مقالة منهجية

طريقة الحصول على خلايا سرطان المبيض الابتدائية من العينات الصلبة

DOI:

10.3791/51581

⸱

فبراير 4, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Heath, University of Minnesota, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Maricopa Medical Center and St Josephs Hospital and Medical Center, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة طريقة مفصلة لعزل وتوصيف خلايا سرطان المبيض الأولي من العينات السريرية الصلبة. تخضع سرطان المبيض العينات السريرية للهضم الأنزيمية للحصول قابلة للحياة، وخالية من الخلايا الليفية سرطان المبيض الظهاري (EOC) الخلايا مناسبة تماما للتطبيقات المصب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك حاجة ماسة إلى أدوات موثوقة للتحقيق في المبيض بدء السرطان والتقدم. في حين أن استخدام خطوط الخلايا السرطانية في المبيض لا يزال يشكل أداة قيمة لفهم سرطان المبيض، واستخدامها يملك الكثير من القيود. وتشمل هذه عدم وجود التجانس وعدد كبير من التعديلات الجينية المرتبطة ممتدة الركض في المختبر. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسمح لسرعة إنشاء خلايا سرطان المبيض الأساسي تشكيل العينات السريرية الصلبة التي تم جمعها في وقت الجراحة. يتكون أسلوب إخضاع العينات السريرية للهضم الأنزيمية لمدة 30 دقيقة. ولا يسمح للتعليق خلية معزولة للنمو ويمكن استخدامها لتطبيق المصب بما في ذلك فحص المخدرات. الاستفادة من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض الأولية على خطوط الخلايا السرطانية في المبيض أنشأت هي أنها ممثل العينات السريرية محددة الأصلي يتم استخلاصها من ويمكن الحصول عليها من مواقع مختلفة سواء الوجاهةسرطان المبيض راي أو النقيلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من الإصابة به منخفضة نسبيا، وسرطان المبيض هو الأكثر دموية من الأمراض النسائية والسبب الرئيسي الخامس للوفيات السرطان بين النساء 1،2. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود الأدوات والنماذج التي يمكن الاعتماد عليها ألخص بأمانة بدء وتطور المرض 3 هذا. وكان معظم معرفتنا اليوم عن سرطان المبيض ممكن من خلال استخدام الخلايا خلد المبيض الظهاري السطح (IOSEs)، وخطوط الخلايا السرطانية في المبيض وخلايا سرطان المبيض الأساسي تعافى من الاستسقاء السوائل 4-7. للأسف، واستخدامها لديها العديد من القيود بما في ذلك عدد من التغيرات الجينية والمظهرية المرتبطة عملية تخليد أو في الممرات المختبر، وعدم تجانس السكان الناجمة عن إعداد سائل الاستسقاء.

وبالتالي، خلايا سرطان المبيض الأولية المستمدة من العينات الصلبة القابلة للتحديد ومحددة من سرطان المبيض تمثل UNIQUأداة ه لدراسة تطور سرطان المبيض.

الصعوبات الرئيسية التي تشارك في الحصول على هذه الخلايا الخبيثة هي نتيجة لفرط نمو الخلايا اللحمية أو الخلايا الليفية جنبا إلى جنب مع فقدان الجدوى وعدم وجود سابقة لأوانها القدرة التكاثري في ثقافة هذه الخلايا EOC. توجد حاليا العديد من الطرق لخلق وحيدة الخلية تعليق من الأورام الصلبة، من خلال وسائل ميكانيكية أو تفارق الأنزيمية، ولكن تقنيات معينة تنتج كمية أكبر من نتائج المفضل 8. هنا، وتبين لنا أن الهضم الأنزيمي مع dispase الثاني النتائج في الانتعاش الفعال، والخلايا الليفية EOC خالية قابلة للحياة. ثقافات EOC حتى الحصول هي عرضة للتلاعب الجيني ومفيدة أيضا في اختبارات فحص المخدرات، مشيرا إلى أن هذه الثقافات EOC هي مناسبة للعديد من التطبيقات المصب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق
وتم الحصول على عينات الصلبة من سرطان المبيض من جامعة مينيسوتا مرفق الأنسجة المشتريات (TPF) عقب اجتماع للجنة مجلس المراجعة المؤسساتي: المجلس موضوع الإنسان (IRB) موافقة.

1. إعداد كاشف

  1. إعداد كاملة DMEM المتوسطة من خلال استكمال DMEM مع FBS 10٪، و 100 وحدات البنسلين الستربتوميسين. تخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
  2. قسامة dispase الثاني في مجلدات منفصلة من 5-10 مل لتجنب تجميد متعددة يذوب وتخزينها في -20 درجة مئوية في الفريزر خالية من nonfrost.

2. الأنسجة كوكتيل

  1. جمع العينات الصلبة من سرطان المبيض (~ 5 ز في الحجم) في وقت الجراحة من المجالات المحددة ظاهريا كما السرطان من قبل الطبيب الشرعي. يتم إلغاء تحديد العينات السريرية ومسجلة وفقا لبروتوكولات المؤسسية.
  2. وضع العينات في العقيمة، والشوريغطاء REW، والبولي بروبيلين حاوية العينات مليئة 30 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. نقل العينات من مختبر علم الأمراض الجراحية إلى مختبر أبحاث للتجهيز على الجليد، وخلال 30 دقيقة من جمع العينات (الشكل 1).

