يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

QPCR هو أسلوب حساس وسريع للكشف عن الحمض النووي من Cytomegaloviral في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين-الأنسجة خزعة

15.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51570

⸱

يوليو 9, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University Health

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول الكشف عن qPCR للفيروس المضخم للخلايا في أنسجة الخزعة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين ، وهي سريعة وحساسة ومحددة ومفيدة لتفسير أنماط الهيماتوكسيلين والأيوزين أو التلوين المناعي الكيميائي.

الملخص

لا بد من تحديد الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى في الجهاز الهضمي (GI) المسالك المرضى كبت المناعة، نظرا خطر أكبر لتطوير عدوى حادة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب المختبرية للكشف عن عدوى الفيروس المضخم للخلايا، بما في ذلك الأمصال والثقافة الفيروسية، والأساليب الجزيئية. في كثير من الأحيان، وهذه الأساليب تعكس الجهازية مع CMV ولا تعرف على وجه التحديد إشراك النسيج المحلية. لذلك، كثيرا ما يتم اكتشاف العدوى CMV في الجهاز الهضمي عن طريق الأنسجة التقليدية من الأنسجة الخزعة. ظلت الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ بالتزامن مع المناعية (IHC) الدعائم الأساسية لدراسة هذه الخزعات. H & E وIHC يؤدي في بعض الأحيان في غير نمطية (ملتبسة) أنماط تلطيخ، مما يجعل من الصعب تفسير. فقد تبين أن كمية البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QPCR) لCMV يمكن أن يؤديها بنجاح على الفورمالين الثابتة، (FFPE) جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة خزعة للغايةحساسية عالية وخصوصية. الهدف من هذا البروتوكول هو لشرح كيفية أداء الاختبار QPCR للكشف عن الفيروس المضخم للخلايا في الأنسجة خزعة FFPE في إعداد مختبر السريرية. ومن المرجح أن تكون ذات فائدة كبيرة للمرضى في حالات ملتبسة لتلطيخ CMV في الخزعات GI هذا الأسلوب.

المقدمة

تفسير الفيروس المضخم للخلايا (CMV) إصابة في العينات السريرية أمر بالغ الأهمية. CMV هو عضو من فصيلة betaherpesvirinae من فيروس الهربس. مماثلة لفيروس الهربس الأخرى، CMV لديه القدرة على إقامة العدوى المستمرة أو الكامنة التي تتميز نقص تكاثر الفيروس النشط 1. قد يحدث تنشيط الفيروس اثناء اوقات التوتر أو كبت المناعة الأخرى، مما يؤدي إلى تكاثر الفيروس النشطة التي تتميز الإفراج الفيريون، والتي قد تترافق مع مظاهر المرض 2-4. في كثير من الأحيان تشمل الجهاز الهضمي (GI) أعراض المرض CMV آلام في البطن و / أو براز دموي 1.

تشخيص التهاب المعدة والأمعاء CMV بواسطة الأنسجة يستخدم الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) لتحديد CMV الادراج الفيروسية. في الحالات التي يتم فيها عالية بعد لم يلاحظ أي شوائب واضحة الاشتباه السريري، وكثيرا ما يستخدم المناعية (IHC) باعتبارها طريقة الاختبار مساعد. ومع ذلك، IHCويمكن أيضا أن يعوقها غير الكلاسيكية التي تظهر أنماط تلطيخ الخلوية نادرة (ملتبسة)، مما يجعل من الصعب تفسير (الشكل 2) 5. وقد سعى إلى استخدام الحمض النووي المستخرج من الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الأنسجة خزعة GI والكمية البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QPCR) للكشف عن الفيروس المضخم للخلايا في الخزعات GI. وقد تبين هذه التقنية لتكون ذات قيمة في الكشف عن الفيروس المضخم للخلايا في الخزعات GI، ومفيد خاصة في حالات ملتبسة تلطيخ IHC 5،6. أيضا، كما ثبت QPCR أنها تتطابق جيدا مع إضافية السريرية CMV اختبار البيانات عندما كان متوفرا 6. استخدام QPCR في الكشف عن الفيروس المضخم للخلايا قد تؤدي إلى التشخيص المبكر والعلاج في الحالات التي الاشتباه السريري لCMV عالية، ولكن H & E وCMV IHC سلبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

مع موافقة مجلس المراجعة المؤسساتي، تم إجراء بحث من قاعدة بيانات مختبر الإلكترونية لتحديد الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) كتل تمثل حالات الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى في الجهاز الهضمي (GI) الخزعات تشخيصها عن طريق التشريح المرضي (الهيماتوكسيلين و يوزين (H & E) و / أو المناعية (IHC)).

