طريقة الحصول على خلايا سرطان المبيض الابتدائية من العينات الصلبة

على الرغم من الإصابة به منخفضة نسبيا، وسرطان المبيض هو الأكثر دموية من الأمراض النسائية والسبب الرئيسي الخامس للوفيات السرطان بين النساء ^1،2. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود الأدوات والنماذج التي يمكن الاعتماد عليها ألخص بأمانة بدء وتطور المرض ³ هذا. وكان معظم معرفتنا اليوم عن سرطان المبيض ممكن من خلال استخدام الخلايا خلد المبيض الظهاري السطح (IOSEs)، وخطوط الخلايا السرطانية في المبيض وخلايا سرطان المبيض الأساسي تعافى من الاستسقاء السوائل ^4-7. للأسف، واستخدامها لديها العديد من القيود بما في ذلك عدد من التغيرات الجينية والمظهرية المرتبطة عملية تخليد أو في الممرات المختبر، وعدم تجانس السكان الناجمة عن إعداد سائل الاستسقاء.

وبالتالي، خلايا سرطان المبيض الأولية المستمدة من العينات الصلبة القابلة للتحديد ومحددة من سرطان المبيض تمثل UNIQUأداة ه لدراسة تطور سرطان المبيض.

الصعوبات الرئيسية التي تشارك في الحصول على هذه الخلايا الخبيثة هي نتيجة لفرط نمو الخلايا اللحمية أو الخلايا الليفية جنبا إلى جنب مع فقدان الجدوى وعدم وجود سابقة لأوانها القدرة التكاثري في ثقافة هذه الخلايا EOC. توجد حاليا العديد من الطرق لخلق وحيدة الخلية تعليق من الأورام الصلبة، من خلال وسائل ميكانيكية أو تفارق الأنزيمية، ولكن تقنيات معينة تنتج كمية أكبر من نتائج المفضل ^8. هنا، وتبين لنا أن الهضم الأنزيمي مع dispase الثاني النتائج في الانتعاش الفعال، والخلايا الليفية EOC خالية قابلة للحياة. ثقافات EOC حتى الحصول هي عرضة للتلاعب الجيني ومفيدة أيضا في اختبارات فحص المخدرات، مشيرا إلى أن هذه الثقافات EOC هي مناسبة للعديد من التطبيقات المصب.

بيان الأخلاق
وتم الحصول على عينات الصلبة من سرطان المبيض من جامعة مينيسوتا مرفق الأنسجة المشتريات (TPF) عقب اجتماع للجنة مجلس المراجعة المؤسساتي: المجلس موضوع الإنسان (IRB) موافقة.

1. إعداد كاشف

1. إعداد كاملة DMEM المتوسطة من خلال استكمال DMEM مع FBS 10٪، و 100 وحدات البنسلين الستربتوميسين. تخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
2. قسامة dispase الثاني في مجلدات منفصلة من 5-10 مل لتجنب تجميد متعددة يذوب وتخزينها في -20 درجة مئوية في الفريزر خالية من nonfrost.

2. الأنسجة كوكتيل

1. جمع العينات الصلبة من سرطان المبيض (~ 5 ز في الحجم) في وقت الجراحة من المجالات المحددة ظاهريا كما السرطان من قبل الطبيب الشرعي. يتم إلغاء تحديد العينات السريرية ومسجلة وفقا لبروتوكولات المؤسسية.
2. وضع العينات في العقيمة، والشوريغطاء REW، والبولي بروبيلين حاوية العينات مليئة 30 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. نقل العينات من مختبر علم الأمراض الجراحية إلى مختبر أبحاث للتجهيز على الجليد، وخلال 30 دقيقة من جمع العينات (الشكل 1).

3. معالجة الأنسجة

1. العمل تحت ظروف معقمة، ونقل العينات على طبق بيتري (60 ملم × 60 ملم) تحتوي على 10 مل من الطازجة، PBS الجليد الباردة وباستخدام شفرة حلاقة معقمة، وقطع الى مزيد من أصغر قطعة ممكنة (2 ملم أو أقل) ( أرقام 2A و 2 ب).
2. نقل الأنسجة المفروم إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 10 مل من prewarmed (37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) dispase الثاني (2.4 U / مل) في DMEM واحتضان عند 5٪ CO ₂ و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لضمان الهضم الأمثل للعينات، تستنهض الهمم يدويا الطين خلية كل 5 دقائق.
3. بعد 30 دقيقة الحضانة، ونقل (باستخدام10 مل ماصة المصلية) الطين خلية على مصفاة الخلية (70 ميكرومتر شبكة) وضعت على رأس أنبوب 50 مل المخروطية وتطبيق ضغط لطيف على شبكة باستخدام المكبس المحاقن. تجاهل أي نوع من الأنسجة undissociated (المتبقية على الجزء العلوي من شبكة) وجمع تعليق خلية تم الحصول عليها في 50 مل العقيمة أنبوب مخروطي. أجهزة الطرد المركزي في 320 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية (الشكل 3).
4. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS.
5. احتضان تعليق خلية في طبق بتري في 5٪ CO ₂ و 37 درجة مئوية (الشكل 4).
6. تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة من الطلاء الأولي. وهذا يسمح لإزالة الحطام الخلوي والغالبية العظمى من كريات الدم الحمراء موجودة في الثقافة.
7. تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام لمدة أسبوعين التالية، وبعد ذلك ثقافات EOC الأولية مستعدون للتطبيقات المصب.

