مقالة منهجية

طرق لتوصيف التلقائي وباغت الناجم عن تحرك في نموذج مرض باركنسون الناجم عن روتنون من ذبابة الفاكهة

DOI:

10.3791/51625

⸱

أغسطس 17, 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Colby College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون هو اضطراب الاعصاب الذي ينجم عن تدهور الخلايا العصبية الدوبامين في الجهاز العصبي المركزي، مما تسبب عيوب الحركة. نماذج روتنون مرض باركنسون في ذبابة الفاكهة. تلخص هذه الورقة اثنين المقايسات التي تميز أوجه القصور تنقل كل من العفوية والتي يسببها باغت الناجمة عن روتينون.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون هو اضطراب الاعصاب الذي ينجم عن تدهور الخلايا العصبية الدوبامين في الجهاز العصبي المركزي، وخاصة في المادة السوداء. يسبب هذا المرض النقص السيارات، التي تمثل وصلابة، والهزات، والخرف في البشر. روتنون هو الحشرات التي تسبب الضرر التأكسدي عن طريق تثبيط وظيفة سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا. كما انها تستخدم لنمذجة مرض باركنسون في ذبابة الفاكهة. الذباب لديها استجابة geotactic السلبية الكامنة، مما يحملهم على تسلق صعودا يجري على الدهشة. وقد ثبت أن روتينون يسبب عيوب الوفيات وتنقل الأولى التي تعطل قدرة الذباب "في الصعود بعد أن تم استغلالها أسفل. ومع ذلك، لا يتم توثيق تأثير روتينون على حركة عفوية أيضا. وتحدد هذه الدراسة اثنين حساسة، قابلة للتكرار، وفحوصات عالية الإنتاجية لوصف أوجه القصور الناجمة عن روتينون فيالناجم عن جفل المدى القصير تحرك وتنقل عفوية على المدى الطويل في ذبابة الفاكهة. هذه المقايسات يمكن تكييفها بسهولة لتوصيف نماذج ذبابة الفاكهة الأخرى من العيوب تحرك وفعالية العوامل العلاجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أوجه القصور تنقل هي الأعراض الرئيسية لمرض الشلل الرعاش وسببه تدهور الخلايا العصبية الدوبامين في المادة السوداء 1. روتنون هو مبيد حشري كيتوني التي تمت دراستها على نطاق واسع لنموذج العجز الحركي باركنسون في ذبابة الفاكهة 2-6. روتنون يسبب الضرر التأكسدي عن طريق عرقلة المسار الفسفرة المؤكسدة، مما يؤدي في نهاية المطاف موت الخلية 7. الخلايا العصبية الدوبامين أكثر عرضة للتسمم روتينون، مما آثار المادة الكيميائية في المقام الأول المحرك تستند 2،7. عن طريق إحداث أعراض مرض باركنسون في الذباب، يمكننا فهم أفضل للمرض وعلاج أعراضه 6،8-11. يوفر ذبابة الفاكهة نموذجا جيدا لدراسة هذا التأثير لأنها لين العريكة وراثيا، وسهلة للحفاظ على، ولها دورة الحياة السريعة.

وقد أظهرت العديد من الدراسات أن روتينون يسبب يسببها جفل الأجل القصيرتتم المحافظة على العيوب في تحرك الذباب ذبابة الفاكهة على الطعام، وعندما تستكمل روتينون، أنها تظهر استجابة geotactic أبطأ السلبية بعد الانبهار 2-6. فشلهم في تسلق صعودا في جهاز القارورة في أسرع وقت المحاكمات السيطرة يدل على تحرك العيوب التي يسببها جفل.

تأثير روتينون على المدى الطويل، لا يتم وصف حركة عفوية أيضا. وقد استخدمت مراقبين نشاط ذبابة الفاكهة (السدود) بنجاح لرصد الحركة في ذبابة الفاكهة إيقاع الساعة البيولوجية يدرس 12،13. توضع الذباب في أنابيب الفردية، التي يتم تحميلها إلى DAM. وقد تم تجهيز هذا الجهاز مع جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء، التي بحساب عدد المرات ذبابة يكسر شعاع الأشعة تحت الحمراء. هذه التهم يمكن استخدامها كمقياس للتحرك دون عائق والنشاط 12،13. عن طريق وضع الذباب في DAM، يمكن وصف تأثير على روتينون من تحرك طويل الأجل. توضح هذه الدراسة طرق الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافالناجم عن جفل لدى عودتهم المدى القصير تحرك وتنقل عفوية على المدى الطويل من أجل فهم أفضل للآثار القصور الحركي روتينون بوساطة. توصيف القصور محاكاة تنقل مرض باركنسون مهمة لأنها تسمح لدراسة المركبات الأخرى التي قد عكس هذه العيوب الحركة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ذبابة الفاكهة باغت التي يسببها الفحص الحركي

