Method Article

الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

DOI:

10.3791/51543

⸱

June 25th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Oncology, National Center for Tumor Diseases (NCT) and German Cancer Research Center (DKFZ)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطي التضخيم بوساطة (LAM)-PCR هو طريقة تم تطويرها لتحديد مواقع الدقيق لدمج ناقلات فيروسية في الجينوم. وقد تطورت هذه التقنية لتكون طريقة متفوقة لدراسة ديناميات النسيلي في المرضى العلاج الجيني، والسلامة البيولوجية التكنولوجيات رواية ناقلات، والتنوع تي خلية، ونماذج الخلايا الجذعية السرطانية، الخ

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تم تطوير

PCR بوساطة التضخيم الخطي (LAM-PCR) لدراسة تكون الدم في الخلايا المصححة جينيا للمرضى الذين عولجوا بالعلاج الجيني مع دمج أنظمة النواقل. نظرا للتكامل المستقر لنواقل الفيروسات القهقرية ، يمكن استخدام مواقع التكامل لدراسة المصير النسيلي للخلايا الفردية وذريتها. قدم LAM- PCR لأول مرة دليلا على أن سرطان الدم في العلاج الجيني للمرضى الذين عولجوا نشأ من الإفراط في التعبير عن الجين الورمي المجاور الناجم عن الفيروس. يتم تحقيق الحساسية العالية والخصوصية ل LAM-PCR مقارنة بالطرق الحالية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي وربط الربط بوساطة (LM)-PCR من خلال خطوة التضخيم الأولي (PCR الخطي من 100 دورة) باستخدام بادئات محددة للناقلات الحيوية التي تسمح بتنفيذ خطوات التفاعل اللاحقة على الطور الصلب (الخرز المغناطيسي). يعد LAM-PCR حاليا الطريقة الأكثر حساسية المتاحة لتحديد الحمض النووي غير المعروف الموجود بالقرب من الحمض النووي المعروف. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نوع مختلف من LAM-PCR يتحايل على هضم التقييد وبالتالي يلغي تحيز الاسترجاع لمواقع التكامل ويتيح تحليلا شاملا لمواقع الفيروس الإيجابي في جينومات المضيف. يشرح البروتوكول التالي خطوة بخطوة تضخيم كل من التسلسلات 3 'و 5' المجاورة للناقل الفيروسي العسسي المتكامل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطي التضخيم بوساطة PCR (LAM-PCR) يسمح تحديد وتوصيف غير معروف الحمض النووي DNA المرافقة مجاورة ليعرف من أي منشأ. وبشكل أكثر تحديدا، تم تطوير LAM-PCR في توطين مواقع التكامل ناقلات فيروسية (IS) في الجينوم المضيف 1،2. العناصر الجينية مثل الفيروسات القهقرية أو ترانسبوزونات دمج الجينوم الخاصة بهم في جينوم المضيف في (شبه) بطريقة عشوائية 3-6. في كثير من الحالات هو حاسمة أن يعرف بالضبط الموقف حيث تتكامل هذه النواقل. وقد ثبت LAM-PCR لتكون متفوقة على التقنيات البديلة مثل بوساطة ربط PCR 7 ومشتقاته أو العكسية PCR 8. حساسية ومتانة هذه الطريقة ينشأ من preamplification الأولي للتقاطعات ناقلات الجينوم واختيار المغناطيسي من المنتجات PCR تضخيمها. مثل الطرق البديلة المذكورة، تعتمد LAM-PCR على استخدام إنزيمات التقييد، وإدخال التحيز في قدرة استرجاع IS 9-11. وبالتالي،ويمكن الكشف عن مجموعة فرعية فقط من مرجع هي (integrome) في رد فعل واحد. يتم التقليل من هذا التحيز من خلال تحليل مواز لعينة معينة باستخدام تركيبات الأمثل للأنزيمات تقييد 9. في الآونة الأخيرة، وهو البديل من التكنولوجيا يطلق عليه غير المقيدة وقد تم تطوير LAM-PCR (nrLAM-PCR) التي تلتف استخدام إنزيمات التقييد ويسمح تحليل الجينوم على نطاق غير منحازة لعينة في رد فعل واحد 9،12.

