Method Article

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في نبات الأرابيدوبسيس

DOI:

10.3791/51530

⸱

June 19th, 2014

 ,  , 
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich, 2Institut de Recherche pour le Développement (UMR 232), Centre National de la Recherche Scientifique (ERL 5300), Université de Montpellier II

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في النباتات المزهرة، ويتم وضع علامة على مصير الخلية الجسدية التي تمر بمرحلة انتقالية، لالإنجابية بحلول مواصفات الخلايا الأم بوغ (SMCS) في أجهزة الأزهار من نبات الكبار. وSMC الإناث (الخلية الأم للأبواغ الضخمة، MMC) يفرق في منشم بويضة ويخضع الانقسام الاختزالي. وأبواغ الضخمة فرداني اختيارها ثم يخضع الانقسام لتشكل الأمشاج الإناث متعددة الخلايا، والتي سوف تؤدي إلى الأمشاج، وخلية بويضة وخلية المركزية، جنبا إلى جنب مع الخلايا التبعي. إمكانية الوصول المحدودة للMMC، meiocyte ومنشئات الأمشاج الإناث داخل بويضة يمثل تحديا تقنيا للالخلوي والتحليلات الوراثية الخلوية على مستوى خلية واحدة. بشكل خاص، هو ضعف مناعي مباشر أو غير مباشر من الحواتم الخلوية أو النووية عن سوء تغلغل الكواشف داخل الخلية النباتية والتصوير وحيدة الخلية والمؤجرة من قبل عدم وضوح بصري في كامل جبل الأنسجة.

وبالتالي، قمنا بتطوير وسيلة فعالة لتحليل nuclمنظمة الأذن وتعديل لونين بدقة عالية من خلية واحدة في كامل جبل البويضات نبات الأرابيدوبسيس المضمنة. لأنه يقوم على تشريح والتضمين من البويضات ثابتة في طبقة رقيقة من الجل مادة الأكريلاميد على شريحة مجهرية. التي يتعرض لها جزءا لا يتجزأ من البويضات للعلاجات الكيميائية والأنزيمية التي تهدف إلى تحسين وضوح الأنسجة والنفاذية إلى الكواشف المناعية. تلك العلاجات الحفاظ على التنظيم، والحمض النووي والبروتينات الخلوية والحواتم لونين. العينات يمكن استخدامها لمختلف التحليلات الخلوي المصب، بما في ذلك المناعية لونين، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، وتلطيخ DNA لتحليل المغاير. متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري (CLSM) التصوير، مع ارتفاع القرار، تليها إعادة الإعمار 3D يسمح لقياس الكمي في قرار وحيد الخلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في النباتات المزهرة، وإنشاء الأنساب الإنجابية تبدأ مع تمايز SMCS، MMC الإناث والخلية الأم للأبواغ الصغيرة الذكور. في MMC يتطور من خلية nucellar البشرة الفرعي في الطرف البعيد من منشم بويضة، والخلية الأم للأبواغ الصغيرة يطور من الأنسجة تبوغية في locule العضو الذكري، والتي تقع في عمق الأجهزة الأزهار 1. SMCS الخضوع الانقسام الاختزالي لإنتاج أبواغ فرداني، ثم التي تؤدي إلى منشئات الأمشاج على الانقسام. الأمشاج الأنثوية، أو كيس الجنين، ويتكون من خلية واحدة بيضة، خلية مركزية واحدة، واثنين وثلاثة synergids antipodals. تتكون الأمشاج من الذكور، أو غبار الطلع، من الخلايا الخضرية واحد واثنين خلايا الحيوانات المنوية. بينما يبقى الن....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف الإجراء في سير العمل في الشكل 1، ويتم عرض الإعداد للتشريح والتضمين من الأنسجة في الشكل 2.