  1. العلاج من تعاطي المخدرات
    1. رزين لشل عدد الذكور البالغ المطلوب اليوم (حوالي 8-12) من 1-3 الذباب باستخدام CO 2 ونقلها إلى قارورة تحتوي على المواد الغذائية تستكمل المخدرات. ملاحظة: مخدر آخر مثل الأثير أو الجليد يمكن استخدامها لرزين الذباب لتمكين العد والمناولة.
    2. السماح للذباب للتعافي من التخدير لمدة 20 دقيقة (أو حتى الشفاء) مع القارورة في وضع أفقي (لمنع الذباب يعلقوا على الطعام) ثم ضع قارورة تستقيم في الظلام 12 ساعة، 12 ساعة ضوء الحاضنة عند 25 ° C للفترة المتبقية من التجربة.
  2. التجريبية تعيين لأعلى
    1. تقسيم هذا الإعداد قنينة مزدوج إلى ثلاثة أقسام متساوية من 6.33 سم عن طريق وضع دوائر حول قنينة مع علامة دائمة.
    2. بعد 3 أيام من التعرض للمخدرات، ونقل الذباب دون التخدير في قارورة القاع بسرعة ووضع القارورة أعلىخلال الافتتاح. الشريط قارورة اثنين معا مع الشريط واضح.
    3. السماح للذباب حتى يتأقلم مع البيئة الجديدة لمدة 15 دقيقة.
    4. مكان قارورة على خلفية بيضاء واقامت كاميرا رقمية على مسافة مناسبة من الجهاز قنينة مزدوج مع جهاز توقيت في الرأي. ضمان الجهاز بأكمله مرئيا في إطار صورة واحدة وأن كل الذباب هي في التركيز. للحفاظ على إطارات متسقة بين التجارب، بمناسبة موقع الكاميرا وقنينة.
  3. الفحص التنقل
    1. عرض بوضوح عدد المحاكمة، العلاج من تعاطي المخدرات، والموقت في عرض الكاميرا.
    2. بحزم الاستفادة من جهاز قنينة المزدوج ضد كونترتوب 3 مرات والتأكد من أن جميع الذباب تقع في الجزء السفلي من القارورة. في وقت واحد بدء الموقت.
    3. كل 5 ثانية لمدة 1 دقيقة، التقاط صورة من الجهاز. ملاحظة: بدلا من ذلك، شريط فيديو يمكن احتجازها وتوقف على فترات مناسبة لقياس.
    4. السماح للذباب للتعافي دون عائق لمدة 1 دقيقة.
    5. كرر 2 مرات أكثر مع 1 دقيقة الانتعاش مرة بين كل محاكمة. ملاحظة: كل جهاز يجب أن تأخذ 5 دقائق لاستكمال جمع البيانات. الحفاظ على قوة مماثلة من التنصت بين التجارب. متعددة (3 على الأقل) جهاز يمكن التعامل معها بسهولة في وقت واحد.
  4. تحليل البيانات
    1. استعراض الصور وتسجيل عدد من الذباب في كل قسم مع مرور الوقت. حساب النسبة المئوية من الذباب في كل قسم مع مرور الوقت. ملاحظات: كرر هذا الإجراء بأكمله مع نفس الذباب في 2 أو 3 نقاط زمنية من الفائدة، على سبيل المثال، يوم 3 و 5 و 7. إذا كان الكثير من الذباب يموت في كافة مراحل التجربة أنه من الممكن زيادة عدد محاكمة الأصلي للتعويض لفيات. استخدام التحليل الإحصائي المناسب لمقارنة البيانات.

