يوصف تقنية لعزل cholangiocytes من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران حديثي الولادة. يتم تشريح بدقة القنوات، ثم يتم عزل الخلايا عن طريق ثمرة في المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وهذه الطريقة توفر أداة مفيدة لدراسة خارج الكبد الصفراء تطوير القناة وعلم الأمراض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القناة الصفراوية خارج الكبد وداخل الكبد تختلف تنمويا، ويمكن أن تتأثر بشكل مختلف عن أمراض معينة. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين cholangiocytes داخل وخارج الكبد، وبين الخلايا حديثي الولادة والكبار، ليست مفهومة جيدا.
طرق لعزل cholangiocytes القناة الصفراوية داخل الكبد من راسخة 1-4. عزل خلايا الأقنية خارج الكبد، خصوصا من حديثي الولادة، لم يتم بعد وصفها، على الرغم من أن هذا من شأنه أن تكون ذات فائدة كبيرة في فهم الاختلافات بين السكان cholangiocyte متميزة في دراسة والأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي يبدو أنها تستهدف القنوات خارج الكبد. الموصوفة هنا هو أسلوب الأمثل لعزل الخلايا القناة الصفراوية خارج الكبد على حد سواء حديثي الولادة والكبار الماوس. هذه التقنية تعطي السكان الخلية نقية مع الحد الأدنى من التلوث من خلايا اللحمة المتوسطة مثل الخلايا الليفية.
هذا methoويستند د على إزالة القنوات خارج الكبد والمرارة، تليها تشريح دقيق وتجريف لإزالة طبقات الدهون والخلايا الليفية. هي جزء لا يتجزأ الهياكل في طبقات سميكة من الكولاجين وتربيتها لمدة ما يقرب من 3 أسابيع للسماح ثمرة cholangiocytes في الطبقات الوحيدة، التي يمكن بعد ذلك إعادة trypsinized ومطلي للاستخدام التجريبي.
المقدمة
أصل وتطور من داخل وخارج الكبد cholangiocytes تختلف بشكل ملحوظ. الكبد يتطور من رتج من المعى الأمامي الأديم الباطن بطني 5. المنطقة الذيلية من رتج تشكل الشجرة الصفراوية خارج الكبد، في حين أن المنطقة الجمجمة يولد الشجرة الصفراوية داخل الكبد 5. وتستمد cholangiocytes القناة داخل الكبد من الخلايا الاصلية في جميع أنحاء لوحة الأقنية في المناطق المحيطة البوابة 6. هذه الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا الكبد أو إما cholangiocytes 6. هذا له آثار سريرية كبيرة بالنظر إلى أن cholangiopathies قد تستهدف على وجه التحديد فئة واحدة من cholangiocytes. على سبيل المثال، يؤثر رتق القناة الصفراوية خار....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. ينبغي تنفيذ جميع أعمال الحيوانية في ظل ظروف إنسانية في إطار بروتوكول وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المحلي (IACUC).
1. إعداد المعدات وحلول
- إعداد جدول الجراحية الماوس في مقربة من نسيج الثقافة هود والحاضنة (الشكل 1A). ملاحظة: تشمل المعدات المطلوبة مجهر تشريح، مصدر الضوء، 12.5 سم مقص القزحية على التوالي، 6 بوصة ملقط المنحني غير مسننة مع نصائح غرامة، و 4 بوصة ملقط مسنن ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام هذا البروتوكول النتائج في عزل السكان من الأطفال حديثي الولادة الماوس cholangiocytes خارج الكبد مع نقاء ممتازة، كما يتبين من K19 المناعي تلطيخ (أرقام 2A و 2B)؛ نحقق نتائج مماثلة عزل خلايا من فئران بالغة. وقد لاحظنا أن يستغرق 3 أسابيع لخلايا من القناة الصفراوية المعزولة حديثا لتشكيل الطبقات الوحيدة على المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وcholangiocytes تنمو بطريقة خطية في جميع أنحاء الكولاجين سميكة، وتشكيل ورقة من الخلايا من القنوات معزولة. ينبغي تقسيم الخلايا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الموصوفة هنا هي تقنية لعزل cholangiocytes نقية من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران من الفئران من جميع الأعمار، بما في ذلك حديثي الولادة. تقدم هذه التقنية ميزة أن cholangiocytes خارج الكبد يمكن دراستها بمعزل عن cholangiocytes داخل الكبد، ويمكن أن تسهل دراسات لتحديد الاختلافات الرئيسية بين هؤلاء السكان من الخلايا. نشرنا مؤخرا انخفضت إلى التظاهر الدراسة أهداب في cholangiocytes خارج الكبد معزولة بواسطة هذه الطريقة والمصابين فيروس الروتا ريسوس 8. وتشمل مساوئ هذه التقني.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.