في الماضي، استخدمت LAM-PCR لتحديد فيروس المسبب للمرض هو مما أدى إلى سرطان الدم في عدد قليل من المرضى في التجارب السريرية العلاج الجيني 13-15. منذ ذلك الحين، تم تكييفها LAM-PCR لتحديد IS من ناقلات أخرى دمج (ناقلات lentiviral، ترانسبوزونات) وأيضا لتحديد أنماط التكامل دمج سلبي مثل ناقلات ناقلات الغدة المرتبطة (AAV) أو integrase معيبة ناقلات lentiviral (IDLV) 16 -21. واسعة تنتشر تطبيقات LAM-PCR: التقليديةلاي، ويستخدم على نطاق واسع هذه التقنية لدراسة تكوين نسيلي خلايا الجينات المعدلة في المرضى الذين خضعوا لعلاج الجينات أو لتقييم السلامة الأحيائية أنظمة النواقل رواية كشف السلوك اندماجهم 15،16،22-24. في الآونة الأخيرة، تمكين LAM-PCR تحديد خصوصية وبعيدا عن الهدف من النشاط nucleases مصمم من قبل IDLV محاصرة مقايسة 25.

علاوة على ذلك، LAM-PCR يسمح بسهولة لمتابعة مصير الخلايا transduced مع مرور الوقت في كائن حي. وهذا يسمح لتحديد بروتو الجينات المسرطنة وكذلك الورم الجينات القامع وأيضا لدراسة تكون الدم أو سرطان الخلايا الجذعية والبيولوجيا 26-28. أخيرا وليس آخرا، تم تكييفها LAM-PCR لدراسة التنوع مستقبلات خلايا T في الإنسان 29 (وبيانات غير منشورة).

ومما يعزز قوة لا يتجزأ من التكنولوجيا من خلال ربط الأسلوب لتقنيات التسلسل العميقة التي تسمح تميز الملايين من المجهول المرافقة الحمض النووي مع واحد النوكليوتيدات صesolution في الجينوم بأكمله. في بروتوكول التالية، ونحن تصف خطوة بخطوة التضخيم وتحديد المرافقة الحمض النووي غير معروف exemplarily لتحديد ناقلات lentiviral IS. يتم سرد أليغنوكليوتيد] المستخدمة في البروتوكول في الجدول 1. المستخلصة الحمض النووي أو كدنا] من أي مصدر يمكن استخدامها كقالب الحمض النووي لLAM-PCR وnrLAM-PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد رابط كاسيت (LC)

  1. مزيج 40 ميكرولتر من LC1 قليل النوكليوتيد (الجدول 1)، و 40 ميكرولتر من LC2 قليل النوكليوتيد (الجدول 1، مع تقييد انزيم عبء السليم)، و 110 ميكرولتر تريس، حمض الهيدروكلوريك (100 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)، و 10 ميكرولتر 250 ملم MgCl 2.
  2. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5MIN والسماح للتفاعل يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 300 ميكرولتر H 2 O والتركيز dsLinker الحمض النووي على فلتر الطرد المركزي. إضافة 80 ميكرولتر H 2 O إلى شطافة وقسامة 10 ميكرولتر من استعداد رابط الكاسيت في 0.2 أنابيب PCR.

2. Preamplification من ناقلات الجينوم المفارق

  1. لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
    1. تحديد تركيز عينات من الحمض النووي. ماصة ميكرولتر س (1-1،000 نانوغرام للLAM/100-1، 000 نانوغرام للnrLAM) من الحمض النووي إلى 0.2 مل أنبوب PCR. يجب أن يكون حجم الحمض النووي على قدم المساواة في كل عينة وركض فيجنرال الكتريك من 0،5 حتي 25 ميكرولتر.
    2. إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 2 ميكس (50 - س). ميكرولتر من مزيج الرئيسي مع كل عينة الحمض النووي في 0.2 مل أنابيب PCR.
  2. Preamplify ناقلات تقاطعات الجينوم باستخدام PCR الظروف المتمثلة في الجدول 2. بعد الانتهاء من PCR إضافة 0.5 ميكرولتر طق البلمرة إلى كل أنبوب PCR وبرنامج PCR باعادتها. ويمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

3. الفصل المغناطيسي للPCR المنتج

  1. إعداد الخرز المغناطيسي
    1. ماصة 20 ميكرولتر (200 ميكروغرام) من streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي في أنبوب 1.5 مل وفضح لمدة 1 دقيقة على فاصل الجسيمات المغناطيسية (MPS) في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف.
    2. إزالة أنبوب من MPS و resuspend حبات مغناطيسية في 40 ميكرولتر الحزب الاشتراكى البرازيلى / 0.1٪ BSA (الرقم الهيدروجيني 7.5). فضح لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    3. غسل حبات وايال 20 ميكرولتر من 3 M LiCl الحل (3 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA) لفضح MPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. الخرز resuspend في 50 ميكرولتر من LiCl M 6 الحل (6 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA).
  2. مزيج تفاعل PCR بأكمله من الخطوة 2.2 مع 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المعدة. احتضان الأفقي على شاكر (300 دورة في الدقيقة) على الأقل لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة تسمح ملزمة من الناتج PCR البيروكسيديز إلى streptavidin المغلفة الخرز (مجمع الحمض النووي الخرزة). يمكن المحتضنة معقدة حبة الحمض النووي على شاكر بين عشية وضحاها أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام.
  3. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف، و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. الشروع فورا في الخطوة 4 للام أو خطوة 5 لnrLAM.

4. LAM-الداخلي

  1. ضعف ستراند الحمض النووي (dsDNA و) التجميعي (LAM فقط)
    1. فضح معقدة الحمض النووي حبة من الخطوة 3.3 للنواب لمدة 1 دقيقة وديسبطاقة طاف. إضافة 8.25 ميكرولتر من H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة 10X hexanucleotide، 0.25 ميكرولتر dNTPs (10 ملم) و 0.5 ميكرولتر (2 U) Klenow البلمرة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. إضافة 90 ميكرولتر من H 2 O وفضح لMPS لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O.
  2. تقييد دايجست
    1. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 8.5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة 10X تقييد انزيم و 0.5 ميكرولتر من انزيم التقييد واحتضان رد فعل لمدة 1 ساعة. كرر الخطوة 4.1.2.
      ملاحظة: احتضان رد الفعل في درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للانزيم التقييد. تأكد من أنه لا يوجد أي قيود موجودة في موقع أو المصب من موقع ملزم التمهيدي تستخدم لpreamplification في الحمض النووي من الفائدة. لاختيار مجموعات انزيم تقييد الانزيمات / تقييد مناسبة الرجوع إلى 9.
  3. ربط س من رابط (LK)
    1. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر 10X فاست لينك العازلة، 1 ميكرولتر ATP (10 ملم)، 2 ميكرولتر رابط الكاسيت من الخطوة 1.2، و 1 ميكرولتر سريعة لينك الحمض النووي يغاز (2 U / ميكرولتر). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر الخطوة 4.1.2.
  4. تمسخ من تجميعي dsDNA و
    1. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. معقدة في resuspend الحمض النووي الخرزة في 5 ميكرولتر 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر الأفقي.
    2. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وجمع preamplified تقاطع ناقلات الجينوم تحتوي على طاف في أنبوب جديد 1.5 مل. الشروع فورا في الخطوة 6 أو مخزن طاف في -20 درجة مئوية.

5. nrLAM-الداخلي

  1. ربط واحد الذين تقطعت بهم السبل من رابط (SSLC) (nrLAM فقط)
    1. فضح معقدة الحمض النووي حبة من الخطوة 3.3 إلى MPSلمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 6.5 ميكرولتر H 2 O، CircLigase 1 ميكرولتر العازلة 10X رد الفعل، 0.5 ميكرولتر MnCl 2 (50 ملم)، و 0.5 ميكرولتر ATP (1 ملم)، 1 ميكرولتر ssLinker نيوكليوتيدات دقيقة و 0.5 ميكرولتر CircLigase (100 U / ميكرولتر). احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. إضافة 90 ميكرولتر من H 2 O وفضح لMPS لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. تعرض مرة أخرى لMPS لمدة 1 دقيقة، طاف تجاهل و resuspend معقدة الحمض النووي الخرزة في 10 ميكرولتر H 2 O.

6. الأسي التضخيم أنا

  1. لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
    1. ماصة 2 ميكرولتر قالب الحمض النووي (من الخطوة 4.4.2 (LAM) أو 5.1.2 (nrLAM)) إلى 0.2 مل أنبوب PCR.
    2. إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 3. إضافة 48 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 6.1.1 وتضخيم ناقلات تقاطعات الجينوم بواسطة PCR CONDITIOنانوثانية يتضح في الجدول 3. يمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

