التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

ملخص

الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد.

الملخص

الأجنة الزرد هي أداة قوية لفحص واسعة النطاق من جزيئات صغيرة. وكثيرا ما تستخدم الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل لتحديد المواد الكيميائية التي تعدل التعبير الجيني. شاشات الكيميائية التي مقايسة مضان في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة لفحص نسبة عالية. نحن تصف الإجراء باستخدام المجهر epifluorescence معيار مع مرحلة الآلية تلقائيا صورة الأجنة الزرد وكشف مضان الأنسجة محددة. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تبلغ عن نشاط مستقبلات هرمون الاستروجين عن طريق التعبير عن GFP، وضعنا الداخلي شبه الآلي للكشف عن بروابط مستقبلات هرمون الاستروجين التي تنشط مراسل بطريقة الأنسجة محددة. في هذا الفيديو وصفنا إجراءات arraying الأجنة الزرد في 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في لوحة 96 جيدا وإضافة جزيئات صغيرة التي تربط مستقبلات الاستروجين. في 72-96 HPF والصور من كل بئر منيتم جمع لوحة بأكمله تلقائيا وتفتيشها يدويا لمضان الأنسجة محددة. يوضح هذا البروتوكول القدرة على اكتشاف هرمون الاستروجين التي تنشط المستقبلات في صمامات القلب ولكن ليس في الكبد.

المقدمة

وقد وضعت الزرد المعدلة وراثيا التي تسمح لرؤية مباشرة من النشاط في مسارات الإشارات، مثل عوامل نمو الخلايا الليفية ^1، حمض الريتينويك ² و ³ الاستروجين، في الأجنة الحية. هذه الأدوات تمكين الكشف عن المواد الكيميائية التي التشويش على مسارات إشارات (يعاير مثل تغير في كثافة مضان) أو المواد الكيميائية التي تعدل يشير بطريقة الأنسجة محددة (تغيير في مضان التعريب) ^4. التقاط الصور الآلي يزيد من الإنتاجية بشكل كبير من شاشات الكيميائية ^5،6. الشاشات التي مضان فحص تلقائيا في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة. يوفر ما يسمى الفرز الفائق محتوى صالح ارتفاع القرار، والتصوير ا....

البروتوكول

ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من جامعة ألاباما في جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية برمنغهام.

1. تربية اسماك الزرد ومجموعات البيض

1. قبل ثلاثة أيام من بداية التعرض للمواد الكيميائية وتجميع الدبابات تربية مع فواصل للذكور والإناث منفصلة. ملء كل منتصف الطريق خزان المياه مع نظام تربية الأحياء المائية. باستخدام صافي، ونقل تيراغرام (5xERE: GFP) الأسماك ^c262/c262 إلى خزانات تربية، ووضع 2 ذكور و 3 إناث في كل خزان مفصولة المفرق. وضع غطاء على ....

النتائج

ويبين الشكل 1 الصور المركبة من الآبار الفردية لوحة 96 جيدا. وتتكون كل صورة مركب من 59 الصور الفردية مع 5٪ صورة التداخل. لاحظ أن الزرد الحية موجهة عشوائيا داخل كل بئر، ولكن نحن قادرون على التمييز مضان في قلب من الكبد. الصور Brightfield مفيدة كمرجع لتقييم التوجه الزرد وتصور شذوذ المورفولوجية (أرقام 1A و 1C). يستخدم التصوير الآلي باستخدام الهدف 10X لفحص المواد الكيميائية وتحديد التي تبرر التقييم دليل على التكبير العالي. الشكل 2 يوضح .......

المناقشة

يصف هذا البروتوكول وسيلة مباشرة لتلقائيا صورة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد. وقد تم تطوير بروتوكول باستخدام زايس محوري المراقب. Z1 مع زن الأزرق 2011 برنامج، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها باستخدام أي مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية وبرامج التحكم المجهر التي يمكن أن تؤدي تبليط لخلق صور مركبة. يمكن تجهيز مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية توفر عملية بديلة أقل تكلفة لشراء معدات متخصصة لفحص عالية المحتوى. تتراوح مراحل بمحركات من عدة آلاف إلى عشرات الآلاف من الدولارات الأميركية، اعتمادا على تقد.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ماصات نقل البلاستيك ؛ ماصات نقل بلاستيكية واسعة التجويف	فيشر	13-711-23
؛ طرف ناعم	فيشر	13-711-26
96 بئر ، مستديرة ، ألواح مسطحة	القاع فيشر	21-377-203
100 × 35 مم	ألواح فيشر	08-757-100D
35 × 60 مم	فيشر	08-757-100B
Dumont # 5 ملقط دقيق	أدوات العلوم الدقيقة	11254-20	أبعاد الطرف 0.05 × 0.01 مم ، لإزالة المشيمات يدويا من الأجنة
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	انظر كتاب الزرد للوصفة (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-فينيل 2-ثيوريا (PTU)	سيجما ألدريتش	P7629-10G	تحضير مخزون 20 ملي (100x) واستخدامه عند 200 مو ؛ M في E3B
Zeiss Axio Observer Z1	بروتوكول Carl Zeiss		مجهر مضان مقلوب مع هدف مسافة عمل طويلة 20x بمرحلة آلية
	كارل زايس		نستخدم هدفا مع 0.4 NA و 8.4 مم مسافة عمل
Axiocam HRm كاميرا رقمية	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 برنامج التحكم في المجهر	كارل زايس		يتطلب البروتوكول أتمتة الفحص المجهري وبرنامج التحكم لتمكين التقاط الصور المبلطة باستخدام مرحلة آلية
الميثيلين الأزرق	سيجما ألدريتش	MB-1 ؛ 25 جراما	تصنع محلول 2٪ في ماء التناضح العكسي للاستخدام في E3B (أدناه)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl   ؛                                     - 17.2 جرام KCl   ؛                                           - 0.76 جرام CaCl 2 < / sub > -2H < sub > 2 < / sub > O & nbsp ؛       - 2.9 جرام MgSO4< / sub>-7H 2< / sub>O & nbsp ؛ - 4.9 جرام أو MgSO4< / sub> - 2.39 جرام يذوب في 1 لتر ماء Milli-Q ؛ تخزينها في زجاجة معقمة سعة 1 لتر. 1X E3B لأسماك الزرد: 60X E3 &NBSP ؛         150 مل 2٪ ميثيلين أزرق   ؛       100 مو ؛ l  أحضر ما يصل إلى 9 لترات مع ماء Milli-Q   ؛

لوحات يتطلب