Method Article

الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

DOI:

10.3791/51543

⸱

June 25th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Oncology, National Center for Tumor Diseases (NCT) and German Cancer Research Center (DKFZ)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطي التضخيم بوساطة (LAM)-PCR هو طريقة تم تطويرها لتحديد مواقع الدقيق لدمج ناقلات فيروسية في الجينوم. وقد تطورت هذه التقنية لتكون طريقة متفوقة لدراسة ديناميات النسيلي في المرضى العلاج الجيني، والسلامة البيولوجية التكنولوجيات رواية ناقلات، والتنوع تي خلية، ونماذج الخلايا الجذعية السرطانية، الخ

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تم تطوير

PCR بوساطة التضخيم الخطي (LAM-PCR) لدراسة تكون الدم في الخلايا المصححة جينيا للمرضى الذين عولجوا بالعلاج الجيني مع دمج أنظمة النواقل. نظرا للتكامل المستقر لنواقل الفيروسات القهقرية ، يمكن استخدام مواقع التكامل لدراسة المصير النسيلي للخلايا الفردية وذريتها. قدم LAM- PCR لأول مرة دليلا على أن سرطان الدم في العلاج الجيني للمرضى الذين عولجوا نشأ من الإفراط في التعبير عن الجين الورمي المجاور الناجم عن الفيروس. يتم تحقيق الحساسية العالية والخصوصية ل LAM-PCR مقارنة بالطرق الحالية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي وربط الربط بوساطة (LM)-PCR من خلال خطوة التضخيم الأولي (PCR الخطي من 100 دورة) باستخدام بادئات محددة للناقلات الحيوية التي تسمح بتنفيذ خطوات التفاعل اللاحقة على الطور الصلب (الخرز المغناطيسي). يعد LAM-PCR حاليا الطريقة الأكثر حساسية المتاحة لتحديد الحمض النووي غير المعروف الموجود بالقرب من الحمض النووي المعروف. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نوع مختلف من LAM-PCR يتحايل على هضم التقييد وبالتالي يلغي تحيز الاسترجاع لمواقع التكامل ويتيح تحليلا شاملا لمواقع الفيروس الإيجابي في جينومات المضيف. يشرح البروتوكول التالي خطوة بخطوة تضخيم كل من التسلسلات 3 'و 5' المجاورة للناقل الفيروسي العسسي المتكامل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطي التضخيم بوساطة PCR (LAM-PCR) يسمح تحديد وتوصيف غير معروف الحمض النووي DNA المرافقة مجاورة ليعرف من أي منشأ. وبشكل أكثر تحديدا، تم تطوير LAM-PCR في توطين مواقع التكامل ناقلات فيروسية (IS) في الجينوم المضيف 1،2. العناصر الجينية مثل الفيروسات القهقرية أو ترانسبوزونات دمج الجينوم الخاصة بهم في جينوم المضيف في (شبه) بطريقة عشوائية 3-6. في كثير من الحالات هو حاسمة أن يعرف بالضبط الموقف حيث تتكامل هذه النواقل. وقد ثبت LAM-PCR لتكون متفوقة على التقنيات البديلة مثل بوساطة ربط PCR 7 ومشتقاته أو العكسية PCR 8. حساسية ومتانة هذه الطريقة ينشأ من preamplification الأولي للتقاطعات ناقلات الجين....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد رابط كاسيت (LC)

  1. مزيج 40 ميكرولتر من LC1 قليل النوكليوتيد (الجدول 1)، و 40 ميكرولتر من LC2 قليل النوكليوتيد (الجدول 1، مع تقييد انزيم عبء السليم)، و 110 ميكرولتر تريس، حمض الهيدروكلوريك (100 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)، و 10 ميكرولتر 250 ملم MgCl 2.
  2. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5MIN والسماح للتفاعل يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 300 ميكرولتر H 2 O والتركيز dsLinker الحمض النووي على فلتر الطرد المركزي. إضافة 80 ميكرولتر H ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج LAM-PCR في التضخيم من ناقلات تقاطعات مع حجم الجينوم جزء المحدد لكل تقاطع. حجم الفردية شظايا PCR يعتمد على المسافة بين موقع الحمض النووي المعروف في الجينوم وأقرب موقع تقييد الاعتراف الانزيم. وهذا يسمح تصور تنوع تقاطعات تضخيم في العينات التي تم تحليلها من قبل الكهربائي هلام، على سبيل المثال، إذا كانت موجودة على هلام واحد فقط (وحيدة النسيلة)، عدة (oligoclonal)، أو متعددة (بولكلونل) العصابات. نتائج LAM-PCR يتم عرضها بشكل أفضل من خلال المواد الهلامية الكهربائي عالية ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية LAM-PCR يسمح تحديد تسلسل الحمض النووي المجهولة التي تكتنف المنطقة الحمض النووي المعروف. بسبب حساسية عالية الناجمة عن preamplification من تقاطعات مع الاشعال محددة التهجين في تسلسل الحمض النووي المعروف، فمن الممكن لتضخيم وكشف حتى تقاطعات نادرة وصولا الى مستوى خلية واحدة. العكس من ذلك، في حالة بولكلونل LAM-PCR قادرة على تضخيم الآلاف من تقاطعات مختلفة في رد فعل واحد.

ولكن نظرا لاستخدام تقييد الانزيمات فقط فخذ م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230 ، منحة من مركز الأورام هايدلبرغ / مانهايم) ، من قبل Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene) ، من قبل البرامج الإطارية السادس + السابع للمفوضية الأوروبية (CONSERT و CLINIGENE و PERSIST). نشكر Ina Kutschera على إظهار تقنية البروتوكول في الفيديو.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
يمكن استخدام Taq DNA PolymeraseGenaxxon Bioscience GmbHM3001.5000Alternative Taq Polymerases
PCR BufferQiagen201203يوصى باستخدام هذا المخزن المؤقت
dNTP-MixGenaxxon Bioscience GmbHM3015.4020أو أي dNTPs أخرى
قليل النوكليوتيدات (الاشعال)MWG BiotechHPLC
Dynabeads المنقى M-280 ستربتافيدين Invitrogen11206D
PBSGibco14190-0860.1٪ الوزن / الحجم BSA
6 M LiClRoth3739.110 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) / 1 ملي مولار EDTA
Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5USB Corporation   ؛22637أو أي مورد آخر
EDTAApplichemA1103،0250أو أي مورد آخر
Klenow PolymeraseRoche Diagnostics10104523001
خليط سداسي النوكليوتيداتRoche Diagnostics11277081001
تقييد نوكليازداخلي NEBأو أي مورد آخر
طقمربط الحمض النووي سريع الارتباطEpicentre BiotechnologiesLK11025
CircLigase ssDNA Ligase KitEpicentre BiotechnologiesCL4111K
NaOHSigma-Aldrich72068أو أي مورد آخر
Agarose LERoche Diagnostics11685660001أو أي مورد آخر
TBE bufferAmresco0658أو أي مورد آخر
Ethidium bromideApplichemA2273،0005بروميد الإيثيديوم هو مطفرات
100 نقطة أساس سلم الحمض النوويInvitrogen15628-050أو أي سلم آخر للحمض النووي
20 ملي كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتش71393-1Lأو أي مورد آخر
فاصل الجسيمات المغناطيسية Magna-Sep   ؛Life Technologiesللاستخدام مع أنابيب 1.5 مل
Magna-Sep فاصل الجسيمات المغناطيسيةLife TechnologiesK158696للاستخدام مع ألواح 96 بئرا Amicon
Ultra-0.5 أو Ultracel-30 غشاءMilliporeUFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi SPeqLab40-1515أو نظام الرحلان الكهربائي الآخر
TProfessional 96Biometra050-551أو غيرها من Thermocycler لألواح 96 بئر
شاكر مداري KS 260 الأساسيIKA2980200أو غيرها من الأنابيب اللينة PCR الأفقية
الأفقية 0.2 ملBiozym Scientific GmbH711082أو أنابيب PCR أخرى 0.2 مل
1.5 ملEppendorf12682أو غيرها من أنابيب 1.5 مل
نظام توثيق جلPeqLabأو أي نظام توثيق هلام آخر
Nanodrop ND-1000 مقياس الطيفالضوئي Thermo ScientificND-1000
Spreadex EL1200 جل مسبقة الصبElchrom Scientific3497
جهاز الرحلان الكهربائي للهلام المغمور SEA 2000 & nbsp ؛Elchrom Scientific2001E
2100 Electrophoreser BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
K158501 أنابيب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
  2. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Linear Amplification Mediated PCRVector Genome JunctionsBiotinylated PrimersMagnetic BeadsSolid Phase AmplificationExponential AmplificationRestriction EnzymeLigation ReactionGel ElectrophoresisDeep Sequencing

Related Articles