مقالة منهجية

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة

DOI:

10.3791/51526

⸱

يناير 12, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال جنين Xenopus laevis مفيدا بشكل استثنائي في دراسة التطور المبكر نظرا لحجمه الكبير وسهولة التلاعب به. يتم توفير بروتوكول مبسط لبروتوكول التهجين في الموقع بالكامل يمكن استخدامه في تحديد أعضاء معينة في هذا النظام النموذجي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكوين الأعضاء هو دراسة كيفية تحديد الأعضاء ثم اكتساب شكلها ووظائفها المحددة أثناء التطور. يعتبر جنين Xenopuslaevis مفيدا جدا لدراسة تكوين الأعضاء لأن حجمه الكبير يجعله مناسبا جدا لتحديد الأعضاء في الخطوات الأولى في تكوين الأعضاء. في هذا الوقت ، فإن الطريقة الأساسية المستخدمة لتحديد عضو معين أو البدائية هي التهجين الكامل في الموقع مع مجسات الحمض النووي الريبي المضادة للمعنى المسمى الخاصة بالجين الذي يتم التعبير عنه في العضو محل الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل نسبيا التلاعب بالجينات أو مسارات الإشارات في Xenopus ويسمح التهجين في الموقع للمرء بعد ذلك بفحص التغييرات في وجود أو مورفولوجيا العضو المستهدف. التهجين الكامل في الموقع هو بروتوكول متعدد الأيام مع العديد من الخطوات. نقدم هنا بروتوكولا مبسطا مع عدد أقل من الخطوات والكواشف المستخدمة والتي تعمل بشكل جيد مع المقايسات الروتينية. سهلت روبوتات التهجين في الموقع العملية بشكل كبير ونحن نوضح بالتفصيل كيف ومتى نستخدم هذه التكنولوجيا في هذه العملية. بمجرد اكتمال التهجين في الموقع ، قد يكون التقاط أفضل صورة للنتيجة أمرا محبطا. نحن نقدم المشورة حول كيفية تحسين التصوير لنتائج التهجين في الموقع. على الرغم من أن البروتوكول يصف تقييم تكوين الأعضاء في Xenopus laevis ، إلا أنه من شبه المؤكد أنه يمكن تكييف نفس البروتوكول الأساسي مع Xenopus tropicalis والأنظمة النموذجية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نمط التعبير عن جين معين جزءا مهما من المعلومات في تحديد الدور المحتمل لهذا الجين في تطوير عضو معين أو نوع خلية. ببساطة ، إذا لم يتم التعبير عنها في الوقت والمكان المناسبين ، فمن غير المرجح أن تلعب دورا رئيسيا. في Xenopus ، كما هو الحال في معظم الأجنة المبكرة ، فإن الاختبار الأكثر استخداما للكشف عن التعبير عن الجين هو التهجين الكامل في الموقع باستخدام مجسات الحمض النووي الريبي المضادة للحساسية. أصبح استخدام تلطيخ الأجسام المضادة لتقييم التعبير عن الجين في Xenopus أكثر شيوعا حيث يكتشف الباحثون أجساما مضادة ، عادة ما يتم رفعها ضد بروتينات الثدييات ، والتي تتفاعل مع متماثل Xenopus أو تولد 1-3 الخاصة بها. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من الدراسات حول تكوين الأعضاء في Xenopus لا تزال تستخدم مجسات الحمض النووي الريبي المضادة للحساس. عند استخدام الأجسام المضادة ، غالبا ما يتطلب كل جسم مضاد فردي تحسينا لتركيز الجسم المضاد الأساسي أو بروتوكولات التثبيت. في المقابل ، فإن بروتوكول التهجين في الموقع ثابت بشكل أساسي للمجسات المختلفة. المفهوم الأساسي بسيط نسبيا وقد تم تأسيس بروتوكول قياسي ممتاز 4. بروتوكولنا هو نسخة مبسطة من البروتوكول الأصلي 4 الذي لا يزال يوفر اكتشافا ممتازا لأنماط التعبير الجيني في الجنين المبكر. يتم إصلاح الأجنة ثم تحضيرها للتهجين عن طريق تغيير المحاليل ودرجات الحرارة بحيث تسمح بربط عالي الصرامة لمسبار الحمض النووي الريبي المضاد للمعنى المسمى ب mRNA المستهدف. يتم غسل المسبار غير المرتبط ثم يتم تحضير الأجنة لربط جسم مضاد بالملصق الموجود على مجسات الحمض النووي الريبي. ثم يتم غسل الجسم المضاد الزائد واستخدام تفاعل لوني إنزيمي لتحديد مكان ارتباط مسبار الحمض النووي الريبي في الجنين. يوجد الآن عدد من خطوط Xenopus المعدلة وراثيا التي تدفع التعبير عن بروتينات الفلورسنت في أنسجة معينة وهي متوفرة في مراكز مخزون Xenopus مثل National Xenopus Resource في Woods Hole. في حين أن هذا الخيار مفيد جدا للعديد من التجارب التي تتطلب فحص تكوين الأعضاء في الأجنة الحية ، إلا أن هذا الخيار يتطلب سكنا منفصلا للخطوط المعدلة وراثيا.