2. ذبابة الفاكهة العفوي تنقل الفحص

  1. إعداد الطعام
    1. إعادة 3 غرام من لحظة ذبابة الفاكهة المتوسطة مع 15 مل من الماء دي المتأينة وروتينون المطلوب(أو دواء آخر من الفائدة) الجرعة.
    2. بمجرد أن تصبح خليط المواد الغذائية شركة (حوالي 5 دقائق)، تحميل بعناية الطعام إلى ما يقرب من 1 سم ارتفاع في مصنع بتوريد أنابيب شفافة (5 ملم X 65 ملم). إضافة المخدرات التي غرست الغذائية للأنابيب عن طريق وضع بعناية الأنابيب عموديا في الغذاء والتواء لهم حتى يمكن إزالتها مع الغذاء داخل الأنبوب. ملاحظة: من المفيد وضع الاصبع على افتتاح أنبوب لخلق فراغ. فينبغي ألا يحتوي الغذاء أي فقاعات الهواء أو لديك سطح متفاوتة كما الذباب يمكن أن تصبح عالقة.
  2. الإعداد التجريبي
    1. وضع غطاء من البلاستيك على نهاية أنبوب أقرب الطعام. دفع غطاء من البلاستيك على أنبوب أقل قدر ممكن، كما أنه يمكن خلق فقاعة الهواء في القارورة إذا دفعت بقوة ل.
    2. رزين الذكور القديم يوم 1 الذباب باستخدام CO 2 وإدراج بعناية 1 الذكور تطير في كل أنبوب مع الفرشاة. كرر اعتمادا على عدد من التجارب المطلوبة.
    3. سدنهاية أبعد من أنبوب الطعام مع كرة القطن الصغيرة، والتي يمكن أن تدحرجت ناحية من أكبر متجر اشترى كرات القطن.
    4. السماح للذباب للتعافي مع الأنابيب في وضع أفقي لمدة 15 دقيقة والتأكد من أن جميع الذباب حية ونشطة. إدراج أنابيب في DAM والتأكد من أن جميع الأنابيب في نفس الموقف بالنسبة إلى السد. ملاحظة: من الممكن وضعها مع مجال الرصد في منتصف القارورة، أو لدفع كل قارورة إلى جنب، بحيث يتم مراقبة نهاية أنبوب. ملاحظة: انظر لمناقشة الاختلافات على هذا الأسلوب.
  3. جمع البيانات
    1. وضع السد في الظلام 12 ساعة، 12 ساعة ضوء مجموعة حاضنة إلى 25 درجة مئوية. ربط DAM لنظام جمع البيانات. فتح برنامج DAM وتحت تفضيلات حدد طول بن ل10 دقيقة. بدء جمع البيانات والسماح للبرنامج لجمع البيانات لمدة 7 أيام. ملاحظة: يمكن تعديل طول بن إذا لزم الأمر.
    2. تحليل البيانات
      ملاحظة: عمليةالبيانات للحصول على التهم لكل دقيقة كإجراء لتحرك عفوي على المدى الطويل.
      1. ملف البيانات DAM مفتوحة البرنامج ورصد وصول المسح الضوئي بالضغط تحديد بيانات الإدخال.
      2. تحديد نطاق رصد المناسب وحدد بن لطول فترات 10 دقيقة.
      3. في الناتج نوع الملف اختيار ملفات القناة. ترك كل الخيارات الأخرى الافتراضية.
      4. انقر بيانات المسح الضوئي وحفظ إلى مجلد معين.
      5. بيانات الاستيراد في الساعة البيولوجية برامج تحليل البيانات للحصول على التهم لكل دقيقة. ملاحظة: للحصول يستخدم Clocklab برامج تحليل البيانات عادة. خيارات أخرى متوفرة أيضا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة باغت التي يسببها الفحص الحركي

Wildtype، كانتون-S، أظهرت الذباب استجابة geotactic السلبية قوية مع فقط حوالي 88٪ و 5٪ من الذباب في الأجزاء العلوية والسفلية على التوالي، من جهاز مزدوج قارورة بعد 30 ثانية (الشكل 1). أظهرت الذباب يتعرض إلى 125 ميكرومتر و 250 ميكرومتر روتينون لمدة 3 أيام في انخفاض طفيف في عدد الذباب في القسم العلوي وزيادة طفيفة في عدد ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، نحن تصف إجراءين لقياس كل من المدى الطويل تحرك عفوي وقصيرة المدى التي يسببها جفل تنقل في ذبابة الفاكهة نموذج الناجم عن روتينون من مرض باركنسون. يمكن للمرء أيضا قياس هذه الخصائص تنقل في الذباب المعرضة للعوامل الدوائية الأخرى المعروفة لنموذج باركنسون مرض مثل الباراكوات 14، النماذج الوراثية لمرض باركنسون مثل-synuclein ألفا المسوخ 15، ونماذج ذبابة أخرى من الأمراض التي تؤثر على الحركة. لكل من الأساليب، ويمكن اعتبار أساليب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر Qiuli انغ، مركز موارد اللغة، كلية كولبي، للمساعدة التقنية مع معالجة الفيديو واريك توماس، قسم الموسيقى، وكلية كولبي، لتقديم الموسيقى الخلفية. وقد أيد هذا المشروع من المنح المقدمة من المركز الوطني للبحوث الموارد، INBRE (P20RR016463-12)، المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (P20 GM103423-12)، مواطني معاهد الصحة والعلوم قسم غرانت، كلية كولبي (STA). ودعمت JL وLWM من المنح المقدمة من صندوق إجابات الصيف، كلية كولبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قوارير ضيقة قياسيةGenesee Scientific32-120
RotenoneSigmaR8875تخزينها في الفريزر ، اجعلها طازجة لكل تجربة
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SigmaD8418مذيب للروتينون
ذبابة الفاكهة الفوريةالمتوسطة Carolina Biological & nbsp ؛الصيغة 4-24
مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة (DAM)TrikineticsDAM2trikinetics.com
أنابيب DAM أنابيبTrikinetics5 × 65 مم
وصفة للروتينون + الغذاء (جرعة 125 ملم) اصنعمحلول مخزون روتينون 62.5 ملي مولار في DMSO عن طريق إذابة 25 مجم روتينون في 1 مل DMSO ؛ للحصول على جرعة 125 ملي ، أضف 10 ملي من مرق الروتينون في DMSO إلى 5 مل من الماء.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
  2. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
  3. Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
  4. Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
  5. Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
  6. St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  7. Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
  8. Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640(2011).
  9. Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  10. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  11. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
  12. Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
  13. Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
  14. Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
  15. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  16. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
  17. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  19. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة