يصف هذا البروتوكول الكشف عن qPCR للفيروس المضخم للخلايا في أنسجة الخزعة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين ، وهي سريعة وحساسة ومحددة ومفيدة لتفسير أنماط الهيماتوكسيلين والأيوزين أو التلوين المناعي الكيميائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
QPCR هو أسلوب حساس وسريع للكشف عن الحمض النووي من Cytomegaloviral في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين-الأنسجة خزعة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لا بد من تحديد الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى في الجهاز الهضمي (GI) المسالك المرضى كبت المناعة، نظرا خطر أكبر لتطوير عدوى حادة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب المختبرية للكشف عن عدوى الفيروس المضخم للخلايا، بما في ذلك الأمصال والثقافة الفيروسية، والأساليب الجزيئية. في كثير من الأحيان، وهذه الأساليب تعكس الجهازية مع CMV ولا تعرف على وجه التحديد إشراك النسيج المحلية. لذلك، كثيرا ما يتم اكتشاف العدوى CMV في الجهاز الهضمي عن طريق الأنسجة التقليدية من الأنسجة الخزعة. ظلت الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ بالتزامن مع المناعية (IHC) الدعائم الأساسية لدراسة هذه الخزعات. H & E وIHC يؤدي في بعض الأحيان في غير نمطية (ملتبسة) أنماط تلطيخ، مما يجعل من الصعب تفسير. فقد تبين أن كمية البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QPCR) لCMV يمكن أن يؤديها بنجاح على الفورمالين الثابتة، (FFPE) جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة خزعة للغايةحساسية عالية وخصوصية. الهدف من هذا البروتوكول هو لشرح كيفية أداء الاختبار QPCR للكشف عن الفيروس المضخم للخلايا في الأنسجة خزعة FFPE في إعداد مختبر السريرية. ومن المرجح أن تكون ذات فائدة كبيرة للمرضى في حالات ملتبسة لتلطيخ CMV في الخزعات GI هذا الأسلوب.
المقدمة
تفسير الفيروس المضخم للخلايا (CMV) إصابة في العينات السريرية أمر بالغ الأهمية. CMV هو عضو من فصيلة betaherpesvirinae من فيروس الهربس. مماثلة لفيروس الهربس الأخرى، CMV لديه القدرة على إقامة العدوى المستمرة أو الكامنة التي تتميز نقص تكاثر الفيروس النشط 1. قد يحدث تنشيط الفيروس اثناء اوقات التوتر أو كبت المناعة الأخرى، مما يؤدي إلى تكاثر الفيروس النشطة التي تتميز الإفراج الفيريون، والتي قد تترافق مع مظاهر المرض 2-4. في كثير من الأحيان تشمل الجهاز الهضمي (GI) أعراض المرض CMV آلام في البطن و / أو براز دموي 1.
تشخيص التهاب المعدة وال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
مع موافقة مجلس المراجعة المؤسساتي، تم إجراء بحث من قاعدة بيانات مختبر الإلكترونية لتحديد الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) كتل تمثل حالات الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى في الجهاز الهضمي (GI) الخزعات تشخيصها عن طريق التشريح المرضي (الهيماتوكسيلين و يوزين (H & E) و / أو المناعية (IHC)).
1. معالجة الأنسجة من FFPE GI خزعة الأنسجة
- جمع FFPE GI كتل الأنسجة خزعة للالفيروس المضخم للخلايا (CMV) البلمرة سلسلة من ردود الفعل الكمية (QPCR). يتم تخزين هذه الكتل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم اختبار ما مجموعه 228 كتل الأنسجة بواسطة الكمية البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QPCR)، الذي يتألف من 91 الفيروس المضخم للخلايا (CMV) حالات إيجابية على أساس علم الأنسجة والمناعية إيجابية (IHC)، 18 ملتبسة مع CMV IHC، و 79 ضوابط السلبية. كما هو موضح في الشكل 2، فإن حالات إيجابية CMV CMV وقد أظهرت شوائب نموذجية الفيروسي (A) و / أو تلطيخ IHC إيجابية (B). أن حالات ملتبسة وقد أثبتت نادرة غير الكلاسيكية التي تظهر أنماط تلطيخ، (C)،<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العديد من الأساليب المختبرية المتاحة لتشخيص الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى، بما في ذلك الأمصال والثقافة الفيروسية، المقايسات افيروس الجزيئية، وعلم الأنسجة خزعة من المواد، وكما تجلى مؤخرا، المقايسات الجزيئية، (FFPE) خزعة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين 5،6 الأنسجة. الأمصال، مرة واحدة في الدعامة الأساسية للتشخيص، ويحدد بشكل موثوق فقط والتعرض لا ترتبط بشكل جيد مع CMV العدوى الحادة 7. ثقافة الفيروسية، سواء التقليدية وأوائل مستضد قذيفة قنينة، وي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نحن نعترف ايمي توماسون للحصول على المساعدة لها مع إعداد هذه المخطوطة، وفريدريك Skarstedt وريان كريستي لما بذلوه من جهود في إعداد الأرقام.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.7 مل أنابيب الطرد الدقيق كوستار | 3620 | ||
| ملقط مسنن | خدمات المجهر الإلكتروني | 62086-1S | ملقط دقيق MF-1 |
| أجهزة طرد مركزي منضدية (ميكروفوج) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 جالون |
| إيثانول | فيشر | فيشر علمي: ET108 | 96-100٪ |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR طقم مكمل | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler جهاز طرد مركزي | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 & ل الشعيرات الدموية | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
المراجع
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
الكشف عن الحمض النووي للفيروس المضخم للخلايابطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكميأنسجة خزعة مثبتة بالفورمالين ومطمورة في البارافيناستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجينتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيتضخيم الفيروس المضخم للخلاياخزعة الجهاز الهضمياستخلاص الحمض النوويبيئة المختبر السريري
