Method Article

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

DOI:

10.3791/51629

⸱

June 9th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 2Department of Biochemistry, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 3Molecular and Cellular Neuroscience Department, The Scripps Research Institute, 4Department of Biochemistry and Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الموصوفة هنا هي إجراءات الحصول على فترات طويلة من التسجيل الحالي من قناة واحدة أيون مع تقنية التصحيح، المشبك الخلية المرفقة. يسمح هذا الأسلوب للمراقبة، في الوقت الحقيقي، ونمط التشكل قناة مفتوحة قريبة من التي تكمن وراء إشارة البيولوجية. هذه البيانات إعلام حول خصائص القناة في الأغشية البيولوجية دون عائق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيون البروتينات القناة هي أجهزة عالمية للاتصال سريعة عبر الأغشية البيولوجية. التوقيع الزمني للتدفق الأيونية أنها تولد يعتمد على الخصائص الذاتية لكل قناة البروتين وكذلك الآلية التي يتم إنشاؤها والتحكم فيه، ويمثل مجالا هاما للأبحاث الحالية. يمكن الحصول على معلومات حول الديناميات التشغيلية من البروتينات القناة الايونية من خلال مراقبة فترات طويلة من الحالية التي تنتجها جزيء واحد. الموصوفة هنا هو بروتوكول للحصول على قناة واحدة الخلية المرفقة التصحيح، المشبك التسجيلات الحالية ليجند بوابات القناة الايونية، ومستقبلات NMDA، أعرب heterologously في الخلايا HEK293 أو أصلا في الخلايا العصبية القشرية. كما أنه تقدم إرشادات حول كيفية التكيف مع أسلوب لقنوات ايون الأخرى ذات الاهتمام من خلال تقديم المثال للقناة PIEZO1 الحساسة للميكانو. هذه الطريقة يمكن توفير البيانات المتعلقة بالخصائص تصرف القناة والتسلسل الزمني لمكتب مستشار رئيس الوزراءالتشكل مغلق ن التي تشكل آلية تفعيل القناة، مما يساعد على فهم وظائفها في الصحة والمرض.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاتصالات السريعة عبر الأغشية البيولوجية تعتمد بشكل شبه حصري على من oligomeric المسام تشكيل بروتينات الغشاء، يشار إلى القنوات. هذه البروتينات تختلف على نطاق واسع في إشارات التنشيط، آليات النابضة، وخصائص تصرف. تصنف البروتينات القناة التي المسام انتقائية لأيونات كقنوات أيون؛ تفعيلها تنتج التيارات الأيونية عبر الغشاء، ويمكن تسجيل إجاباتهم مع ارتفاع القرار في الوقت الحقيقي باستخدام تقنيات الكهربية. إشارات التنشيط تمتد مجموعة واسعة من المدخلات الكيميائية والفيزيائية بما في ذلك تدرجات التركيز، القوات الميكانيكية والكهربائية، ودرجة الحرارة؛ وبالتالي، المزيد من تصنيف القنوات الأيونية في يجند بوابات، mechanosensitive، والجهد مسور، أو أنواع حساسة للحرارة. في هذه المقالة، وصفت البروتوكولات لتسجيل نشاط قناة واحدة من قناة يجند بوابات، ومستقبلات NMDA، وقناة mechanosensitive، PIEZO1، وذلك باستخدام تقنية التصحيح، المشبك.0؛