يمكن أن يحدد التهجين في الموقع بوضوح مكان تشكل أعضاء أو أنواع خلايا معينة في الجنين المبكر (الشكل 1). هذه التقنية حساسة بشكل ملحوظ نظرا لأنه يمكن للمرء اكتشاف التعبير الجيني في عدد صغير من الخلايا في جنين واحد 5. ومع ذلك ، لا يعتبر التهجين في الموقع باستخدام شدة التلوين اللوني قابلا للقياس الكمي لأن تفاعل اللون ليس خطيا. على الرغم من صعوبة تحديد كثافة التلوين ، إلا أن التغييرات في التعبير غالبا ما تكون ملحوظة تماما. خاصة عندما يظهر التهجين في الموقع زيادات أو انخفاضات قابلة للقياس الكمي في حجم مجالات التعبير 6،7.

المزايا الواضحة للتهجين الكامل في الموقع تجعله اختبارا حاسما في دراسة التطور المبكر. ومع ذلك ، فهي تستغرق وقتا طويلا وتتطلب العديد من الخطوات على مدار عدة أيام. هذا البروتوكول هو نسخة مبسطة من البروتوكول القياسي الذي يلغي عدة خطوات دون تقليل جودة النتيجة في الموقع. يزيل التبسيط أيضا مصادر التباين ، مما يجعل حل المشكلات أسهل إذا لم يكن التهجين في الموقع هو الأمثل. على وجه التحديد ، قمنا بالتخلص من استخدام علاجات البروتيناز K و RNAse للجنين ، وهما خطوتان يمكن أن يعتمدان على جودة الكاشف ويمكنهما أيضا تقليل شدة الإشارة إذا تم الإفراط فيه. يوفر البروتوكول أيضا درجة معينة من توفير التكاليف بسبب القضاء على استخدام العديد من الكواشف. أخيرا ، يوفر هذا البروتوكول أيضا بعض الإرشادات البسيطة لتحسين التقاط صور نتائج التهجين في الموقع. على الرغم من أن هذا البروتوكول محسن للعمل في أجنة Xenopus ، فمن المحتمل أن تكون بعض التبسيطات على الأقل قابلة للتطبيق على أعمال التهجين في الموقع في أنظمة الأجنة الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الأجنة