1. معالجة الأنسجة من FFPE GI خزعة الأنسجة

  1. جمع FFPE GI كتل الأنسجة خزعة للالفيروس المضخم للخلايا (CMV) البلمرة سلسلة من ردود الفعل الكمية (QPCR). يتم تخزين هذه الكتل في درجة حرارة الغرفة.
  2. أنابيب قبل التسمية 1.7 مل microfuge مع رقم هوية فريدة من نوعها في كتلة.
  3. قفل عقارب مشراح.
  4. مقعد كتلة الأنسجة في المشبك كاسيت.
  5. باستخدام، شفرة جديدة غير المستخدمة، والمواءمة بين كتلة إلى زاوية السكين على مشراح.
  6. ضبط مشراح لخفض 10 ميكرون أبواب سميكة.
  7. فتح الالبريد عقارب والتقدم نحو كتلة النصل.
  8. قطع 5 أقسام للكتلة في 10 ميكرومتر فترات سميكة، مما يتيح لكل قطع لتتوغل في التمرير من الأنسجة. تأكد من أن كل التمرير يحتوي على التمثيل الكافي للأنسجة الخزعة المطلوبة.
  9. قفل عقارب مشراح.
  10. مع ملقط، ضع كل 5 لفائف من الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي وصفت مسبقا، والحرص على التعامل مع التمرير فقط من البارافين من أجل تقليل احتمالات التلوث المتبادل. المفاجئة الغطاء على أنبوب ووضعه مرة أخرى على الرف.
  11. إزالة كتلة الأنسجة من مشراح.
  12. إزالة والتخلص من النصل.
  13. تطهير الأسطح أو أي الصكوك التي قد تأتي في اتصال مع الأنسجة السابقة.
  14. وضع، شفرة غير مستخدمة جديدة في حامل السكين.
  15. كرر الخطوات 1،4-1،14 لكل كتلة إضافية لتتم معالجتها. قد يتم تخزين أنابيب microfuge التي تحتوي على مخطوطات الأنسجة في درجة حرارة الغرفة حتى تيم(ه) من استخراج الحمض النووي.

2. استخراج الحمض النووي من مخطوطات من FFPE GI خزعة الأنسجة

ملاحظة: يتم تكييف هذا البروتوكول من إدراج حزمة من الأنسجة FFPE الحمض النووي عدة استخراج (تنبيه: الرجوع إلى سلامة المواد ورقة البيانات (MSDS)).

  1. إضافة 1 مل الزيلين (تنبيه: ارجع إلى MSDS) لكل عينة microfuge أنبوب. إغلاق الغطاء ودوامة بقوة لمدة 10 ثانية.
  2. المضي قدما في استخراج الحمض النووي المحددة وعلى وجه التحديد في الناتج إدراج الشركة المصنعة مع التعديلات التالية.
  3. أولا إضافة 6 ميكرولتر من الرقابة الداخلية (IC) إلى كل microfuge أنبوب.
    1. بعد ATL / K بروتين تحلل الحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، احتضان عند 99 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، بدلا من 90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. خلال الخطوة شطف الحمض النووي النهائي، فتح بعناية غطاء العمود تنقية الحمض النووي وتطبيق 50 ميكرولتر الدناز المقطر / خالية من ريبونوكلياز المياه في وسط الغشاء، بدلا من العازلهأكل ص.
      ملاحظة: يرجى الرجوع إلى إدراج حزمة لتخزين وإعداد الكواشف المناسبة. يجب أن يكون استخراج الحمض النووي من جميع مخطوطات FFPE 5. تنفيذ كافة الخطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية).