يتم جمع العينات السريرية جديدة من سرطان المبيض بعد الجراحة (الشكل 1) ومقطعة لأجزاء صغيرة (أرقام 2A و 2B) تشكل الطين الخلية. وهذا يسمح للتعرض الأمثل للعينات لعلاج الأنزيمية. تتعرض الخلية إلى الطين الهضم الأنزيمي والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة يصبح الطين غائم بشكل متزايد (وخصوصا بعد كل التحريض)، وهذا هو علامة على تفصيل الأنسجة. في نهاية فترة حضانة، يتم نقل الطين على مصفاة الخلية لفصل الخلايا EOC من أي نوع من الأنسجة undissociated (الشكل 3). يتم وضع تعليق خلية تعافى بنسبة 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية (F igure 4). في هذه المرحلة مورفولوجية الثقافات الخلية يكشف وجود كل من الخلايا EOC كما تعليق خلية واحدة وكتل صغيرة. الثقافة في هذه المرحلة أيضا يكشف حاضرا م من الكريات الحمراء والحطام صغيرة كما هو مبين في الشكل 5. في حين أن الأهم EOC سوف ببطء (على مدى فترة من 1-3 أيام) التمسك البلاستيك وكرات الدم الحمراء والحطام الخلية سوف لا وأنها في نهاية المطاف وتدريجيا "تختفي من الثقافة". بعد يوم 3 من الطلاء الأولي، والثقافات EOC تظهر زيادة تمسكا مجموعات الخلايا EOC وأقل تدريجيا كرات الدم الحمراء والحطام كما هو مبين في الشكل (6). بعد يوم 6-7، وخلايا EOC تشكيل الأشكال مثل دوامة (السهم) ويبدأ في الانتشار إلى البلاستيك لتشكيل مجاميع متعددة الخلايا أكبر مما يؤدي إلى مورفولوجيا الحصوه نموذجية من الخلايا EOC كما هو مبين في الشكل 7. بعد يوم 14، وعادة ما تصبح خلايا متكدسة EOC (الشكل 8)، ونحن الآن على استعداد لاختبار المصب والتطبيقات.

pload/51581/51581fig1.jpg "/>
يتم جمع الرقم 1. جمع العينات السريرية. العينات الصلبة من سرطان المبيض في وقت الجراحة، ووضعها في العقيمة، المسمار غطاء، والحاويات البولي بروبلين عينة مليئة 30 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.

الشكل 2. تجهيز العينات السريرية. أ) العينة الصلبة نقلها إلى طبق بتري تحتوي على 10 مل من الطازجة والثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X. ب) خفض مزيد من العينات السريرية إلى قطع حوالي 2 ملم في الحجم.

الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما">
الرقم 3. فصل الخلايا من الأنسجة EOC undissociated. بعد الهضم الأنزيمية، يتم نقل العينات السريرية على مصفاة الخلية ويتم تطبيق ضغط لطيف على العينات السريرية هضمها باستخدام المكبس المحاقن. هذا يسمح للمفرزة الميكانيكية EOC من الأنسجة الضامة والخلايا EOC الانتعاش.

الشكل 4. تصفيح الناتجة EOC خلايا تعليق. بعد إزالة أي أنسجة undissociated، يتم طرد تعليق خلية ومعلق في 10 مل من DMEM تابعaining 10٪ FBS وحضنت في طبق بتري في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.

الرقم 5. مورفولوجيا الثقافات الخلية EOC مباشرة بعد تعليق المعالجة. الخليوي مباشرة بعد الطلاء يظهر EOC بمثابة تعليق خلية واحدة وكتل (سواء التي أشار إليها السهام)، الكريات الحمراء والحطام الخلية لا تزال كثيرة في هذه المرحلة. التكبير الأصلي، 20X.

الرقم 6. مورفولوجيا الثقافات الخلية EOC في يوم 3 بعد الطلاء ثقافة الخلية. EOC في يوم 3 بعد يظهر الطلاء شبه ملتصقة EOC جكتلة الذراع (الذي يشير إليه السهم) وأقل تلوث كرات الدم الحمراء. التكبير الأصلي، 20X.

الرقم 7. أنشئت الثقافات EOC بعد أسبوع من الطلاء الثقافة. خلية EOC أسبوع واحد بعد الطلاء الأولي يظهر مجموعات مثل دوامة من الخلايا تنتشر على البلاستيك زراعة الأنسجة. التكبير الأصلي، 20X.

الرقم 8. الثقافات متموجة EOC. مندمج أحادي الطبقة من الخلايا EOC تبين نموذجية مورفولوجيا الحصوه الظهارية بعد 14 يوما في الثقافة.

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.