مقالة منهجية

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة

DOI:

10.3791/51526

⸱

يناير 12, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال جنين Xenopus laevis مفيدا بشكل استثنائي في دراسة التطور المبكر نظرا لحجمه الكبير وسهولة التلاعب به. يتم توفير بروتوكول مبسط لبروتوكول التهجين في الموقع بالكامل يمكن استخدامه في تحديد أعضاء معينة في هذا النظام النموذجي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكوين الأعضاء هو دراسة كيفية تحديد الأعضاء ثم اكتساب شكلها ووظائفها المحددة أثناء التطور. يعتبر جنين Xenopuslaevis مفيدا جدا لدراسة تكوين الأعضاء لأن حجمه الكبير يجعله مناسبا جدا لتحديد الأعضاء في الخطوات الأولى في تكوين الأعضاء. في هذا الوقت ، فإن الطريقة الأساسية المستخدمة لتحديد عضو معين أو البدائية هي التهجين الكامل في الموقع مع مجسات الحمض النووي الريبي المضادة للمعنى المسمى الخاصة بالجين الذي يتم التعبير عنه في العضو محل الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل نسبيا التلاعب بالجينات أو مسارات الإشارات في Xenopus ويسمح التهجين في الموقع للمرء بعد ذلك بفحص التغييرات في وجود أو مورفولوجيا العضو المستهدف. التهجين الكامل في الموقع هو بروتوكول متعدد الأيام مع العديد من الخطوات. نقدم هنا بروتوكولا مبسطا مع عدد أقل من الخطوات والكواشف المستخدمة والتي تعمل بشكل جيد مع المقايسات الروتينية. سهلت روبوتات التهجين في الموقع العملية بشكل كبير ونحن نوضح بالتفصيل كيف ومتى نستخدم هذه التكنولوجيا في هذه العملية. بمجرد اكتمال التهجين في الموقع ، قد يكون التقاط أفضل صورة للنتيجة أمرا محبطا. نحن نقدم المشورة حول كيفية تحسين التصوير لنتائج التهجين في الموقع. على الرغم من أن البروتوكول يصف تقييم تكوين الأعضاء في Xenopus laevis ، إلا أنه من شبه المؤكد أنه يمكن تكييف نفس البروتوكول الأساسي مع Xenopus tropicalis والأنظمة النموذجية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نمط التعبير عن جين معين جزءا مهما من المعلومات في تحديد الدور المحتمل لهذا الجين في تطوير عضو معين أو نوع خلية. ببساطة ، إذا لم يتم التعبير عنها في الوقت والمكان المناسبين ، فمن غير المرجح أن تلعب دورا رئيسيا. في Xenopus ، كما هو الحال في معظم الأجنة المبكرة ، فإن الاختبار الأكثر استخداما للكشف عن التعبير عن الجين هو التهجين الكامل في الموقع باستخدام مجسات الحمض النووي الريبي المضادة للحساسية. أصبح استخدام تلطيخ الأجسام المضادة لتقييم التعبير عن الجين في Xenopus أكثر شيوعا حيث يكتشف الباحثون أجساما مضادة ، عادة ما يتم رفعها ضد بروتينات الثدييات ، والتي تتفاعل مع متماثل Xenopus أو تولد 1-3 الخاصة بها. ومع ذلك ،....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الأجنة

  1. إذا لم تفعل بشكل روتيني كجزء من ثقافة الجنين، دي هلام الأجنة باستخدام 2.5٪ السيستين، ودرجة الحموضة 8.0 قبل تثبيت 8. على الرغم من أنه ليس من الضروري على الاطلاق، فمن المفيد أن ثم يدويا إزالة المغلف الإخصاب قبل تثبيت باستخدام ملقط غرامة.
    1. استخدام الماصات الزجاج باستور لنقل الأجنة. ماصة ليست واسعة بما فيه الكفاية لنقل الأجنة وذلك باستخدام قلم الماس لقطع ماصة الزجاج في نقطة واسعة بما يكفي لالتقاط الجنين. القضاء على حواف حادة من ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام تحقيقات محددة الأنسجة يمكن أن توفر معلومات العالقة في ما يخص حالة التنمية لأجهزة محددة. في الأمثلة التالية، ويستند مرحلة الجنين على الطاولة انطلاق Nieuwkoop وفابر 11. إذا كان أحد يستخدم الجينات شكل تحقيقات وأعرب بعد التمايز، تروبونين القلب أنا في مرحلة 28-30، على سبيل المثال (الشكل 1C)، وجود أو حجم الجهاز متباينة يمكن تقييمها في أي تمايز آخر مرحلة. قبل سنوات، كانت الأجنة قادرة على القيام مثل هذا التحليل المبني على المعرفة رائعة من الأنس.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على استخدام الموقع التهجين لتصور نمط التعبير عن جينات معينة لا تزال الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد أجهزة معينة أو أنواع الخلايا في الجنين القيطم. وذلك لأن العديد من المزايا التي توفرها هذه التقنية. التعبير عن الجينات يمكن تحديد هياكل محددة جيدا قبل أي علامة النسيجي للتمايز مثل قضية للتعبير nkx2.5 في الأسلاف القلب قبل أي تمييز واضح تلك الخلايا 18. مرة واحدة كل من الكواشف هي في متناول اليد، بل هو أيضا تكلفة فعالة جدا. جيل من العديد من التحقي.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لمركز القاهرة لحقوق الإنسان لدعم الزمالة من ستيف ديملينج وقسم طب الأطفال بجامعة ويسترن أونتاريو لدعم ستيف ديملينج ورامي حلبي وستيفاني جروفر. تم دعم هذا العمل من خلال R2654A11 منح NSERC وملحق NSERC Discovery Accelerator

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هزازات أنبوب LabguakeVWR17-08-2011
VWR قواريرVWR10-07-2012
L-CysteineBioShopCYS342.500
مجموعة ثلاثي الفوسفات ريبونوكليوزيد ، 100 ملي مترروش11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
مثبط رناز (Rnase OUT)Invitrogen 10777-019
T7 RNA PolymeraseFermentasEPO111
T3 RNA PolymeraseFermentasEPO101
SP6 RNA PolymeraseFermentasEPO131
Dnase 1Invitrogen 18047-019
مصل الأغنام  Wisent31150
كاشف الحجبRoche11096176001
BM الأرجواني Ap الركيزةRoche11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb شظاياRoche11093274910
MethanolVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM & nbsp ؛7910
EDTABioShopEDT001.500
تريسبيو شوبTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
مماسحBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ParaformaldehydeBioShopPAR070.500 
فورماميد  VWR       CAFX0420-4 
RNARoche10109223001
حمض الماليك  VWR       CAMX0100-3
ثلاثي سترات الصوديومBioShopCIT001
بيروكسيد الهيدروجين (محلول 30٪) EM& nbsp ؛HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
كحول البنزيلSigmaB-1042
بنزيل بنزواتسيجماB-6630
UltraPure Agarose   ؛Invitrogen 16500-500

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differen....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus ARO

مقالات ذات صلة