3. QPCR لCMV

  1. البلمرة المتسلسل (PCR) الداخلي
    1. إنشاء ورقة عمل Excel PCR لفحص المدى CMV. هذه ورقة عمل Excel بحساب المبلغ الإجمالي لكل كاشف اللازمة لتعويض مزيج الرئيسي مع المغنيسيوم. تتكاثر قيمة كل حاجة كاشف لكل عينة (المذكورة أدناه) أضعاف عدد العينات والضوابط زائد واحد (للتعويض عن الخسارة الناجمة عن pipetting ل).
      1. وتشمل الكواشف التالية في كل تفاعل PCR في المبلغ المشار إليه:
        كاشف0؛ المبلغ لكل عينة
        CMV LC مزيج الرئيسي قارورة 12.5 ميكرولتر
        الحل ملغ الأصفر قارورة 2.5 ميكرولتر
        اجمالى حجم 15.0 ميكرولتر
    2. تدرج في كل فحص، تشغيل المياه أو أي سيطرة الهدف (NTC)، سيطرة سلبية، تحكم إيجابية منخفضة، تحكم إيجابية عالية، وإما QS3 أو QS4، وجميع عينات المرضى. يجب تعيين الشعيرات الدموية حتى في هذا النظام.
    3. الحصول على التبريد محددة كتلة للصك PCR الوقت الحقيقي التي تم تخزينها في 4 درجات مئوية. وضع الأنابيب الشعرية المناسبة في كتلة التبريد. لا تلمس سطح الأنابيب الشعرية. دائما استخدام قفازات عند التعامل مع الشعيرات الدموية.
    4. إعداد كافة تفاعلات البلمرة في غطاء نظيفة غير ملوثة مع التضخيم المنتجنهاية الخبر.
      1. إزالة العدد الصحيح من قارورة الرئيسية من عدة PCR لاختبار جميع العينات المريض، بالإضافة إلى 5 الضوابط. السماح للقارورة الرئيسي، الحل المغنيسيوم، وPCR الصف ذوبان المياه في كتلة التبريد. كل قارورة تحتوي على ما يكفي من الكواشف الماجستير لمدة 12 الاختبارات.
      2. دوامة بلطف قوارير رئيسية وسريعة تدور لهم في أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة.
      3. الجمع بين محتويات كل قنينة الماجستير في قارورة واحدة، ودوامة بلطف مرة أخرى.
      4. الجمع بين مزيج الرئيسي والحل المغنيسيوم في المبالغ المبينة في ورقة العمل PCR في واحد عقيم microfuge أنبوب.
      5. المزيج بلطف وقسامة 15 ميكرولتر من مزيج الرئيسي مع المغنيسيوم في كل أنبوب شعري، ما عدا الشعرية في موقف 5 والذي يعتبر معيار لتحديد الكميات (QS).
    5. نقل كتلة التبريد التي تحتوي على الأنابيب الشعرية ومزيج الرئيسي مع المغنيسيوم من غطاء محرك السيارة نظيفة لغطاء المعالجة.
    6. إضافة 2 ميكرولتر من الرقابة الداخلية (IC) إلى 30 ميكرولتر المتبقية من الماجستيرتخلط مع المغنيسيوم. المزيج بلطف وقسامة 15 ميكرولتر في الشعيرات الدموية في موقف 5 (موقف لQS).
    7. ماصة 10 ميكرولتر من المياه، والسيطرة على الحمض النووي، أو الحمض النووي العينة في أنبوب شعري المناسبة. تتويج الأنابيب الشعرية باستخدام أداة متوجا.
    8. تأخذ التبريد كتلة / عينات لفي الوقت الحقيقي PCR الصك.
  2. برمجة الوقت الحقيقي PCR الصك (انظر الجدول 1)
  3. التضخيم والكشف التي تجرى على الوقت الحقيقي PCR الصك
    1. تسجيل الدخول إلى الكمبيوتر
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق على أيقونة الصك وتسجيل الدخول إلى البرنامج.
    3. بدوره على الوقت الحقيقي PCR الصك
    4. انقر على "CMV / EBV" من الشاشة الأمامية.
    5. اتبع المطالبات من المعالج الماكرو.
    6. حدد خانة لتشغيل الاختبار الذاتي عند المطالبة من قبل البرنامج. يجب إجراء اختبار ذاتي مرة واحدة كل يوم الصك قيد الاستخدام.
    7. اسم التشغيل.
    8. ضبط عدد العينة تقع في LEF العليار ركن من أركان الصفحة لمجموع الضوابط وشملت مرضى في المدى وإدخال رقم التعريف من كل عينة مريض.
    9. انقر على "عبس كوانت" علامة التبويب.