التصحيح، المشبك الكهربية هو المنهج التجريبي الأول والأكثر استخداما على نطاق واسع حساسة بما فيه الكفاية للسماح مراقبة الجزيئات واحدة 1، 2. بالإضافة إلى هذه الحساسية رائعة، وتوسعت بشكل كبير الاستعدادات البيولوجية قابلة للتسجيل الكهربية وأيضا قد سمح مراقبة القنوات الأيونية في الأغشية سليمة. أولا، لأن كلا لقط الجهد والتسجيل الحالي يتم إنجاز مع نفس القطب، ويمكن استخدامه لتسجيل إشارات عبر أغشية خلايا صغيرة أو بقع. وكشفت هذه التقنية أن القنوات الأيونية لا تقتصر على الأغشية منفعل للعضلات الضفدع، electroplaques ثعبان البحر، أو المحاور العملاقة الحبار 3، 4، بل أنها تمثل المباريات في كل مكان من آليات يشير الغشاء والمتأصلة لجميع أنواع غشاء الخلوي للأحادي أو الكائنات الحية متعددة الخلايا، وأيضا لأغشية الخلايا. استيرادantly، شريطة القدرة على تسجيل التيارات عبر الغشاء ببساطة عن طريق ربط ماصة الزجاج لخلية سليمة فرصة غير مسبوقة لتسجيل النشاط من القنوات الأيونية في الأغشية undisrupted الأصلية الخاصة بهم. وبالتالي، الخلية المرفقة تقنية التصحيح، المشبك، والتي تم وصفها في هذا البروتوكول، ويسمح برصد نشاط القنوات الأيونية بشكل مستمر لعشرات دقيقة أو أكثر في بيئتها الأصلية.

تحت التقلبات الحرارية العادية، جميع البروتينات، بما في ذلك البروتينات القناة الايونية، تغيرات هيكلية على نطاق واسع الوقت، مع الأسرع والأكثر تواترا إعادة ترتيب تمثل على الأرجح من قبل الحركات الجانبية وسلسلة التغييرات أبطأ بكثير، أقل تواترا ممثلة ضعيتها كامل المجالات أو الوحدات الفرعية، أو في بعض الحالات بواسطة التعديلات بعد متعدية أو تفاعلات البروتين البروتين 5، 6. يمكن مراقبة فترات طويلة من النشاط الناتجة عن جزيء واحد يساعد على فهم وظائفهاالديناميات التقليدية للقنوات ايون في الأغشية الفسيولوجية سليمة ويوفر معلومات قيمة حول آلية تنفيذية للجزيء لوحظ.

وعلى النقيض من فهم متزايد للتنوع القنوات الأيونية عبر أنواع الخلايا ومراحل النمو والمعرفة حول التركيب الجزيئي من القنوات الأيونية في الأغشية الأم لا تزال محدودة. جميع القنوات الأيونية هي بروتينات multimeric وغالبية القنوات الأيونية الأصلي تجميع من عدة أنواع من مفارز إنتاج البروتينات الجزيئية واسعة التنوع، والتي غالبا ما ترافق مع تصرف والنابضة خصائص متنوعة. لهذا السبب، يتم دراسة قنوات الأيونات من التركيب الجزيئي محددة على التعبير في أنظمة مغايرة. على وجه الخصوص، اكتسبت خلايا HEK293، والتي هي خط نسيلي من الخلايا الجنينية البشرية خلد الكلى 7 والقبول على نطاق واسع كنظام المفضل للتعبير مغايرة من القنوات الأيونية المؤتلف. بين الرجلمزايا ذ أن ارتقى الخلايا HEK293 كنظام خيار لقناة أيون الكهربية هي السهولة والقدرة على تحمل تكاليف زراعة والحفاظ على ثقافتها مستقرة طويلة الأمد، وقدرتهم على تنفيذ ما بعد متعدية للطي، وتجهيز والاتجار من البروتينات الثدييات، وفي كثير من الحالات ، ومستوى منخفض أو حتى غياب التعبير الذاتية للقناة من الفائدة 7، 8. معربا عن القنوات الأيونية المؤتلف ودراسة الخصائص الوظيفية في الخلايا HEK293 يزال نهجا قيما للحصول على معلومات حول خصائص هيكل وظيفة من القنوات الأيونية فضلا عن خصائص محددة من الأشكال الإسوية القناة الايونية ودورها في أنسجة الأم. البروتوكولات الموضحة في هذه المقالة يمكن تطبيقها بشكل جيد على قدم المساواة لقنوات أيون المؤتلف وأعرب في الخلايا HEK293 والقنوات الأيونية الأصلية.

وباختصار، فإن تقنية التصحيح، المشبك، من خلال قدرته غير مسبوقة لحل إشارةق من جزيء واحد لا يزال، حتى الآن، الأسلوب الأكثر مباشرة لمراقبة سلوك الجزيئات واحدة. في وضع الخلية المرفقة به، وتسجيل التصحيح، المشبك يسمح فترات المراقبة الطويلة التي، عند القيام به لجزيء واحد، يمكن أن توفر نظرة استثنائية في تشغيل القنوات الأيونية. ويرد أدناه بروتوكول للحصول على تسجيلات عالية الدقة الحالية من خلية بقع المرفقة تحتوي على واحد من البروتين القناة الايونية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الثقافة الخليوي والبروتين التعبير

  1. الحفاظ على خلايا HEK293 (آي تي سي سي عدد CRL-1573) بين المقاطع 22 و 40، والذي يتضمن فقرات يؤديها آي تي سي سي، في الثقافة أحادي الطبقة في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين الخليط في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. بين التجارب، وخلايا العبور إلى قوارير T25 في 5-20 أضعاف التخفيفات في الحجم النهائي من 10 مل. ملاحظة: استخدام الخلايا خلال هذه المقاطع يضمن صحة الخلية مواتية والتي سوف تسمح لتشكيل ختم الأمثل والاستقرار التصحيح.
  2. لترنسفكأيشن، لوحة خلايا HEK293 في 35 ملم الأطباق في كثافة ~ 10 5 خلية / طبق، والتي تتطابق إلى ~ 0.5-0.6 مل من تعليق خلية في طبق وتنمو الخلايا في 2 مل متوسطة لمدة 18-24 ساعة.
  3. في العقيمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي، وإعداد خليط ترنسفكأيشن لمدة أربعة أطباق 35 ملم وذلك بإضافة (في هذا النظام): (1) 1 ميكروغرام لكل [كدنا] (GluN1، GluN2A، وGFP)؛ (2) 315 ميكرولتر منالماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O)؛ (3) 350 ميكرولتر من 42 ملي 4 - (2-هيدروكسي)-1-piperazineethanesulfonic حمض (HEPES)، و (4) 35 ميكرولتر من 2.5 M و CaCl 2 قطرة من الحكمة، والذي يستخدم لتشكيل راسب.
  4. أنبوب دوامة لمدة 5 ثوانى وإضافة 175 ميكرولتر من تعليق ترنسفكأيشن في كل من أربعة أطباق مطلي 35 مم في اليوم السابق، والتي تحتوي على الخلايا الآن في 50-60٪ التقاء، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. نضح قبالة المتوسطة ترنسفكأيشن، ويغسل مع برنامج تلفزيوني واستبدالها مع 2 مل من النمو المتوسط ​​تستكمل مع 2 مم MgCl 2 لمنع NMDA مستقبلات بوساطة التحفيز الزائدة 9. ملاحظة: الخلايا يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات الكهربية 24-48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

2. إعداد الكهربائي

  1. 2 توليد ماصات تسجيل متناظرة عن طريق سحب على أنابيب زجاجية البورسليكات مع ساحبة العمودي. استنادا إلى حجم والهندسة من طرف الناتجة عن ذلك، مزيد من الماصات الشكلباستخدام الملمع. ملاحظة: يمكن تقييم حجم غيض بصريا وكهربائيا. بصريا، يجب أن يكون قطرها الخارجي في نطاق 1،4-5،6 ميكرون. كهربائيا، وحجم غيض الأمثل، عندما تمتلئ حل خارج الخلية، يجب أن تنتج المقاومة في نطاق MΩ 12-24 (انظر الشكل 2B).
  2. استخدام حل ماصة، والتي لخلية المرفقة تجارب يمثل الوسط خارج الخلية التي سوف تنتج النشاط قناة الأقصى وسعة الحالية المرتفعة. ملاحظة: للحصول على مستقبلات NMDA، وهذا يتوافق مع محلول يحتوي على تركيزات تشبع من منبهات (الغلوتامات والجلايسين)، 1 ملم EDTA، الذي يخلب مثبطات ثنائي التكافؤ الموجبة وحاصرات، ولديها تركيزات الفسيولوجية من الصوديوم (150 ملم) على هيئة أيون نفيذ الوحيد ( في ملي: 1 الغلوتامات، 0.1 الجلايسين، 150 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 1 EDTA، و 10 HEPBS، مخزنة في درجة الحموضة 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1).