1. تثبيت الأنسجة

  1. جمع 20-30 الكرابل في أنبوب microfuge تحتوي تقدم طازجة BVO تثبيتي عازلة على الجليد.
  2. إصلاح الأنسجة دقيقة 30 مع طيف تهتز في درجة حرارة الغرفة.
  3. تدور الأنابيب التي تحتوي على الكرابل في تثبيتي في الفوق ميكروسنتريفوج 1 دقيقة في ز × 400.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكول قوية لإعداد واسعة النطاق وتجهيز البويضات نبات الأرابيدوبسيس مناسبة لتلطيخ الخلوي في جبل لالجامع. بفضل التضمين، والبويضات الاحتفاظ بنية 3 الأبعاد (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، فإن معالجة الأنسجة بما في ذلك توضيح البصرية تمكن التصوير الهياكل التحت خلوية في ارتفاع القرار. الشكل 4 يبين تلطيخ DNA في براعم بويضة كله يشن حيث يظهر المغاير كما مشرق، واضحة المعالم البؤر واضح (تم استخدام أي deconvolution لهذه الصورة). واستخدمت هذه الص.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في النباتات المزهرة، وتحيط النسب التناسلي للأنثى من خلال عدة طبقات الخلية بما في ذلك nucellus وteguments بويضة، مما يجعل تلطيخ الخلوي في كامل جبل تحديا تقنيا. هنا نقدم بروتوكول كفاءة تمكين إعداد وتجهيز عدد كبير من البويضات مناسبة لتلطيخ الخلوي مثل المناعية، وتلطيخ DNA ومضان التهجين في الموقع بأكمله في جبل. استخدمنا بنجاح ذلك لتحليل سلالة الجرثومية التناسلي للأنثى في نبات الأرابيدوبسيس 21،22. هذا الأسلوب هو كفاءة عالية إلى العديد من الشرائح يمك.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Ueli Grossniklaus (جامعة زيورخ) على الدعم الفني والمالي. نحن ممتنون لفاليريا غاجليارديني وكريستوف أيشنبرغر وأرتورو بولانوس وبيتر كوبف على الدعم العام في المختبر. تم تمويل هذا البحث من قبل جامعة زيورخ ، ومنح من المؤسسة الوطنية السويسرية إلى CB (31003A_130722) و Ueli Grossniklaus (31003A_141245 و 31003AB-126006) ، والوكالة الوطنية للبحوث إلى DG (برنامج ANR-BLANC-2012).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حلول
BVO Fixation Buffer (على أساس 32< / sup>)2 ملي مولار EGTA ، درجة الحموضة 7.5 ، 1٪ (حجم / حجم) فورمالديهايد ، 10٪ DMSO ، 1x PBS ، 0.1٪ Tween-20
PBT1x PBS ، 0.1٪ Tween-20
PBT-F1x PBT ، 2.5٪ (حجم / حجم) فورمالديهايد
30٪ أكريلاميد: بيساكريلاميد3 جم أكريلاميد ، 0.33 جم بيساكريلاميد ، 1x PBS (تحضير 10 مل ، تخزينها في درجة حرارة 4 درجات ؛ ج)
200 مل 5٪ مزيج أكريلاميد في PBS34 مل 30٪ أكريلاميد: بيساكريلاميد ، 166 مل 1x PBS (صنع طازجا من 30٪ مخزون) 20
٪ أمونيوم بيركبريتات0.2 جم أمونيوم بيركبريتات ، 1 مل ماء معقم (تحضير aliquots مع 1 مل وتخزينها في -20 درجة ؛ ج)
20٪ كبريتيت0.2 جم كبريتيت الصوديوم ، 1 مل ماء معقم (تحضير الحصص مع 1 مل وتخزينها في -20 درجة ؛ ج)
إنزيم جدار الخلية0.5٪ (وزن / حجم) السليولاز ، 1٪ (وزن / حجم) دريسيلاز ، 0.5٪ (وزن / حجم)
كواشف ومواد
البكتوليازات الفورمالديهايدسيجما ألدريتشF1635
DMSOسيجماD5879
تريسأماريسكو0497
الإيثانولET00102500
ميثانولSchaurlauME03062500
XyleneROTH4436.1
CellulaseSigma1794
DriselaseSigmaD8037
بكتوليزSigmaP5936
Tween-20Merck8.22184.0500
EGTASigmaE-4378
أكريلاميدسيجماA-3553
ثنائي الساكريلاميدسيجماM2022
الأمونيوم بيركبريتاتسامة سيجماA9164
كبريتيت الصوديومفلوكا71988
مضاد ثلاثي ميثيل هيستون H3 (Lys4)Upstate07-473
مضاد أحادي ميثيل هيستون H3 (Lys27)شمال الولاية07-448
أليكسا فلور 488 ~ الماعز ~ مضاد ~ أرنب (H + L)مسبار جزيئيA11008
ProlongGoldInvitrogenP36934
بروبيديوم يوديدسيجماP4170سام
DAPISigmaD9542
RNAse ARoche10109169001
Coplin jarHuber & CO10.055
ملقطدومونت بيولوجيا
شاكرهايدولف543-12310-00-0
غرفةصندوق بلاستيكي به منشفة ورقية مبللة بداخله ، يتم وضع دعامة بلاستيكية في الصندوق لدعم الشرائح والحفاظ على الشرائح من الماء.
سوبر فروست بلس الشريحةثيرمو فيشرJ1800AMNZMenzel-Glä ser
FISH Tag DNA KItInvitrogenF32947
GFP boosterChromotek
الصوديوم مزيج رطبة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
  2. Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Arabidopsis OvulesChromatin ModificationNuclear ArchitectureWhole mount AnalysisSingle cell ImagingConfocal MicroscopyFluorescence In Situ HybridizationTissue PermeationImmunostaining Protocol3D Reconstruction

Related Articles