    10. تحت عنوان "نوع العينة"، تعيين نوع العينة المناسبة لهذا المعيار.
    11. اكتب في تركيزات المتوقع لمعيار الكميات (QS).
    12. إزالة الأنابيب الشعرية من كتلة برودة ووضعها في موقف المقابلة في دائري (تبريد كتلة عينة رقم 1 يجب أن توضع في موقف رقم 1 على دائري، الخ).
    13. وضع دائري في أجهزة الطرد المركزي ثم اضغط بداية الصك.
    14. فتح الطرد المركزي وإزالة دائري.
    15. وضع دائري في الوقت الحقيقي PCR الصك. إغلاق الغطاء.
    16. اضغط على "بدء تشغيل".
    17. فإن الوقت الحقيقي PCR أداة التحقق من كل موقف لعينة. لا نهرب من الصك حتى يتم الانتهاء من هذا الاختيار، ESPEcially إذا كان واحد من الشعيرات الدموية ليست في دائري. وسوف نلاحظ هذا الصك وأسأل ما إذا كان على المدى هو أن يستمر. الإجابة نعم قبل ان يغادر.
    18. مرة واحدة على المدى كاملة، أغلق التقرير التي تم إنشاؤها.
    19. انقر على "المطلق الكميات".
    20. انقر على السهم بجانب اللون التعويضات.
    21. انقر على زر "اختر لون تعويضات" من مربع القائمة المنسدلة.
    22. اختيار ملف تعويض اللون الأكثر الحالية لتطبيق التشغيل.
    23. انقر فوق موافق عندما ينبثق مربع تصل.
    24. انقر على السهم من قبل ستاندرد المنحنى.
    25. حدد "استخدام الخارجي" من القائمة المنسدلة.
    26. حدد الملف منحنى معيار خارجي معظم الحالية، ثم انقر فوق موافق.
    27. ننظر في كل منحنى ضمن القائمة المطلقة الكمي للتأكد من أن منحنيات موجودة وليس خط مستو، إذا تم تعيين التركيز. ويتم تحليل الكمي المطلق ل705/Back 530 تلقائيا.
  4. تشوالسيطرة على ality
    1. توليد منحنى القياسية الجديدة كلما تلقيت الكثير الجديدة عدد من الكواشف، أو كل ستة أشهر، أيهما أكثر تواترا.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من كل مستوى لمزيج الرئيسي مع المغنيسيوم. النظر في المعايير المتضمنة في مجموعة الحمض النووي المستخرج كما في السابق.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من الرقابة الداخلية لكل معيار على مزيج الرئيسي مع المغنيسيوم المستخدمة في توليد منحنى القياسية من أجل ضمان الكميات دقيقة. لا تضيف IC إلى مزيج الرئيسي مع المغنيسيوم للا قالب التحكم (NTC).
    4. إعداد NTC وثلاثة مكررات من الكميات معايير QS 4، 3، 2، 1، وتخفيف 1:10 من QS4 على المدى لتوليد منحنى القياسية، يبلغ مجموعها 16 نقطة في البيانات.
    5. حدد "تكرار لل" في القائمة المنسدلة للمعايير المتكررة
    6. اختيار قناة 530/back لا شيء وبدوره على تعويض اللون عند تحليل المدى،
    7. تحت عنوان "المنحنى القياسي (في تشغيل)"، حدد "حفظ ك السابقينالخارجيون "واسم المنحنى. أدخل تعليق "كما هو مطبق منحنى القياسية" عند حفظ.
    8. رسم بياني للنتائج. يجب ≥ معامل الخطي الناتجة 0.81.
    9. لأشواط يوميا، وتشمل نسخة واحدة من QS3 أو QS4 كعنصر تحكم في التشغيل. يجوز استيرادها منحنى القياسية الخارجية الحالية في المدى خلال مرحلة التحليل.
    10. ضوابط تشغيل: أي سيطرة الحمض النووي، ومراقبة سلبية، وانخفاض، والضوابط الإيجابية العالية. يتم تحديد المتوقع الحمل الفيروسي وتعديلها لكل بائع والكثير العدد.
    11. إضافة IC لكل عينة والسيطرة خلال استخراج الحمض النووي.
    12. إذا كان أي من الضوابط تقع خارج النطاق، وتسجيل نتائج غير مقبولة وتشير مقايسة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
  5. تردد الضوابط
    1. تدرج في كل شوط: أ NTC، سلبية، وانخفاض إيجابية، وارتفاع إيجابي، ومعيار السيطرة.

ملاحظة: حدود مقبولة لعناصر. لا ينبغي أن نلاحظ قممد لأي قالب (NTC) والضوابط السلبية. يجب أن تكون موجودة في قمم القناة 530 ويتم تحديد المتوقع الأحمال الفيروسية وتعديلها لكل بائع والكثير عدد لعناصر إيجابية المنخفضة والعالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم اختبار ما مجموعه 228 كتل الأنسجة بواسطة الكمية البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QPCR)، الذي يتألف من 91 الفيروس المضخم للخلايا (CMV) حالات إيجابية على أساس علم الأنسجة والمناعية إيجابية (IHC)، 18 ملتبسة مع CMV IHC، و 79 ضوابط السلبية. كما هو موضح في الشكل 2، فإن حالات إيجابية CMV CMV وقد أظهرت شوائب نموذجية الفيروسي (A) و / أو تلطيخ IHC إيجابية (B). أن حالات ملتبسة وقد أثبتت نادرة غير الكلاسيكية التي تظهر أنماط تلطيخ، (C)،<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

العديد من الأساليب المختبرية المتاحة لتشخيص الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى، بما في ذلك الأمصال والثقافة الفيروسية، المقايسات افيروس الجزيئية، وعلم الأنسجة خزعة من المواد، وكما تجلى مؤخرا، المقايسات الجزيئية، (FFPE) خزعة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين 5،6 الأنسجة. الأمصال، مرة واحدة في الدعامة الأساسية للتشخيص، ويحدد بشكل موثوق فقط والتعرض لا ترتبط بشكل جيد مع CMV العدوى الحادة 7. ثقافة الفيروسية، سواء التقليدية وأوائل مستضد قذيفة قنينة، وي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نحن نعترف ايمي توماسون للحصول على المساعدة لها مع إعداد هذه المخطوطة، وفريدريك Skarstedt وريان كريستي لما بذلوه من جهود في إعداد الأرقام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.7 مل أنابيب الطرد الدقيق كوستار3620
ملقط مسننخدمات المجهر الإلكتروني62086-1Sملقط دقيق MF-1
أجهزة طرد مركزي منضدية (ميكروفوج)Eppendorf5424
XyleneFisherFisher Scientific: X3P1 جالون
إيثانولفيشرفيشر علمي: ET10896-100٪
MicrotomeLeicaRM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue KitQiagen56404
artus CMV LightCycler PCR ASRQiagen4500025
CMV LC PCR طقم مكملQiagen1031873
LightCycler جهاز طرد مركزيRoche75005087
LightCycler Cooling BlockRoche10800058001
LightCycler Capping ToolRoche3357317
Color CompensationRoche2158850
LightCycler 20 & ل الشعيرات الدمويةRoche1 909 339
BladesSakuraFisher Scientific: 4689Accu-Edge low profile
Kit

المراجع

  1. Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
  2. Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
  3. Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
  4. Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
  5. McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
  6. Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
  7. Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
  8. Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
  9. Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
  10. Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
  11. Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

QPCR هو أسلوب حساس وسريع للكشف عن الحمض النووي من Cytomegaloviral في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين-الأنسجة خزعة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.