3. المرفقة خلية تسجيل التصحيح، المشبك

  1. مفتوحة softwa الحصول على البيانات يعقوبإعادة (www.qub.buffalo.edu)، وحدد الإطار اقتناء تحت عنوان "تخطيط". فتح ملف البيانات يعقوب الجديدة (مؤسسة القذافي للتنمية) من خلال النقر على 'بيانات جديد "تحت القائمة المنسدلة بعنوان' ملف 'وأدخل المعلمات الأولية التالية: معدل أخذ العينات، 40 كيلو هرتز؛ A D التحجيم /، 3000؛ قناة الإخراج، 1؛ وA / D حجم البيانات، 2. ضبط التحجيم السعة إلى 0.1 V / السلطة الفلسطينية بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف البيانات، واختيار خصائص، ثم النقر فوق علامة التبويب "البيانات". ملاحظة: يمكن أن يتم تكريره هذه المعلمات لكل الإعداد باستخدام خلايا نموذج في وضع الخلية المرفقة. تعليمات إضافية على الحصول على البيانات مع برنامج يعقوب وخصائص QDF على الانترنت في www.qub.buffalo.edu.
  2. حدد طبق 35 ملم تحتوي على قناة أيون معربا عن الخلايا والنمو استبدال المتوسطة مع 2 مل PBS تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم؛ تركيب طبق على خشبة المسرح المجهر والتركيز على مجال الخلوية باستخدام النقيض من المرحلة المجهري لتقييم أن الخلايا يتمتعون بصحة جيدة وتعلق كذلك إلى الطبقفي أحادي الطبقة الأزياء (الشكل 1A). التبديل إلى الكشف عن مضان للتحقق من أن ترنسفكأيشن كانت ناجحة (الشكل 1B). ملاحظة: مجموعة من كثافة مضان يمكن استخدامها كإجراء الخام من البروتين التعبير.
  3. لتسجيل قناة واحدة، تعيين مكبر للصوت مكاسب الإخراج إلى X10، التكوين التصحيح لβ = 1، مرشح التناظرية إلى 10 كيلو هرتز، ووضع لالجهد المشبك والجهد لتطبيقها +100 بالسيارات. مع الأمر عقد الجهد في وضع OFF، حدد زر 'اختبار ختم'.
  4. استنادا إلى مضان والصحة الخلية، واختيار خلية لرأب الصدع. تحقق في إطار المرحلة المقابل أن الخلية يتم إرفاق كذلك إلى الطبق، لديه جزء كبير من سطح الخلية تتعرض للترميم، ويبدو على خلاف ذلك في صحة جيدة. ملاحظة: الحفاظ على النقيض من المرحلة الإضاءة لتجنب تبيض الخلية خلال نهج والتصحيح لقط.
  5. ملء ماصة مصقول طازجة مع حل عادل بما فيه الكفاية بحيث أنه يجعل الاتصال مع electrodه ويهز بلطف لإخراج فقاعات الهواء التي قد يكون محاصرا في الطرف. تأمين تسجيل ماصة على headstage مكبر للصوت من خلال تشديد المسمار ختم حامل ماصة والتأكد من أن الأسلاك الفضية ومنغمسين في حل ماصة.