  1. إذا لم تفعل بشكل روتيني كجزء من ثقافة الجنين، دي هلام الأجنة باستخدام 2.5٪ السيستين، ودرجة الحموضة 8.0 قبل تثبيت 8. على الرغم من أنه ليس من الضروري على الاطلاق، فمن المفيد أن ثم يدويا إزالة المغلف الإخصاب قبل تثبيت باستخدام ملقط غرامة.
    1. استخدام الماصات الزجاج باستور لنقل الأجنة. ماصة ليست واسعة بما فيه الكفاية لنقل الأجنة وذلك باستخدام قلم الماس لقطع ماصة الزجاج في نقطة واسعة بما يكفي لالتقاط الجنين. القضاء على حواف حادة من الماصات بعد قطع كتبها بسرعة تمرير قطع غيض من خلال شعلة الموقد بنسن لإذابة حواف حادة.
      ملاحظة: العناية يجب أن تؤخذ، والزجاج يمكن أن يكون تزال ساخنة بما يكفي ليسبب حروقا على الرغم من أنه يبدو أن تبرد عن طريق التفتيش البصري.
  2. إجراء تثبيت الجنين في مراحل. أولا، إعداد قارورة زجاج للاستخدام في جنين التثبيت. استخدام هذه قارورة لجميع الخطوات بما في ذلك المباراة النهائيةالتخزين. استخدام قارورة التي هي واضحة مع ختم تفلون جيد في الغطاء، مما يسمح لرصد الأجنة خلال جميع مراحل هذه العملية. تسمية قارورة مع المعلومات التجريبية المناسبة باستخدام علامة دائمة ومن ثم تغطية التسمية مع شريط واضح، كما سيتم فقدان حتى علامة دائمة على مدار الإجراء بسبب استخدام الكحول وغيرها من المذيبات.
    1. استخدام Mempfa لإصلاح الأجنة. جعل مخزون من 8٪ امتصاص العرق في دفعات من 50-100 مل في كل مرة. استخدام ما يقرب من 75٪ من H 2 O المطلوبة والحرارة إلى 50-60 درجة مئوية، والذي هو ضروري للحصول على امتصاص العرق إلى حل.
      ملاحظة: هذا الحل هو مختلف قليلا من Memfa المستخدمة في الإصدارات القديمة بروتوكول المنشورة في أنه يستخدم بارافورمالدهيد بدلا من الفورمالديهايد.
    2. إضافة 2-3 قطرات من 10N هيدروكسيد الصوديوم أو حتى درجة الحموضة ما يقرب من 7.5 (استخدام ورقة الرقم الهيدروجيني للتأكد من درجة الحموضة). بارافورمالدهيد هي سامة جدا، وبالتالي توليد الحل الأسهم في غطاء الدخان. وبمجرد أن الفقرةالفورمالديهايد هو في حل، تصفية حل من خلال ورقة هتما في وعاء الطازجة وإضافة H 2 O إلى الحجم النهائي. إذا لزم الأمر، وتخزين حل بارافورمالدهيد عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
    3. تجميع المكونات المتبقية من الحل تثبيت Mempfa (الجدول 1). تأكد من أن تركيز العمل النهائية من بارافورمالدهيد 4٪. تخزين جميع مكونات الحل تثبيت في 4 درجات مئوية كما أسهم.
    4. باستخدام قطع الزجاج ماصة، وتحديد الأجنة عن طريق إضافة الأجنة إلى قارورة من الزجاج وصفت التي تم شغلها مع ما يقرب من 3-4 مل من Mempfa حل (الجدول 1). تجنب تحديد أكثر من 20-30 الأجنة في قارورة. إضافة الأجنة مع حد أدنى من نقل السائل من الجنين المتوسطة. إصلاح الأجنة في حل Mempfa لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    5. لهياكل الأديم الباطن أواخر أداء في بتوضع على معزولة يدويا القناة الهضمية والأديم الباطن المشتقات 9،10، والذي يسمح لاختراق جيد لجنة التحقيق، وكذلك يتجنب تجويف تلطيخ.
    6. تخزين محلول الميثانول بنسبة 100٪ في -20 ° C. بعد تثبيت بارافورمالدهيد، يستعاض عن حل Mempfa مع ما يقرب من 4 مل من -20 ° C، و 100٪ الميثانول لتخزين الأجنة.
    7. دوامة قارورة بعد إضافة الميثانول لمنع الأجنة من الالتصاق على الزجاج أو الأجنة الأخرى. أيضا، تأكد من أن يتم ختم القنينات بإحكام لأن الميثانول يمكن أن تتبخر في الثلاجة مع مرور الوقت إذا فضفاضة.
      ملاحظة: الأجنة يمكن تخزينها لمدة سنة على الأقل، وعلى الأرجح لفترة أطول، في الميثانول قبل تلطيخ مع عدم فقدان جودة في الموقع التهجين.

