بعد المشبكي من نقاط الاشتباك العصبي معظم مثير في القشرة، وتعتبر العمود الفقري شجيري أن يكون وكيل جيدة من نقاط الاشتباك العصبي. الاستفادة من مزايا وتقنيات الوراثة الماوس وضع العلامات الفلورسنت، والخلايا العصبية الفردية وهياكلها متشابك يمكن أن توصف في الدماغ سليمة. ونحن هنا نقدم بروتوكول التصوير عبر الجمجمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمتابعة fluorescently المسمى العمود الفقري شجيري بعد المشبكي على مر الزمن في الجسم الحي. هذا البروتوكول يستخدم إعداد ضعفت الجمجمة، والتي تحافظ على الجمجمة سليمة ويتجنب الآثار الناجمة عن التعرض للالتهابات السحايا والقشرة. لذلك، يمكن الحصول على الصور مباشرة بعد سويتم تنفيذ rgery. لا يمكن أن يؤديها إجراء التجارب بشكل متكرر على مدى فترات زمنية مختلفة تتراوح من ساعات إلى سنوات. يمكن أيضا استخدام هذا المستحضر يتم توسيع التحقيق في مختلف المناطق القشرية وطبقات، وكذلك أنواع الخلايا الأخرى، في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشارك القشرة الثدييات في العديد من وظائف الدماغ، من الحسي الإدراك والحركة التحكم لمعالجة المعلومات المجردة والإدراك. وظائف القشرية المختلفة بناء على الدوائر العصبية المختلفة، والتي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التواصل وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي الفردية. وباستمرار يتم تعديل هيكل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي ردا على الخبرات والأمراض. في الدماغ ناضجة، اللدونة متشابك يأخذ شكل كلا من التغيرات قوة وبالإضافة إلى ذلك / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، ولعب أدوارا مهمة في تشكيل والحفاظ على الدوائر العصبية الوظيفية. العمود الفقري شجيري هي المكونات بعد المشبكي الأغلبية من نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ مثير الثدييات. وي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتاج الى موافقة التي يمكن الحصول عليها من المؤسسات المنزل قبل بدء الجراحة ودراسة التصوير. وأجريت التجارب الموضحة في هذه المخطوطة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.

1. جراحة

  1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية وتعقيم مساحة العمل مع 70٪ كحول جيدا قبل الجراحة.
  2. تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن KX حل مخدر (200 ملغ / كغ الكيتامين و 20 مغ / كغ زيلازين)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في YFP-H خط الفئران 25، بروتين فلوري الصفراء يعبر في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الهرمية طبقة V، التي توقع لها قمية التشعبات إلى طبقات سطحية في القشرة. من خلال إعداد ضعفت الجمجمة، وقطاعات شجيري fluorescently المسمى ولا يمكن تصوير تحت المجهر متكررة اثنين من الفوتون على فترات التصوير المختلفة، بدءا من ساعات لأشهر. نحن هنا تظهر مثال على التصوير أربع مرات من نفس التشعبات أكثر من 8 أيام في القشرة الحركية على فأرة الحاسوب 1 الشهر القديمة، حيث العمود الفقري الفردية وكذلك أ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على نجاح إعداد ضعفت الجمجمة، عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة. 1) سمك الجمجمة. عظم الجمجمة لديها بنية ساندويتش، مع اثنين من طبقات من العظم المضغوط عالي الكثافة وطبقة وسطى من الاسعار المنخفضة للكثافة العظام الاسفنجية. في حين أن الحفر الصغيرة عالية السرعة مناسبة لإزالة الطبقات الخارجية من العظم المضغوط والعظم الإسفنجي، شفرة المجهرية مثالية لترقق الطبقة الداخلية من العظم المضغوط. كما سمك وصلابة من الزيادات الجمجمة خلال التنمية، والتصوير من الفئران الكبار يتطلب المزيد من العظا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جيمس بيرنا لتوضيح الرسم. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة العقلية لYZ

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كيتامينBioniche Pharma67457-034-10ممزوج بالزيلازين للتخدير
مختبراتزيلازين139-236ممزوج بالكيتامين للتخدير
محلول ملحيHospira0409-7983-090.9٪ كلوريد الصوديوم للحقن والتصوير
شفرات الحلاقةعلوم المجهر الإلكتروني72000شفرات حلاقة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ
وسادات الكحولفيشر Scientific06-669-62وسادات تحضير الكحول المعقمة
مرهم العينهنري شاين102-9470مرهم الفازلين للعيون زيوت تشحيم العين المعقمة
مثقاب صغير عالي السرعةأدوات العلوم الدقيقة18000-17المثقاب الصغير عالي السرعة مناسب لتخفيف الطبقة الخارجية للعظام المدمجة واستهداف مساحة صغيرة
نتوءات فولاذية للحفر الصغيرأدوات العلوم الدقيقة19007-14قطر 1.4 مم
شفرة جراحية مجهريةSurgistar6961الشفرة الجراحية المجهرية مناسبة لتخفيف الطبقة الداخلية للعظم المضغوط والطبقة الوسطى من العظام الإسفنجية
غراء سيانواكريليتفيشر NC9062131 ثبتلوحة الرأس على خياطة الجمجمة
جهاز هافارد510461خياطة حريرية معقمة غير ماصة ، 6-0 الشعيرات الأحادية
تشريح المجهرأوليمبوسSZ61
كاميرا CCDإنفينيتي
مجهر ثنائي الفوتونتقنياتUltima IV
10X الموضوعأوليمبوسNA 0.30 ، هواء
60X الموضوعأوليمبوسNA 1.1 ، نفاذية الأشعة تحت الحمراء ، الغمر في الماء
ليزر Ti-sapphireألطيف الفيزياءماي تاي إتش بي
لويد البراري

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon ImagingDendritic SpinesMouse CortexThinned Skull PreparationIn Vivo ImagingFluorescent LabelingHead ImmobilizationImage Stack AcquisitionVasculature MappingSynaptic Plasticity

Related Articles