  6. باستخدام صغيرة (5 سم) حقنة بلاستيكية، وهذا مرتبط إلى حامل ماصة عن طريق الأنابيب، وتطبيق الضغط الايجابي بلطف لمنع الشوائب من الدخول وانسداد غيض خلال النهج (الشكل 2A).
  7. باستخدام مياداة مجهرية، توجيه ماصة في حمام وضعه مباشرة فوق الخلية المحددة لترميم (الشكل 1C)، وإغلاق الدائرة الكهربائية. يحيط علما الذبذبات، والتي ينبغي أن تشير إلى وجود الموجي مستطيلة المقابلة لمكبر للصوت في إشارة ختم اختبار (الشكل 2B). ملاحظة: عند دخول الحمام، والمقاومة ماصة ضمن النطاق الأمثل هو 12-24 MΩ. لاختبار إشارة بالسيارات 5، ص الحالي تقاسآنج يتوافق مع ~ 20-40 السلطة الفلسطينية.
  8. في حين رصد موقف ماصة بصريا من خلال المجهر وماصة المقاومة كهربائيا على الذبذبات، ومواصلة النهج بزيادات صغيرة حتى يصطدم ماصة بلطف على الخلية، وإشارة الاختبار يقلل قليلا للإشارة إلى زيادة المقاومة (الشكل 2B).
  9. على شكل خاتم، والتقاط حقنة وتطبيق ضغط سلبي طفيف خلال أنابيب الجانبي عن طريق سحب المكبس المحاقن، والتي تسحب الغشاء الخلوي إلى غيض من ماصة تسجيل ويبدأ تشكيل ختم GΩ المقاومة 10. يحيط علما إشارة الموجي الاختبار على الذبذبات، والتي يشار تشكيل الختم بواسطة تسطيح التام، مع العابرين فقط بالسعة مرئية (الشكل 2B). ملاحظة: في حالة عدم إشارة تتسطح تماما أو يصبح الأساس صاخبة، وهذا يشير إلى وجود ختم ضعيفة مع تسرب الحالية كبيرة حول الختم. هذا سيمنع صesolving احد التيارات القناة. إذا كان هذا هو الحال، سحب ماصة من الخلية وبعيدا عن الحمام، وإزالته من مرحلة الرأس وتجاهل ذلك. كرر العملية مع ماصة مصقول طازجة حتى الحصول على ختم في مجموعة كافية (≥ 1 GΩ).
  10. على مكبر للصوت، والتبديل تبديل الأوامر الخارجية من 'اختبار ختم' إلى 'قبالة'؛ التبديل الأمر الجهد لعقد الإيجابية (التي كانت مقررة سابقا ل'قبالة')؛ وزيادة الربح لX100. مراقبة الذبذبات للنشاط القناة، والذي، إذا كان موجودا، كما سيتم عرض الانحرافات التصاعدي مربع من خط الأساس شقة في السابق (الشكل 2C).
  11. إذا تم عرض النشاط قناة على الذبذبات، والحصول على البيانات في الملفات الرقمية التي تم فتحها سابقا في يعقوب، عن طريق الضغط على زر 'اللعب' متبوعا على زر 'سجل'. لوقف الحصول على البيانات، اضغط على زر التوقف في يعقوب، وحفظ الملف QDF إلى retriev بسهولةموقع قادرا على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر عن طريق تحديد "حفظ بيانات باسم ..." في القائمة المنسدلة بعنوان 'ملف'.

4. البيانات وتجهيزها بالتمجيد

ملاحظة: يمكن استخراج معلومات هامة من تسجيلات قناة واحدة عن طريق التحليلات الإحصائية التي يعين كل نقطة البيانات إلى الطبقة تصرف المناسب (في أبسط الحالات، مغلقة أو مفتوحة). ويشار إلى هذه العملية كما بالتمجيد البيانات وصفا موجزا للبالتمجيد البيانات بالوسائل ك قطعي (SKM) يوصف أسلوب 11 في يعقوب أدناه.

  1. فتح ملف البيانات في يعقوب، وعرض آثار الحالية في 'ما قبل' واجهة تحت عنوان "تخطيط". عرض الملف المسجل غير المرشحة (إزالة فلتر رقمي) عن طريق إلغاء تحديد المربع المسمى "التيسير".
  2. بصريا مسح السجل على الفور المخالفات والتحف (الشكل 4A). المسامير الحالية وجيزة الصحيح أن occuص ضمن التتبع (الشكل 4A) عن طريق اختيار منطقة نظيفة المجاورة من نفس الفئة تصرف، تسليط الضوء على هذه المنطقة، النقر بزر الماوس الأيمن واختيار 'مجموعة عازلة محو ". التكبير في الارتفاع حتى نقطة عينة الفردية مرئية، تحديد المنطقة لتحل محلها ومحو خلال تسليط الضوء على هذه المنطقة فقط ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق 'محو'.
  3. تحديد خط الأساس الحالية الصفر للسجل كامل عن طريق اختيار الجزء المبكر من السجل حيث الأساس مستقرة، وتسليط الضوء انقر بزر الماوس الأيمن فوق وحدد "تعيين خط الأساس '. تحقق من أن المبدأ التوجيهي الذي يظهر بدقة يمثل مستوى خط الأساس (البنفسجية في الشكل 4B)
  4. تحديد نقاط في السجل حيث ينحرف خط الأساس البيانات الخام بشكل واضح من خط الأساس مجموعة. تصحيح هذا عن طريق اختيار جزء صغير من خط الأساس في المنطقة الانحراف، انقر بزر الماوس الأيمن واختر الأمر "إضافة عقدة خط الأساس '.
  5. تحديد مناطق رانه يحتوي على تسجيل الضوضاء الزائدة أو القطع الأثرية التي لا يمكن تصحيحها بسهولة (الشكل 4C). تسليط الضوء على المنطقة المراد التخلص منها، انقر بزر الماوس الأيمن، ثم اختر "حذف". ملاحظة: في هذه الحالة سوف يتم فقدان المعلومات الحركية: سوف السجل معالجتها تكون أقصر وسوف تحدث نقطة بعد نقطة لصق يبدو أن تكون مستمرة مع المنطقة قبل الضوضاء.
  6. ليمجد السجلات باستخدام خوارزمية SKM 11، تسليط الضوء على جزء من التتبع التي تحتوي المفتوحة والمغلقة على حد سواء الأحداث ودخول إلى واجهة 'وزارة الدفاع' أسفل 'تخطيط'. في لوحة "نموذج"، تسليط الضوء على جزء نظيف من التتبع التي هو ممثل من خط الأساس في جميع أنحاء الملف، بزر الماوس الأيمن فوق مربع أسود (دولة مغلقة) وحدد "انتزاع". نفعل نفس الشيء بالنسبة فتحات القناة من خلال تسليط الضوء على تصرف مفتوحة، انقر بزر الماوس الأيمن على المربع الأحمر في لوحة "النموذج" وحدد "انتزاع".
  7. أداء idealizaنشوئها عن السجل بأكمله عن طريق اختيار زر 'ملف' تحت عنوان 'مصدر البيانات ". انقر بزر الماوس الأيمن على علامة التبويب "يمجد" تحت قسم "النمذجة" للتحقق من أن المعلمات المطلوبة للتحليل صحيحة، ثم انقر فوق "تشغيل". نتيجة بالتمجيد، جنبا إلى جنب مع الرسم البياني لسعة الملف بأكمله، ومضافين مع البيانات للسماح للتفتيش البصري للبالتمجيد (الشكل 5). ملاحظة: قد يؤدي عدم كفاية بالتمجيد لتوليد 'أحداث كاذبة،' التي يعقوب بالكشف عن فتحات قناة والإغلاق التي لا تحدث في الواقع. ضمن قرار تسجيل، وهو يحدد من قبل مرشح التناظرية مكبر للصوت ومعدل أخذ العينات، والقرار الذي SKM بالكشف عن الأحداث المفتوحة والمغلقة يمكن التحكم عن طريق تحديد وقت ميت لالتحليلات. يجب تحديد الأوقات القتلى الأمثل عن طريق التجربة والخطأ، وسوف تعتمد على معدل أخذ العينات، ومع ذلك، هناك قاعدة جيدة من التجربة هولتحديد وقت الميتة التي هي 2-3 عينات 12.
  8. للتحقق من أن بالتمجيد يمثل بدقة البيانات الخام، ومسح أثر المثالية يدويا. على تحديد الأخطاء في بالتمجيد، وتسليط الضوء على تتبع الحدث كاذبة، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "المختبر الدولي للألماس تاريخ". ملاحظة: للحصول على خيارات إضافية وشرحا مفصلا لمختلف الأوامر والوظائف في يعقوب، والتشاور مع يعقوب دليل على الانترنت (www.qub.buffalo.edu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤتلف NMDA المستقبلات

مستقبلات NMDA ربط والاستجابة لعمل ما يصاحب ذلك من رئيسان منبهات: الغلوتامات والجلايسين. كما أنها تجميع heterotetramers اثنين من الجلايسين ملزمة مفارز GluN1 واثنين من الغلوتامات ملزمة مفارز GluN2. يتم ترميز مفارز GluN2 أربعة جينات (م) وهذه الأشكال الأكثر كتب على نطاق واسع في الدماغ هي GluN2A في الكبار وGluN2B في الحيوانات الأحداث. بسبب تنوع الأنواع الفرعية NMDA مستقبلات في ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في مجال القناة الايونية، وتكرس مجال هام من مجالات البحوث لفهم تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى توجيه أو آلية النابضة افتتاح القناة. بالنسبة لمعظم القنوات، وهذه العملية هي عملية معقدة وتنطوي على عدة خطوات الحركية التي لا يمكن استنتاجها من العيانية إشارة متعدد القنوات. في المقابل، يمكن تصميم التجارب حيث مراقبة تسلسل الأحداث مفتوحة / مغلقة في سجل قناة واحدة يمكن أن تنتج معلومات أكثر تفصيلا حول آليات النابضة. في الأساليب المذكورة هنا، وتقع خارجيا يجند ملزم المجال التي تمتلكها مستقبلات NMDA...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واضعو هذه المخطوطة تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل F31NS086765 (KAC)، F31NS076235 (MAP)، وR01 NS052669 (GKP) وEIA9100012. المؤلفين أشكر ايلين Kasperek للحصول على الخبرة والمساعدة مع البيولوجيا الجزيئية وزراعة الأنسجة؛ وجايسون مايرز لتبادل البيانات التي تم الحصول عليها في وقت مبكر من الخلايا العصبية القشرية الفص الجبهي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
المواد الكيميائيةسيجمامختلف
زجاج بوروسيليكاتسوترBF-150-86-10
مجهر مقلوب المجال الساطعأوليمبوس1x51نيكون لديها أيضا مجاهر مماثلة
صندوق فلوروسنتX-citeسلسلة 120
دليل الضوء السائلX-citeOEX-LG15
MicromanipulatorSutter InstrumentsMP-225
راسم الذبذباتTektronixTDS1001
مكبرللصوت الأجهزة الجزيئيةAxon Axopatch 200B
TableTMC63561
بطاقة NIDAQالأدوات الوطنية776844-01
مجتذبNarishigePC-10
الملمعNarishigeMicroforge MF-830
Faraday CageTMC8133306
مشبك الضغط عاليALA الأدوات العلميةALA HSPC
Pressue / Vaccuum PumpALA Scientific InstrumentsALA PV-PUMPل HSPC-1
السرعة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  3. Piccolino, M. Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani. Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).
  4. Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain. Neuron. 25, (2000).
  5. Popescu, G. K. Modes of glutamate receptor gating. The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).
  6. Morimoto-Tomita, M., et al. Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction. Neuron. 61, 101-112 (2009).
  7. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
  8. Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. Enhancing protein expression in single HEK 293 cells. Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).
  9. Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line. Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).
  10. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).
  11. Qin, F. Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling. Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).
  12. Colquhoun, D., Sigworth, F. J. chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , Plenum Press. (1995).
  13. Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
  14. Colquhoun, D., Hawkes, A. G. Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).
  15. Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).
  16. Amico-Ruvio, S., Popescu, G. Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches. Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).
  17. Borschel, W. F., et al. Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors. J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).
  18. Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants. The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).
  19. Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).
  20. Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
  21. Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation. Nature. 430, 790-793 (2004).
  22. Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. Gating Modes in AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).
  23. Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors. Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).
  24. Smith, T. C., Wang, L. -Y., Howe, J. R. Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).
  25. Coste, B., et al. Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels. Science. 330, 55-60 (2010).
  26. Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483, 176-181 (2012).
  27. Benndorf, K. chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , Plenum Press. (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell attached Patch clampSingle Channel RecordingIon Channel ProteinsNMDA ReceptorPIEZO1 ChannelHEK293 CellsCortical NeuronsVoltage ClampQUB Data AcquisitionFire Polished Pipette

Related Articles