2. التحقيق التحضير

  1. استخدام 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي القالب لجعل تحقيقات المسمى digoxigenin. قطع البلازميد التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي المناسب في نهاية 5 'من الجينات في المصالح مع تقييد انزيم مناسب للثار ناقلات لتوليد تحقيقات العقاقير.
    ملاحظة: يجب أن يكون البلازميد موقع ملزم بوليميريز RNA المناسب (على سبيل المثال T7، T3، أو SP6).
  2. السماح للDNA، والمياه، NTP خلط وعازلة البلمرة لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة قبل تجميع رد فعل التوليف التحقيق. إضافة مكونات رد فعل التوليف RNA إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل بالترتيب كما هو موضح في الجدول رقم 2. ضبط حجم الماء المضاف لجلب إجمالي حجم رد الفعل التوليف التحقيق إلى 20 ميكرولتر. تجميع رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمكونات المخزن المؤقت البلمرة يمكن أن يعجل قالب DNA عندما تكون في تركيزات عالية والبرد.
  3. احتضان رد فعل النسخ لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: حضانات لأطول قليلا من ساعتين يؤدي إلى أي آثار سلبية، ولكن أيضا تظهر زادت قليلا الغلة. إذا المحتضنة لمدة ساعة واحدة، سيتم تخفيض العائد ولكن لا يزال كافيا لجعل التحقيق جيد.
    1. في انتظار رد فعل النسخ إلى النهاية، وجعل جل الاغاروز التي سيتم استخدامها لاختبار نوعية التحقيق. تذوب 1 ميكروغرام من الاغاروز في 100 مل من العازلة 1X TAE (انظر الجدول 1) عن طريق تسخين المحلول إلى نقطة الغليان. إزالة حل من الحرارة عندما مسحوق الاغاروز قد حلت تماما.
    2. إضافة 2 ميكرولتر إيثيديوم بروميد الأسهم الحل (10 ملغ / مل) إلى حوالي 100 مل من agarose هلام عندما يبرد الاغاروز إلى حوالي 60 درجة مئوية للسماح التصور من الحمض النووي الريبي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) النور.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ هذا الحل agarose هلام في 60 درجة مئوية الحاضنة بحيث يمكن سكب المواد الهلامية في المستقبل دون ذوبان المتكررة. العناية في التعامل مع بروميد إيثيديوم بسبب السمية المحتملة.
  4. إضافة 1 ميكرولتر DNAseI (ريبونوكلياز الصف مجانا) إلى رد فعل النسخ بعد حضانة 2 ساعة واحتضان لمدة 10 دقيقة أخرى في 37 ° C للقضاء على الحمض النووي القالب.
  5. إزالة 1 ميكرولتر من مزيج رد فعل لاطمئنان على 1٪ الاغاروز-تاي جل وإلى بقية (20 ميكرولتر) إضافة 80 ميكرولتر من 1٪ SDS في TE العازلة (10 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA)، و 10 ميكرولتر من 5M NH 4 خلات، و 220 ميكرولتر الإيثانول من البرد. دوامة المزيج بقوة ويوضع جانبا على الجليد حتى يتم معرفة نتائج فحص الجودة RNA.
    1. تشغيل ميكرولتر 1 من RNA إزالتها قبل هطول الأمطار على 1٪ الاغاروز-تاي هلام. لتخفيف التحميل على هلام، إضافة 4-5 ميكرولتر من الماء و 1 ميكرولتر من معيار صبغ تحميل لRNA. عرض RNA على هلام باستخدام نقل transilluminator ضوء الأشعة فوق البنفسجية من أجل التحقق من جودة التحقيق (انظر المناقشة).
  6. ترسيب RNA المتبقية التي تم تعيينها جانبا على الجليد في الخطوة 2.5 عن طريق الدوران في microcentrifuge بأقصى سرعة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. رسم قبالة طاف مع تعادل خارج ماصة الزجاج والسماح ليجف لفترة وجيزة.
    1. Resuspend والتحقيق مع 1 مل من العازلة RNA التهجين (الجدول 1) في أنبوب إيبندورف. دوامة ورiefly تسخين أنبوب إلى 37 درجة مئوية والدوامة مرة أخرى. نقل الحل التحقيق إلى 15 مل المسمار غطاء أنبوب البوليسترين وملء الى 7-10 مل مع العازلة RNA التهجين. ملاحظة: لجنة التحقيق يمكن أن تضعف مزيد (مزيد من التخفيف 10 أضعاف ما زالت قادرة على العمل) مما أدى في كثير من الأحيان في خلفية منخفضة إلا أن ردود الفعل تلطيخ أيضا يستغرق وقتا أطول.

3. تهجين موضعي

  1. خذ الأجنة التي تم تخزينها في -20 درجة مئوية الميثانول والسماح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة. تنفيذ الإجراء بأكمله في قوارير زجاجية. إذا أجنة مختلفة من مجموعة واحدة تسير ينبغي أن ينظر إليه من قبل تحقيقات مختلفة، والاحتفاظ بها في قارورة واحدة حتى قبل تضاف تحقيقات للحد من التقلبات والعمل في اليوم الأول.
    1. ترطيب الأجنة من خلال سلسلة الميثانول على النحو المبين في الجدول 3 (انظر الجدول رقم 1 عن وصفات غسل) تمهيدا لإضافة التحقيق. دوامة بلطف امبرينظام التشغيل بعد كل تغيير للتأكد من أنها لا إصرارها على الجانبين أو بعضها البعض، ويهز الأجنة عن طريق تركيب قارورة على nutator. عند نقل السوائل، والتحقق من الداخل من القبعات لضمان أن الأجنة لم محاصرين هناك.
    2. مرة واحدة في حل التحقيق، هجن الأجنة بين عشية وضحاها كما هو موضح في الجدول رقم 3.
  2. إزالة الحل التحقيق. حفظ التحقيق المستخدمة من قبل تخزينها في 15 مل المسمار غطاء أنبوب البوليسترين، مع وضع علامة التاريخ وعدد المرات التي استخدمت في التحقيق، في -20 ° C.
    ملاحظة: نفس التحقيق يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لاحقة في التهجين الموقع حتى تبدأ التفاعلات اللونية لأخذ وقت طويل بشكل غير طبيعي لتصل إلى كثافة المطلوب.
    1. وبمجرد أن التحقيق هو إزالتها، وإعداد الأجنة لتلوين الأجسام المضادة ضد التحقيق من خلال سلسلة من يغسل المبينة في الجدول رقم 4. تغيير درجة الحرارة كما هو مطلوب (الجدول 4) عن طريق تحريك رانه nutator، مع قارورة من الأجنة المرفقة، مباشرة في أفران التهجين التي تم تعيينها إلى درجة حرارة مناسبة.
    2. تشكل حجم مناسب من MAB + HTSS + BR + المضادة للحفر الأضداد (الجدول 4) في الوقت الذي الأجنة يجري المحتضنة في MAB + HTSS + BR عرقلة الحل بحيث يتم حظر الأجسام المضادة قبل إضافة إلى الأجنة. جعل الحلول عرقلة جديدة في اليوم من الاستخدام.
  3. إزالة حل الأجسام المضادة والبدء يغسل كما هو مبين في الجدول رقم 5 بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة. أداء اثني عشر على الأقل 30 دقيقة يغسل من أجل الاستعداد لتلطيخ مع الفوسفاتيز القلوية الركيزة وتقليل الخلفية قدر الإمكان. استخدام إما MAB عازلة أو TBT حل (الجدول 1) للخطوات الغسيل.
    / وأضاف مل من BSA حل TBT هو TTW يحتوي على 2 ملغ: ملاحظة.
    1. استبدال حل غسل الماضي مع BM الأرجواني الفوسفاتيز القلوية الركيزة. أداء REAC تلطيخنشوئها في أي درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تلطيخ أكثر سرعة عند 37 درجة مئوية ولكن إذا ترك بين عشية وضحاها، ويمكن تلوين الخلفية غير مقبول في كثير من الأحيان يكون نتيجة لذلك. فإن ردود الفعل تلطيخ وغالبا ما تتطلب تلطيخ بين عشية وضحاها ودرجة حرارة الغرفة هو الأكثر أمانا لذلك.
    2. إذا كنت بحاجة مزيد من تلطيخ وتتخذ الحل الأرجواني BM على اللون الأزرق، واستبدال الحل تلطيخ مع الطازجة BM الأرجواني ووضع أنابيب إلى 37 درجة مئوية. إذا كان مرنا الهدف وفيرة جدا، ووضع الأجنة في حل تلطيخ في 4 درجات مئوية خلال الليل ثم نقل الأجنة إلى درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية للسماح بمراقبة أفضل من رد فعل تلطيخ.
    3. مراقبة ردود الفعل جديدة بعناية، حيث أن الوقت لنتيجة النهائية اختلافا كبيرا بين الرنا المستهدفة المختلفة. من أجل التناسق، والتوقف عن رد فعل تلطيخ (انظر 3.4) عندما لا يكون هناك مواقع جديدة للتعبير الناشئة مع أطول الحضانة. الأهم من ذلك، إذا التهجين في الموقع ويجري استخدامها بوصفها الفحصللتجارب تبحث في مجموعات العلاج المختلفة، واستخدام نفس الوقت لردود الفعل اللون بين العلاج والسيطرة الأجنة.
  4. وقف رد فعل تلطيخ وإعداد الأجنة لتخزين وتسجيل صورة عن طريق تغيير السوائل على النحو المبين في الجدول 6. لا تهز الأجنة في هذه المرحلة لأن إزالة وصمة عار يمكن تصور مثل التلوين الأرجواني من الميثانول حول الأجنة.
    ملاحظة: في كثير من الأحيان الأجنة لديها تلطيخ الأزرق الفاتح من الحل تلطيخ والميثانول البارد يمكن إزالة جزئيا على الأقل أنه على الرغم من هذا لا يكفي لإزالة الخلفية الثقيلة أو تجويف تلطيخ. يشير الميثانول البارد لالميثانول التي يتم الاحتفاظ في الثلاجة -20 درجة مئوية.
    1. ترطيب الأجنة وإصلاح وصمة عار مع Mempfa (الجدول 6). مرة واحدة ثابتة، وإزالة Mempfa وغسل الأجنة مع 25٪ الميثانول.
    2. إزالة الميثانول بنسبة 25٪ وإضافة محلول التبييض إذا إزالة الصبغة الذاتيةمطلوب. العناية في التعامل مع حل التبييض لأنها يمكن أن تسبب الحروق. مراقبة تبيض عن كثب كما يحدث بسرعة نسبيا ودرجة التبييض يمكن أن تختلف عن تأثيرات مختلفة (الشكل 2).
    3. يذوى الأجنة من خلال سلسلة الميثانول إلى 100٪ الميثانول للتخزين على المدى الطويل بعد التبييض، أو نقلها إلى برنامج تلفزيوني لمدة التخزين على المدى القصير والتصوير لاحقا (انظر الجدول 6).