3. معالجة الأنسجة

  1. العمل تحت ظروف معقمة، ونقل العينات على طبق بيتري (60 ملم × 60 ملم) تحتوي على 10 مل من الطازجة، PBS الجليد الباردة وباستخدام شفرة حلاقة معقمة، وقطع الى مزيد من أصغر قطعة ممكنة (2 ملم أو أقل) ( أرقام 2A و 2 ب).
  2. نقل الأنسجة المفروم إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 10 مل من prewarmed (37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) dispase الثاني (2.4 U / مل) في DMEM واحتضان عند 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لضمان الهضم الأمثل للعينات، تستنهض الهمم يدويا الطين خلية كل 5 دقائق.
  3. بعد 30 دقيقة الحضانة، ونقل (باستخدام10 مل ماصة المصلية) الطين خلية على مصفاة الخلية (70 ميكرومتر شبكة) وضعت على رأس أنبوب 50 مل المخروطية وتطبيق ضغط لطيف على شبكة باستخدام المكبس المحاقن. تجاهل أي نوع من الأنسجة undissociated (المتبقية على الجزء العلوي من شبكة) وجمع تعليق خلية تم الحصول عليها في 50 مل العقيمة أنبوب مخروطي. أجهزة الطرد المركزي في 320 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية (الشكل 3).
  4. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS.
  5. احتضان تعليق خلية في طبق بتري في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية (الشكل 4).
  6. تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة من الطلاء الأولي. وهذا يسمح لإزالة الحطام الخلوي والغالبية العظمى من كريات الدم الحمراء موجودة في الثقافة.
  7. تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام لمدة أسبوعين التالية، وبعد ذلك ثقافات EOC الأولية مستعدون للتطبيقات المصب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم جمع العينات السريرية جديدة من سرطان المبيض بعد الجراحة (الشكل 1) ومقطعة لأجزاء صغيرة (أرقام 2A و 2B) تشكل الطين الخلية. وهذا يسمح للتعرض الأمثل للعينات لعلاج الأنزيمية. تتعرض الخلية إلى الطين الهضم الأنزيمي والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة يصبح الطين غائم بشكل متزايد (وخصوصا بعد كل التحريض)، وهذا هو علامة على تفصيل الأنسجة. في نهاية فترة حضانة، يتم نقل الطين على مصفاة الخلية لفصل الخلايا EOC من أي نو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم أفضل لمسببات سرطان المبيض والتنمية أمر حاسم لتحسين نتائج النساء المتضررات من هذا المرض المدمر. في هذا السياق، واستخدام المنشأة و"المتاحة تجاريا" لقد كان المبيض خط الخلايا السرطانية بلا شك مفيدة بشكل هائل. ومع ذلك، واليوم نحن نعرف أن خطوط الخلايا السرطانية ليست ممثلة للورم الإنسان التي نشأت من في العديد من الجوانب بما في ذلك عدم وجود التجانس 9،10.

هنا، ونحن التقرير طريقة سريعة وموثوق بها ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر موظفي مرفق الأنسجة المشتريات التابعة لجامعة مينيسوتا للحصول على المساعدة في جمع عينات الأنسجة المريضة. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث سرطان المبيض وزارة الدفاع (OCRP) OC093424 لMB، من قبل راندي آلة الحلاقة لأبحاث السرطان وصندوق الجماعة لMB، من خلال مينيسوتا سرطان المبيض التحالف لMB والصندوق أمراض النساء الأورام الإدارات لMB. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x PBS ، معقمة   ؛Invitrogen14190-144
غطاء لولبي ، حاوية عينة من مادة البولي بروبلين ، معقمةThermo Scientific02 1090
DMEM متوسطة ، معقمة & nbsp ؛Invitrogen11995-065
مصل بقري للجنين ، معقمThermo Scientific HycloneSH30396.03
100x Penicillin-Streptomycin ، سائلInvitrogen15140-122
Dispase II ، معقمRoche04942 078 001
ملقط صغير رفيع الرأس وشفرة مشرط ،فيشر العلميالمعقم: 08-953E ، الشفرات: 08-927-5D
مقص تشريح صغير ، معقمفيشر ساينتفيك08-945
15 مل أنابيب مخروطية مغطاة ،Falconمعقم 352097
50 مل أنابيب مغطاة مخروطية ،Falconمعقمة 352027
10 مل ماصة مصلية ، معقمة & nbsp ؛Corning13-678-11E
6 مل مكبس حقنة معقم   ؛تايكو للرعاية الصحية8881516911
فلتر نايلون (70 مو ؛ م) مصفاة خلية ، معقمةBD Falcon352350
5 سم طبق بتري ، معقمة   ؛كورنينج430166
صحن بتري 10 سم ، معقم   ؛كورنينج430167
ملقط BD BD

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
  2. Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
  3. Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
  4. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  5. Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
  6. Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
  7. Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
  8. Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
  9. Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
  10. Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة