يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

EPR رصدت الأكسدة والاختزال المعايرة من العوامل المساعدة لل

12.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51611

⸱

نوفمبر 26, 2014

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام معايرة الأكسدة والاختزال المراقبة بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR) لتحديد العوامل المساعدة المختلفة ل Saccharomyces cerevisiae Nar1. توفر معايرة الأكسدة والاختزال طريقة قوية للغاية للحصول على إمكانات نقطة المنتصف لعوامل مساعدة نشطة مختلفة للأكسدة والاختزال في الإنزيمات والبروتينات.

الملخص

مراقبة الكترون ممغطس الرنين (EPR) معايرات الأكسدة والاختزال هي وسيلة قوية لتحديد إمكانية منتصف العوامل المساعدة في البروتينات والتعرف وتحديد العوامل المساعدة في حالة الأكسدة كشف الخاصة بهم.

تقنية مكملة لالكيمياء الكهربائية المباشر (القياس الفولطي) النهج، لأنها لا تقدم معلومات عن معدلات نقل الإلكترون، ولكن لا تحديد هويتهم والأكسدة حالة العوامل المساعدة في البروتين قيد الدراسة. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع إلى أي البروتين تحتوي على ممغطس الإلكترون الرنين (EPR) العامل المساعد للكشف.

والمعايرة النموذجية تتطلب 2 مل البروتين مع تركيز العامل المساعد في مجموعة من 1-100 ميكرومتر. ومعاير البروتين مع اختزال الكيميائية (ثنائي ثيونيت الصوديوم) أو أكسدة (فروسيانيد البوتاسيوم) من أجل اتزان العينة في إمكانات معينة. يتم توصيل سلك البلاتين وإشارة القطب حج / أجكل إلى فولتمتر لقياس إمكانات الحل البروتين. ويتم استخدام مجموعة من 13 سطاء الأكسدة المختلفة لكي تتوازن بين العوامل المساعدة الأكسدة من البروتين والأقطاب. يتم رسمها العينات في الإمكانيات المختلفة والأطياف الكترون ممغطس الرنين، مميزة لالعوامل المساعدة الأكسدة المختلفة في البروتين، ويتم قياسها. ويتم تحليل مؤامرة من شدة إشارة مقابل إمكانية العينة باستخدام معادلة نرنست من أجل تحديد إمكانية منتصف العامل المساعد.

المقدمة

ومن الملفت للنظر أن العمليات الكيميائية الأساسية إدامة الحياة على هذا الكوكب، التمثيل الضوئي، وتثبيت النيتروجين والتنفس، ويحفزه مجمعات البروتين كبيرة تحتوي على مجموعة واسعة من العوامل المساعدة الأكسدة العضوية وغير العضوية. وتشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 30٪ من جميع البروتينات تحتوي على واحد أو أكثر من العوامل المساعدة المعادن. 1،2 تحديد وتوصيف يمكن تأسيس العوامل المساعدة الأكسدة باستخدام الكيمياء الكهربائية المباشر (على سبيل المثال، والبروتين فيلم القياس الفولطي) أو معايرات الأكسدة والاختزال. تقنيات متكاملان في طبيعتها وإمكانية تطبيقها. القياس الفولطي يقدم تقرير سريع من إمكانات نقطة المنتصف وحركية نقل الإلكترون من العوامل المساعدة التي يمكن أن تتفاعل مع سطح القطب. 3،4 عادة هذا يعمل بشكل جيد للبروتينات نقل الإلكترون، مثل السيتوكروم ج أو فيريدوكسين. ويعمل بعض الأحيان لبروتينات أكثر تعقيدا التي تم يجمد إلى سطح القطب. معرفة تفصيلية للطبيعة العوامل المساعدة في البروتين يجب أن تكون متاحة، وسوف voltammogram لا تعطي أي معلومات مباشرة عن هوية العامل المساعد. معايرات الأكسدة والاختزال هي أكثر شاقة لتنفيذ وتتطلب كميات ملغ من البروتين. ومع ذلك، وأنها توفر معلومات عن إمكانات نقطة المنتصف وهوية العامل المساعد. وعلاوة على ذلك 5 في المعايرة واحدة يمكن رصد العوامل المساعدة متعددة في البروتين.

مبدأ المعايرة الأكسدة هو أن البروتين النشط الأكسدة أو إنزيم يتم تخفيض كيميائيا أو أكسدة. من أجل التأكد من أن تتفاعل مع العوامل المساعدة تستخدم وسطاء اختزال أو أكسدة الأكسدة. تتفاعل هذه سطاء الأكسدة أيضا مع القطب بحيث يمكن قياس إمكانيات الحل. الوسطاء بمثابة منطقة عازلة الأكسدة ويوازن بين العوامل المساعدة في البروتين والقطب. بعد الإستعداد كيميائيا القدرة على القيمة المطلوبة، يتم رسم العينة وتجميدها في النيتروجين السائل لAW بسرعةأيت مزيد من التحليل مع التقنيات الطيفية. التحليل الطيفي EPR مفيد بشكل خاص في هذا الصدد لأنها يمكن أن تستخدم لقياس كميا مراكز المعادن ممغطس أو المتطرفين العضوية.

المعايرة الأكسدة يمكن أن يؤديها في اتجاهين: من الأقل إلى الأعلى أو من الأعلى إلى إمكانية نقطة المنتصف منخفضة. والخيار يتوقف على استقرار العوامل المساعدة قيد الدراسة. في كثير من الأحيان أنه من الحكمة أن تبدأ في قدرة منخفضة وإضافة إلى أكسدة بالتدريج زيادة إمكانات. وهذا ما يسمى المعايرة المؤكسدة ويوصف هنا. نحن هنا تظهر المعايرة الأكسدة من الكتلة الحديد والكبريت التي تحتوي على البروتين Nar1 من خميرة الخباز. ويشارك هذا البروتين، من المحتمل كما بروتين سقالة، في عصاري خلوي الحديد والكبريت السكروز مجموعة الآلات (CIA مسار). 6،7

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد إعداد وحلول

  1. يعد حل العازلة التي تحتوي على 100 ملي تريس، 250 ملي مول كلوريد الصوديوم و 10٪ الجلسرين في درجة الحموضة 8.5. Deaerate المخزن المؤقت من قبل بيغ مع الأرجون. إدخال المخزن المؤقت إلى غرفة اللاهوائية.
  2. تقسيم عازلة في جزأين. لجزء واحد (عازلة A) إضافة 1 ملم DL-dithiothreitol (DTT، M ص 154.25 جم / مول) و 1 ملي L-السيستين. الجزء الآخر (B العازلة) لا يحتوي على الحد من وكلاء.
  3. إعداد أكسدة واختزال الحلول. جعل 1 مل حلول من 2، 20، و 200 ملي فيري سيانيد البوتاسيوم (FIC، M ص 329.26 جم / مول) وثنائي ثيونيت الصوديوم (SD، M ص 174.11 جم / مول) في اللاهوائي عازلة B.
  4. إعداد مزيج الوسيط على النحو التالي:
    1. إضافة 160 ميكرومتر لكل من الوسطاء الأكسدة التالية و 50 مم كلوريد الصوديوم للتخفيف B: N، N، N '، N' -tetramethyl-P-phenylendediamine (TMPD، M ص 237.17 جم / مول، E '0 +0.276 V) ، 2،6-dichlorophenol الإندوفينول(DCIP، M ص 290.08 جم / مول، E '0 +0.217 V)، phenazine ethosulphate (PES، M ص 334.4 غرام / مول، E' 0 +0.055 V)، الميثيلين الأزرق (M ص 319.85 جم / مول، E ' 0 +0.011 V)، Resorufin (M ص 235.17 جم / مول، E '0 -0.051 V)، Indigodisulphonate (M ص 466.35 جم / مول، E' 0 -0.125 V)، 2-هيدروكسي-1،4-naphtaquinone ( M ص 174.15 جم / مول، E '0 -0.145 V)، أنثراكوينون-2-سلفونات (M ص 328.28 جم / مول، E' 0 -0.225 V)، Phenosafranin (M ص 322.8 غرام / مول، E '0 -0.252 V)، Safranin O (M ص 350.84 جم / مول، E '0 -0.280 V) والأحمر محايد (M ص 288.8 غرام / مول، E' 0 -0.340 V)، البنزيل viologen (M ص 409.4 غرام / مول، E '0 -0.350 V)، والميثيل viologen (M ص 257.16 جم / مول، E' 0 -0.440 V).
    2. التفاف زجاجة في رقائق الألومنيوم لحماية الوسيطالصورة من الضوء.
  5. إعداد 10 ملغ / مل S. الخباز الموسومة بكتيريا Nar1 البروتين (181 ميكرومتر، M ص 55.2 كيلو دالتون) في المخزن ألف السريع S. الخباز Nar1 في E. القولونية كما بروتين الموسومة بكتيريا باستخدام pET24A التعبير النواقل. تنقية البروتين في غرفة اللاهوائية باستخدام وسائل الإعلام بكتيريا-tactin اللوني (IBA) وتنقية باستخدام نظام تنقية البروتين مثل AKTA تنقية (GE للرعاية الصحية).
  6. تحضير الإعداد الأكسدة المعايرة في غرفة اللاهوائية على النحو التالي:
    1. توصيل القطب المرجعية حج / أجكل والقطب سلك البلاتين إلى السفينة المعايرة. ربط كل من الأقطاب الكهربائية إلى الفولتميتر التي يمكن قياس من بالسيارات حتى V.
    2. إدراج شريط التحريك صغير.
    3. وضع السفينة المعايرة فوق محرك مغناطيسي.
    4. ملء وعاء المعايرة مع B الاحتياطي، والحل مزيج الوسيط وحل البروتين لتصل إلى 2 مل، أي لتركيزات النهائية من البروتين 72 ميكرومتر و 38 ميكرومتر كلالوسيط. ملاحظة: اعتمادا على تركيز البروتين والوسيط المطلوبة تركيزات كميات من الحلول الثلاثة يجب تعديلها.
    5. يحرك المزيج لمدة 30 دقيقة والتبديل على الفولتميتر.
  7. إعداد 10 نظيفة الكوارتز أنابيب زجاجية EPR. إدخال الأنابيب في غرفة اللاهوائية.
  8. ملء صغير (حوالي 200 مل) ديوار النيتروجين السائل مع النيتروجين السائل.

2. تنفيذ الأكسدة والاختزال المعايرة

  1. انتظر حتى إمكانات الحل مستقرة. ملاحظة: وهذا يعني عمليا أن إمكانيات الانجرافات أقل من 1 بالسيارات في الدقيقة الواحدة.
  2. نلاحظ انخفاض القدرة التي قدمها الفولتميتر.
  3. رسم العينة الأولى من 200 ميكرولتر وحقن في أنبوب EPR.
  4. غطاء الأنبوب مع سدادة مطاطية وإزالة أنبوب من غرفة اللاهوائية.
  5. تجميد أنبوب في النيتروجين السائل على النحو التالي: تحذير! هذا الذي ينبغي القيام به ببطء، وإلا فإن أنبوب سوف كسر.
    1. أولا إدراج رالملكية الفكرية من الأنبوب في النيتروجين السائل.
    2. الانتظار حتى يمكن سماع صوت الهسهسة. ملاحظة: هذا قد يستغرق فترة تصل إلى 10 ثانية.
    3. إدراج ببطء بقية الأنبوب بحيث يتم المغمورة الجزء عينة بالكامل.
  6. إضافة صغيرة قسامة 1-2 ميكرولتر من محلول 2 مم SD إلى حل في السفينة المعايرة لخفض إمكانات الحل ل-0.6 V.
    ملاحظة: إذا كان أكثر من 10 ميكرولتر لابد من إضافتها، قم بالتبديل إلى حل ملي 20. كما أنه من الصعب جدا أن اتزان إلى قيمة محتملة محددة، يتم كتابة القيم الفعلية المسجلة على الفولتميتر أسفل وتستخدم لبناء منحنى المعايرة.
  7. رسم العينة كما هو موضح في الخطوة 2،3-2،5.
  8. نلاحظ انخفاض القدرة الفعلية التي قدمها الفولتميتر.
  9. إضافة للأكسدة حتى ازداد احتمال من قبل حوالي 50 بالسيارات. تبدأ بإضافة صغير قسامة 1-2 ميكرولتر من محلول 2 مم FIC. إذا كان أكثر من 10 ميكرولتر لابد من إضافتها، قم بالتبديل إلى حل ملي 20.
  10. يدون حوث تم إضافة الكثير من الحلول و. ملاحظة: هذا أمر ضروري لتصحيح للتخفيف عينة خلال المعايرة.
  11. رسم العينة كما هو موضح في 2،3-2،5 الخطوات.
  12. نلاحظ انخفاض القدرة الفعلية التي قدمها الفولتميتر.
  13. كرر الخطوات من 2.9 و 2.12 حتى مجموعة المحتملين من -0.6 V إلى +0.2 V وقد تم تغطية وشغل كل 10 أنابيب الثوري لكل منها 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: كما يتم تقليل حجم الانسحاب مع كل المواقع من الأقطاب قد تحتاج إلى تعديل لديها اتصالات جيدة مع الحل دون تدخل من التحريك. قد يكون من الصعب قياس القدرة بعد الانسحاب من العينة الماضية، وبالتالي فإن إمكانية أن العينة قد تكون أقل دقة.
  14. اختياريا، وتخزين العينات EPR المجمدة في النيتروجين السائل حتى القياسات الثوري يمكن أن يحدث.

3. قياس المعايرة عينات عن طريق EPR التحليل الطيفي وتحليل البيانات

  1. سجل EPR أطياف مختلفةعينات المعايرة على النحو التالي:
    1. استخدام مضخة عالية فراغ لاجلاء ناظم البرد الكوارتز إلى <10 -5 شريط.
    2. التبديل على مياه التبريد من المغناطيس EPR. فتح تدفق الهواء الجاف من خلال تجويف EPR.
    3. التبديل على إمدادات الطاقة إلى المغناطيس والكمبيوتر من EPR.
    4. تشغيل برنامج تردد المعايرة. تعيين المعلمات قياس EPR. ربط ناظم البرد إلى الهليوم السائل ديوار. تبريد تجويف إلى 9-16 K.
    5. إدخال عينة EPR في تجويف. تسجيل الطيف EPR.
  2. التعرف على الأنواع المختلفة الثوري واستخدام أفضل الأطياف لقياس الإشارات. تحقيق EPR الكمي التي كتبها التكامل المزدوج للالأطياف والمقارنة مع طيف من النحاس الخارجي الحل القياسي 10 ملي كبريتات النحاس 10/04 ملم حمض الهيدروكلوريك / 2 M NaClO 4. 8
  3. جعل منحنى المعايرة على النحو التالي:
    1. رسم إشارة السعة EPR في ز القيمة التي هي من سمات لالفقرةالأنواع المغناطيسية التي تهم ضد المحتملة.
    2. تغيير EPR على نطاق وإشارة إلى السعة يدور / حجم الجزيء باستخدام الكمي EPR من الخطوة 3.2.
    3. تصحيح السعة إشارة من كل عينة لتخفيف الذي حدث بسبب اضافات من المؤكسدة أو الحد من وكيل.
    4. تصحيح القدرة على احتمال منتصف الإشارة القطب حج / أجكل.
      ملاحظة: الإلكترود المرجعي حج / أجكل (مع المشبعة بوكل) لديها امكانات منتصف +0.194 V مقابل الكهربائي الهيدروجين القياسي (SHE) عند 25 درجة مئوية. ولذلك، إذا إمكانات على الفولتميتر يقرأ حوالي -0.6 V، فإن احتمال مع الإشارة إلى SHE هي -0.4 V.
  4. تناسب إشارة إلى المعادلة نرنست على النحو التالي:
    بالنسبة لأنواع لهو ممغطس في الدولة خفضت:
    figure-protocol-1
    بالنسبة لأنواع لهو ممغطس في سالدولة xidized:
    figure-protocol-2
    بالنسبة لأنواع لغير متوازي المغنطيسية في حالة وسطية:
    figure-protocol-3
    هذه المعادلات صالحة للتفاعلات الأكسدة والاختزال التي يتم فيها نقل إلكترون واحد، لذلك ن = 1.
    E = المحتملة في فولت
    E = م إمكانات منتصف الطريق في فولت
    F = ثابت فاراداي = 96480 C · مول -1
    R = الغاز ثابت = 8.314 J · K -1 · مول -1
    T = درجة الحرارة في كلفن

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأسفرت المعايرة الأكسدة من الكتلة الحديد والكبريت التي تحتوي على البروتين Nar1 من خميرة الخباز في تحديد العوامل المساعدة ثلاثة مختلفة: Nar1: أ [3Fe-4S] العنقودية، و[4Fe-4S] العنقودية ومركزا الحديد وحيدات النوى (الشكل 1) . وتتميز إشارات الثوري التي كتبها g-قيمهم: ل[3Fe-4S] + ز ض 2.01 ز كروس 2.00 (الشكل 1B)؛ ل[4Fe-4S] +، ز ض ز 2.02 ص 1.93، ز س 1.82 (الشكل C...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

سلسلة من 13 وسطاء الأكسدة تسمح توازن الأكسدة والاختزال في الحل في مجموعة من -0.45 إلى +0.3 V مقابل SHE (الجدول 1 والشكل 3). حسنا فوق وتحت هذه الإمكانات كافة وسطاء إما تخفيض تماما أو أكسدة تماما، وبالتالي لا يوجد موازنة إضافية مع المراكز الأكسدة الفعالة من البروتين يمكن أن يحدث. هذا هو فكرة مهمة، كما هو الحال في الأدب تتم المعايرة أحيانا الأكسدة مع اثنين أو ثلاثة فقط وسطاء، والسماح نطاق ضيق إلا أن قياس 11. وهذه المعايرة الأكسدة تعطي إلا نتائج موثوقة إذا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل ماليا من خلال منحة بحثية من الجمع بين المدرسة الهولندية القومي للبحوث، الحفز التي يسيطر عليها تصميم الكيميائية (NRSC-الحفز). واعترف الدكتور HY Steensma والدكتور GPH فان هيوسدين من جامعة ليدن على دعمهم مع التعبير المؤتلف من S. الخباز Nar1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
القطب المرجعي (Ag / AgCl)كيماويات مقياس
Sigma-Aldrich
EPR مطيافBruker
N، N، N'، N' < / م > -رباعي ميثيل ف فينيلنديامين (TMPD) · ؛ (HCl) 2< / sub>637-01-4
2،6-ثنائي كلورو فينول إندوفينول (DCIP) ، ملح620-45-1
فينازين إيثوسلفات (PES)10510-77-7
الميثيلين الأزرق122965-43-9
ريسوروفين ، ملح34994-50-8
إنديجودي سولفونات (نيلي كارمين)860-22-0
2-هيدروكسي-1،4-نفتاكينون83-72-7
أنثراكينون-2-سلفونات Na+< / sup> H2< / sub>O153277-35-1
Phenosafranin81-93-6
Safranin O477-73-6
أحمر553-24-2
بنزيل فيولوجين1102-19-8
ميثيل فيولوجين1910-42-5
الإشعاع الصوديوم الصوديوم محايد

المراجع

  1. Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
  2. Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).
  3. Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms. Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).
  4. Hagen, W. R. Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode. Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).
  5. Pierik, A. J., et al. Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).
  6. Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins. EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).
  7. Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation. J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).
  8. Aasa, R., Vänngård, T. EPR Signal Intensity and Powder Shapes. A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).
  9. Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz,, J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis. Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).
  10. Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron. Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).
  11. Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme. Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).
  12. Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch,, Landa, I., Hagen, W. R. Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation. FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).
  13. Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

معايرة الأكسدة والاختزال بالرنين البارامغناطيسي الإلكترونيالرنين البارامغناطيسي الإلكترونيقياس جهد الأكسدة والاختزالتحليل العامل المساعدوسائط الأكسدة والاختزالثنائي ثيونيت الصوديومفيريسيانيد البوتاسيومقطب سلك البلاتينقطب Ag/AgCl المرجعي
EPR رصدت الأكسدة والاختزال المعايرة من العوامل المساعدة لل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.