4. التصوير الأجنة

  1. مرة واحدة اكتمال الجنين عملية تلطيخ، صورة الجنين بحيث يتم التقاط معلومات عن مكان يتم التعبير عن هذا الجين من الفائدة لجمهور أوسع. استخدام 1٪ الاغاروز كخلفية لعرض الأجنة المزالة.
    ملاحظة: الاغاروز يعطي الزرقاء / الخلفية الرمادية التي يتناقض بشكل جيد مع الجنين واللون الأزرق للتفاعل تلطيخ. كما أنه يساعد على نزع فتيل الظلال والانعكاسات تشتيت أن تحويل الانتباه عن الجنين.
    1. إضافة الاغاروز في الماء ومن ثم تقديمهم ليغلي حتى الاغاروز هو في حل وثم السماح لتبرد إلى 50 قبل صب في طبق بتري. كما هو الحال مع الحل هلام TAE، وتخزين الحل الاغاروز في 55 ° C حاضنة لاستخدامات متعددة. صب الاغاروز إلى عمق حوالي 2 مم في طبق بتري. إذا لزم الأمر، وضبط عمق الاغاروز أن تسفر عن الظل بشكل مختلف قليلا من الخلفية.
    2. وبعد الإماهة من التخزين في الميثانول إلى محلول مائي (PBS أو TTW)، وذلك باستخدام سلسلة الميثانول، ووضع الأجنة في طبق بتري مع قاعدة الاغاروز (انظر الجدول 6). حافظ على حل نظيفة وإذا لزم الأمر، استخدم تصفية بسيطة للقضاء على الجسيمات الصغيرة التي يمكن أن تعطل الخلفية نظيفة من صور جيدة.
    3. لصورة الأجنة من وجهات نظر بديلة، مثل من الجانب البطني، وقطع قنوات رقيقة في الاغاروز لتناسب الجنين باستخدام ملقط غرامة ووضع الأجنة في تلك القنوات لتوجيه (الشكل 3 ). العناية في التلاعب في الأجنة لأنها تتلف بسهولة.
      ملاحظة: معظم مراحل لديهما موقف مميزة أنهم نفترض عند وضعها في محلول. على سبيل المثال، الأجنة مرحلة الأريمة تميل إلى الجلوس الحيوان حتى الجانب. مرة واحدة تبدأ الأجنة إلى استطال، فإنها تقع على جانبهم.
  2. استخدام مصدر ضوء الألياف البصرية لإلقاء الضوء على الجنين من زاوية الضحلة، وخلق الظلال على الجنين التي توفر عمقا في الصورة ومساعدة تمييز هياكل السطح. لأن التبييض يمكن القضاء الصباغ الذي يوفر المعالم مفيدة، استخدم التظليل للأجنة ابيض بقوة.
  3. مسح الأجنة لتلطيخ الصورة التي هو في أعماق الجنين، كما هو الحال في الحبل الظهري، الرئة، أو مناطق من الدماغ، (الشكل 4). ولتحقيق ذلك، وضع الأجنة من خلال سلسلة الميثانول حتى في الميثانول بنسبة 100٪.
    1. بعد الغمر الكامل في الميثانول، ونقل الأجنة في حل جزء واحد البنزيل الكحول وقسمين البنزيل يكونnzoate (BABB). سوف الأجنة تطفو على السطح في البداية ولكن كما الميثانول ستختلط مع BABB، وسوف تغرق في BABB. أداء كل خطوة التعامل مع BABB في قوارير الزجاج أو أطباق. سوف BABB تذوب أي البلاستيك أو الطلاء.
    2. مرة واحدة تطهيرها، عرض الأجنة مع الضوء المرسل القادمة من تحت الجنين. ضبط شدة الضوء وكذلك زاوية من الأسفل لتحسين التباين وتوفير أفضل لون.
    3. عندما تثير عرض الأجنة مسح طبق بتري الزجاج الخروج من القاعدة. القيام بذلك ببساطة عن طريق استخدام الآخران الأغطية طبق بتري لرفعه بحيث يتم رفع منطقة الطبق مع الأجنة.
      ملاحظة: هذا له ميزة أخذ قاعدة من التركيز والقضاء على آثار تشتيت من عيوب أو بقع على قاعدة المجهر التي يمكن أن تتداخل مع الصورة.