شكر وتقدير
المؤلفون ممتنون لعلم الأمراض الجزيئية والتصوير الأساسية لمركز جامعة بنسلفانيا NIDDK للدراسات الجزيئية في أمراض الجهاز الهضمي والكبد (P30 DK50306) للحصول على المساعدة مع التصوير. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK-092111) ومن Biesecker مركز سوزان أطفال الكبد وفريد (لRGW) وزمالة من شبكة الطفولة أمراض الكبد البحوث والتعليم (لSK).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM / F12 (1: 1) | Gibco / Life technologies | 11320-033 | 500 مل ، تستخدم في وسائط BEC |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 مل ، تستخدم في وسائط BEC |
| MEM مع الأحماض الأمينية غير الأساسية | Gibco / Life technologies | 11140-019 | 5 مل ، تستخدم في وسائط BEC |
| الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم | Gibco / Life | 51300-044 | 5 مل ، المستخدمة في وسائط BEC |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 مل ، يستخدم في وسائط BEC |
| تركيز الدهون المحدد كيميائيا | تقنيات Gibco / Life | 11905-031 | 5 مل ، يستخدم في وسائط BEC |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml ، يستخدم في وسائط BEC و 500 & # 956 ؛ ل في العزلة |
| Gentamicin | Gibco / تقنيات الحياة | 15750-060 | 0.2 مل ، المستخدمة في وسائط BEC و 500 &# 956 ؛ ل في العزل |
| الإيثانولامين | سيجما ألدريتش | E9508-100 مل | 0.13 مل ، يستخدم في وسائط BEC |
| محلول فيتامين MEM | Gibco / Life Technologies | 11120-052 | 5 مل ، يستخدم في وسائط BEC |
| مثبط التربسين فول الصويا | Biowhittaker | 17-605E | 5 مل ، يستخدم في وسائط BEC. المذيب هو PBS ، امزج إلى 5 مجم / مل تركيز مخزون |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5 مل ، يستخدم في وسائط BEC |
| مستخلص الغدة النخامية البقري | Gemini | 500-102 | 1.1 مل ، يستخدم في وسائط BEC |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 مل ، يستخدم في وسائط BEC ، Stock conc 393 &# 956 ؛ جم / مل مخفف بالإيثانول |
| 3 3 '، 5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 مل ، يستخدم في وسائط BEC ، مخزون conc 3.4 مجم / مل مخفف بالإيثانول |
| عامل نمو البشرة | Millipore | 01-101 | 0.5 مل ، يستخدم في وسائط BEC ، 25 & # 956 ؛ جم / مل مخفف مع DMEM F12 + 1٪ BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 مل ، يستخدم في وسائط BEC ، يستخدم بتركيز مخزون 0.411 مجم / مل ويخفف مع تقنيات DMSO |
| Fungizone | Gibco / Life | 15290-018 | 1 مل ، المستخدمة في وسائط BEC و 500 & # 956 ؛ ل في العزلة |
| الكولاجين ذيل | الفئران BD Biosciences | 354236 متغير | اعتمادا على تركيز الكولاجين |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | يستخدم عند 10x ، sterlie ، يستخدم لصنع الكولاجين ، الكمية المستخدمة تعتمد على تركيز الكولاجين |
| dH 2< / sub > O | N / A | N / A | معقمة ، تستخدم لصنع الكولاجين ، تعتمد الكمية المستخدمة على تركيز الكولاجين |
| هيدروكسيد الصوديوم 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | مخفف إلى 1 نيوتن ، معقم ، يستخدم لصنع الكولاجين ، الكمية المستخدمة تعتمد على تركيز الكولاجين |
| من النوع XI من المطثية النوسجية | Sigma Aldrich | C7657 | مخفف في DMEM وفلتر معقم قبل الاستخدام |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25٪ | Gibco / Life technologies | 25200-056 | 3 مل ، احتضان بحد أقصى 10 دقائق |
| من التربسين-EDTA (10x) 0.5٪ | تقنيات Gibco / Life | 15400-054 | 3 مل ، احتضان بحد أقصى 10 دقائق |
| المجهر | نيكون | SMZ645 | نماذج أخرى مقبول |
| مصدر الضوء (إضاءة الألياف البصرية) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | نماذج أخرى مقبولة |
| 12.5 سم مقص قزحية مستقيمة | كينت علمية | نماذج أخرى مقبولة | |
| 6 بوصات ملقط منحني غير مسنن مع نصائح دقيقة | المجهر الإلكتروني | نماذج أخرى مقبولة | |
| 4 "ملقط غير قابل للصدأ مسنن مع نصائح دقيقة | علوم | نماذج أخرى مقبولة |
المراجع
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