7. الفصل المغناطيسي للPCR المنتج

  1. إعداد حبات مغناطيسية كما حدث مثلا في خطوات 3.1.1 - 3.1.3. الخرز resuspend في 20 ميكرولتر (للام) أو 50 ميكرولتر (لnrLAM) من 6 م LiCl الحل (6 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA). مزيج 20 ميكرولتر (LAM) أو 50 ميكرولتر (nrLAM) من رد فعل PCR من الخطوة 6.1.2 مع حبات مغناطيسية استعداد (الخطوة 7.1)، واحتضان على شاكر الأفقي (300 دورة في الدقيقة) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يمكن المحتضنة معقدة حبة الحمض النووي على شاكر بين عشية وضحاها أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام.
  2. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف.
  3. في resuspend معقدة الحمض النووي الخرزة في 20 ميكرولتر (LAM) أو 5 ميكرولتر (nrLAM) 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. Incuباتي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر الأفقي، فضح لMPS لمدة 1 دقيقة وجمع الحمض النووي التي تحتوي على تضخيم طاف في أنبوب جديد 1.5 مل. الشروع فورا في الخطوة 8.1 أو مخزن طاف في -20 درجة مئوية.

8. الأسي التضخيم الثاني

  1. لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
    1. ماصة 2 ميكرولتر قالب الحمض النووي (من الخطوة 7.3) إلى 0.2 مل أنبوب PCR.
    2. إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 4. إضافة 48 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 8.1.1 وتضخيم ناقلات تقاطعات الجينوم ظروف PCR يتضح في الجدول رقم 4. يمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. لتصور (NR) منتجات LAM-PCR، تحميل 10 ميكرولتر من المنتج PCR من الخطوة 8.1.2 على 2٪ agarose هلام. إذا نطاقات واضحة وتحليل 10 ميكرولتر من المنتج LAM-PCR على هلام عالية الدقة. تنبيه: إتبروميد hidium هو التشوهات الخلقية. العمل بعناية فائقة ودائما ارتداء القفازات المناسبة.

9. إعداد لارتفاع الإنتاجية تسلسل

  1. تنقية (NR) منتجات LAM-PCR
    1. مزيج 40 ميكرولتر PCR المنتج من الخطوة 8.1.2 مع 44 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة AMPure XP الخرز المغناطيسي. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفضح لMPS ل2 دقيقة إضافية.
    2. تجاهل طاف ويغسل مرتين مع 200 ميكرولتر 70٪ ETOH على MPS.
    3. تجاهل طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 30 ميكرولتر حبة H 2 O. احتضان 1 دقيقة ونقل طاف لأنبوب 0.2 مل الطازجة. تحديد تركيز الحمض النووي تنقيته.
  2. Fusionprimer PCR لإضافة محولات تسلسل معين.
    1. لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل.
    2. ماصة ميكرولتر س (40 نانوغرام) من الحمض النووي إلى 0.2 مل أنبوب PCR. يجب أن يكون حجم الحمض النووي على قدم المساواة في كل عينة وفي حدود 0،5 حتي 25 ميكرولتر.
    3. إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 5 إضافة (50 - س). ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 9.2.2 وإدخال محولات تسلسل إلى (NR) منتجات LAM-PCR PCR الظروف المتمثلة في الجدول 5 منتجات PCR. يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    4. لتصور Fusionprimer-PCR تحميل المنتجات 10 ميكرولتر من المنتج PCR من الخطوة 9.2.3 على 2٪ agarose هلام. تنقية المنتج PCR المتبقية كما هو موضح في الخطوات 9.1.1 - 9.1.3. تحليل 1 ميكرولتر منتج PCR تنقيته من الخطوة 9.4 على الآلية عالية الدقة الجهاز الكهربائي لقياس بدقة تركيز وجزء حجم المنتجات Fusionprimer-PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج LAM-PCR في التضخيم من ناقلات تقاطعات مع حجم الجينوم جزء المحدد لكل تقاطع. حجم الفردية شظايا PCR يعتمد على المسافة بين موقع الحمض النووي المعروف في الجينوم وأقرب موقع تقييد الاعتراف الانزيم. وهذا يسمح تصور تنوع تقاطعات تضخيم في العينات التي تم تحليلها من قبل الكهربائي هلام، على سبيل المثال، إذا كانت موجودة على هلام واحد فقط (وحيدة النسيلة)، عدة (oligoclonal)، أو متعددة (بولكلونل) العصابات. نتائج LAM-PCR يتم عرضها بشكل أفضل من خلال المواد الهلامية الكهربائي عالية ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية LAM-PCR يسمح تحديد تسلسل الحمض النووي المجهولة التي تكتنف المنطقة الحمض النووي المعروف. بسبب حساسية عالية الناجمة عن preamplification من تقاطعات مع الاشعال محددة التهجين في تسلسل الحمض النووي المعروف، فمن الممكن لتضخيم وكشف حتى تقاطعات نادرة وصولا الى مستوى خلية واحدة. العكس من ذلك، في حالة بولكلونل LAM-PCR قادرة على تضخيم الآلاف من تقاطعات مختلفة في رد فعل واحد.

ولكن نظرا لاستخدام تقييد الانزيمات فقط فخذ م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230 ، منحة من مركز الأورام هايدلبرغ / مانهايم) ، من قبل Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene) ، من قبل البرامج الإطارية السادس + السابع للمفوضية الأوروبية (CONSERT و CLINIGENE و PERSIST). نشكر Ina Kutschera على إظهار تقنية البروتوكول في الفيديو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
يمكن استخدام Taq DNA PolymeraseGenaxxon Bioscience GmbHM3001.5000Alternative Taq Polymerases
PCR BufferQiagen201203يوصى باستخدام هذا المخزن المؤقت
dNTP-MixGenaxxon Bioscience GmbHM3015.4020أو أي dNTPs أخرى
قليل النوكليوتيدات (الاشعال)MWG BiotechHPLC
Dynabeads المنقى M-280 ستربتافيدين Invitrogen11206D
PBSGibco14190-0860.1٪ الوزن / الحجم BSA
6 M LiClRoth3739.110 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) / 1 ملي مولار EDTA
Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5USB Corporation   ؛22637أو أي مورد آخر
EDTAApplichemA1103،0250أو أي مورد آخر
Klenow PolymeraseRoche Diagnostics10104523001
خليط سداسي النوكليوتيداتRoche Diagnostics11277081001
تقييد نوكليازداخلي NEBأو أي مورد آخر
طقمربط الحمض النووي سريع الارتباطEpicentre BiotechnologiesLK11025
CircLigase ssDNA Ligase KitEpicentre BiotechnologiesCL4111K
NaOHSigma-Aldrich72068أو أي مورد آخر
Agarose LERoche Diagnostics11685660001أو أي مورد آخر
TBE bufferAmresco0658أو أي مورد آخر
Ethidium bromideApplichemA2273،0005بروميد الإيثيديوم هو مطفرات
100 نقطة أساس سلم الحمض النوويInvitrogen15628-050أو أي سلم آخر للحمض النووي
20 ملي كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتش71393-1Lأو أي مورد آخر
فاصل الجسيمات المغناطيسية Magna-Sep   ؛Life Technologiesللاستخدام مع أنابيب 1.5 مل
Magna-Sep فاصل الجسيمات المغناطيسيةLife TechnologiesK158696للاستخدام مع ألواح 96 بئرا Amicon
Ultra-0.5 أو Ultracel-30 غشاءMilliporeUFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi SPeqLab40-1515أو نظام الرحلان الكهربائي الآخر
TProfessional 96Biometra050-551أو غيرها من Thermocycler لألواح 96 بئر
شاكر مداري KS 260 الأساسيIKA2980200أو غيرها من الأنابيب اللينة PCR الأفقية
الأفقية 0.2 ملBiozym Scientific GmbH711082أو أنابيب PCR أخرى 0.2 مل
1.5 ملEppendorf12682أو غيرها من أنابيب 1.5 مل
نظام توثيق جلPeqLabأو أي نظام توثيق هلام آخر
Nanodrop ND-1000 مقياس الطيفالضوئي Thermo ScientificND-1000
Spreadex EL1200 جل مسبقة الصبElchrom Scientific3497
جهاز الرحلان الكهربائي للهلام المغمور SEA 2000 & nbsp ؛Elchrom Scientific2001E
2100 Electrophoreser BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
K158501 أنابيب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
  2. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
  3. Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  4. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  5. Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
  6. Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
  7. Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
  8. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
  10. Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
  11. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
  12. Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
  13. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
  14. Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
  15. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
  16. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
  17. Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
  18. Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
  19. Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
  20. Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
  21. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
  22. Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
  23. Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
  24. Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
  25. Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
  26. Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
  27. Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
  28. Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
  29. Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
  30. Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Linear Amplification Mediated PCRVector Genome JunctionsBiotinylated PrimersMagnetic BeadsSolid Phase AmplificationExponential AmplificationRestriction EnzymeLigation ReactionGel ElectrophoresisDeep Sequencing

Related Articles