5. مزدوجة في الموقع التهجين

  1. من أجل عرض في وقت واحد نمط التعبير عن TWس جينات مختلفة في جنين واحد، تجميع تحقيقين، واحد لكل من الجينات المختلفة. توليف التحقيق واحد باستخدام DIG-11-UTP كتسمية كما هو موضح أعلاه. تمييع نتاج رد فعل النسخ في المخزن RNA التهجين لانتاج 3X التحقيق أكثر تركيزا مما كانت لاحد في التهجين الموقع.
    1. توليف التحقيق الأخرى ذات الاهتمام باستخدام نفس البروتوكول بالنسبة للDIG المسمى بحثها إلا أن فلوريسئين-12-UTP يجب أن تكون بديلا عن DIG-11-UTP. تمييع نتاج رد فعل النسخ في المخزن RNA التهجين لانتاج 3X التحقيق أكثر تركيزا مما كانت لاحد في التهجين الموقع.
    2. مزج درجتين تحقيقات مركزة في نسبة 1: 1. للحصول على أفضل النتائج، استخدم المسبار المسمى فلوريسئين عن الجينات التي تظهر أقوى تعبير في واحدة البروتوكول الموقع التهجين.
  2. استخدام نفس البروتوكول الموقع التهجين في وصفها لاحد في الموقع </ م> التهجين، باستثناء استخدام مسبار مزدوجة (التحقيق الذي يحتوي على خليط 1.5X تتركز تحقيقات digoxigenin المسمى والمسمى فلوريسئين) في نهاية اليوم الأول في مكان واحد الموقع التهجين التحقيق في.
    1. متابعة بروتوكول التهجين واحد في اليوم الثاني من ضعف البروتوكول الموقع التهجين، إلا شظايا استخدام المضادة للفلوريسئين-AP فاب في 1: التخفيف 4،000 بدلا من شظايا مكافحة DIG-AP فاب. تغسل الجسم المضاد الزائد من الأجنة كما هو الحال في واحدة البروتوكول الموقع في وتنفيذ رد فعل اللون الأول باستخدام الركيزة BM-AP الأرجواني.
  3. وبعد رد فعل اللون الأول، تعطيل الأجسام المضادة flourescein في 0.1 M جليكاين درجة الحموضة 2.0 لمدة 40 دقيقة تليها خمس عشرة دقيقة يغسل في MAB. منع الأجنة في MAB + HTSS + BR لمدة 90 دقيقة. إضافة الأجسام المضادة لمكافحة DIG في 1: التخفيف 2،000 في MAB + HTSS + BR واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    1. في اليوم التالي، وغسل الأجنة عشرoroughly في MAB (12 يغسل من 30 دقيقة) لإزالة الأجسام المضادة الزائد.
    2. غسل الأجنة لمدة 10 دقيقة في AP العازلة (الجدول 1) وبعد ذلك وصمة عار مع BCIP (0.5mg / مل في AP العازلة).
      ملاحظة: إن الجمع في الموقع يجب أن تعطي وصمة عار الأزرق الأرجواني الداكن لأول رد فعل اللون وخفيفة رد فعل اللون الأزرق للمرة الثانية (الشكل 5).
    3. وقف رد فعل اللون النهائي عن طريق إزالة عازلة AP وشطف ثلاث مرات مع MAB. إصلاح الأجنة مع Mempfa لمدة 10 دقيقة. غسل الأجنة مع 5 يغسل سريعة في MAB أو TBT.
    4. مع هذا الجمع اللون، واستخدام الميثانول في العلاجات آخر تلطيخ لم يعد ممكنا، كما أنه سيتم القضاء على BCIP وحده اللون. تخزين الأجنة بعد تلطيخ والتثبيت في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ أزيد الصوديوم. يمكن تلطيخ كثافة تكون ضعيفة مع ضعف في موقع المال. إذا كانت هذه هي مشكلة، والحد من يغسل إلى أربعة، كل من 2 مدة ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام تحقيقات محددة الأنسجة يمكن أن توفر معلومات العالقة في ما يخص حالة التنمية لأجهزة محددة. في الأمثلة التالية، ويستند مرحلة الجنين على الطاولة انطلاق Nieuwkoop وفابر 11. إذا كان أحد يستخدم الجينات شكل تحقيقات وأعرب بعد التمايز، تروبونين القلب أنا في مرحلة 28-30، على سبيل المثال (الشكل 1C)، وجود أو حجم الجهاز متباينة يمكن تقييمها في أي تمايز آخر مرحلة. قبل سنوات، كانت الأجنة قادرة على القيام مثل هذا التحليل المبني على المعرفة رائعة من الأنس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على استخدام الموقع التهجين لتصور نمط التعبير عن جينات معينة لا تزال الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد أجهزة معينة أو أنواع الخلايا في الجنين القيطم. وذلك لأن العديد من المزايا التي توفرها هذه التقنية. التعبير عن الجينات يمكن تحديد هياكل محددة جيدا قبل أي علامة النسيجي للتمايز مثل قضية للتعبير nkx2.5 في الأسلاف القلب قبل أي تمييز واضح تلك الخلايا 18. مرة واحدة كل من الكواشف هي في متناول اليد، بل هو أيضا تكلفة فعالة جدا. جيل من العديد من التحقي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لمركز القاهرة لحقوق الإنسان لدعم الزمالة من ستيف ديملينج وقسم طب الأطفال بجامعة ويسترن أونتاريو لدعم ستيف ديملينج ورامي حلبي وستيفاني جروفر. تم دعم هذا العمل من خلال R2654A11 منح NSERC وملحق NSERC Discovery Accelerator

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هزازات أنبوب LabguakeVWR17-08-2011
VWR قواريرVWR10-07-2012
L-CysteineBioShopCYS342.500
مجموعة ثلاثي الفوسفات ريبونوكليوزيد ، 100 ملي مترروش11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
مثبط رناز (Rnase OUT)Invitrogen 10777-019
T7 RNA PolymeraseFermentasEPO111
T3 RNA PolymeraseFermentasEPO101
SP6 RNA PolymeraseFermentasEPO131
Dnase 1Invitrogen 18047-019
مصل الأغنام  Wisent31150
كاشف الحجبRoche11096176001
BM الأرجواني Ap الركيزةRoche11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb شظاياRoche11093274910
MethanolVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM & nbsp ؛7910
EDTABioShopEDT001.500
تريسبيو شوبTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
مماسحBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ParaformaldehydeBioShopPAR070.500 
فورماميد  VWR       CAFX0420-4 
RNARoche10109223001
حمض الماليك  VWR       CAMX0100-3
ثلاثي سترات الصوديومBioShopCIT001
بيروكسيد الهيدروجين (محلول 30٪) EM& nbsp ؛HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
كحول البنزيلSigmaB-1042
بنزيل بنزواتسيجماB-6630
UltraPure Agarose   ؛Invitrogen 16500-500

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
  3. Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
  4. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  5. Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
  6. Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
  7. Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
  10. Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
  12. Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
  13. Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
  14. Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
  15. Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
  16. Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
  17. Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
  18. Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
  19. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
  20. Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus ARO

مقالات ذات صلة