مقالة منهجية

A طريقة Permeabilization من ذبابة الفاكهة الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر

DOI:

10.3791/51634

⸱

يوليو 13, 2014

1Department of Environmental Medicine, University of Rochester School of Dentistry and Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إدخال جزيئات صغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين تقدم إمكانية كبيرة للتميز النشاط البيولوجي لمركبات جديدة، والمخدرات، والسموم، وكذلك لبحث مسارات التنموية الأساسية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة الخطوط العريضة الخطوات التي تغلب على الحواجز الطبيعية لهذا النهج، وتوسيع المنفعة من طراز الجنين ذبابة الفاكهة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان الجنين ذبابة الفاكهة طويلة نموذجا مختبر قوية لتوضيح الآليات الجزيئية والجينية التي تتحكم في التنمية. سهولة التلاعب الجيني مع هذا النموذج قد حل محل النهج الدوائية التي هي شائعة في النماذج الحيوانية الأخرى والمقايسات خلية مقرها. نحن هنا تصف التطورات الحديثة في البروتوكول الذي يتيح تطبيق الجزيئات الصغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين. تفاصيل طريقة الخطوات للتغلب على الكتامة من قشر البيض مع الحفاظ على سلامة الجنين. ويتحقق قشر البيض permeabilization عبر مجموعة واسعة من مراحل النمو عن طريق تطبيق الموصوفة سابقا د الليمونين الجنين permeabilization المذيبات (EPS 1) والشيخوخة الأجنة في انخفاض درجة الحرارة (18 درجة مئوية) قبل العلاج. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استخدام صبغة حمراء بعيدة (CY5) كمؤشر permeabilization، وهو متوافق مع تطبيقات المصب التي تشمل انفلونزا الحمراء والخضراء القياسيةالأصباغ orescent في الأعمال التحضيرية الحية والثابتة. هذا البروتوكول تنطبق على الدراسات التي تستخدم المركبات النشطة بيولوجيا لبحث آليات التنموية فضلا عن الدراسات التي تهدف إلى تقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستمر الجنين ذبابة الفاكهة ليكون نموذجا رئيس الوزراء للتحقيق في الآليات الأساسية للتنمية 2. يتم اعتماد هذا النموذج قوية من قبل مجموعة واسعة من الأدوات الجينية الجزيئية التي تسمح التلاعب من الأساس أي الجينات في أي نقطة زمنية وضمن أي جهاز النامية. حجم صغير، والتطور السريع، وتوصيف واسعة من التشكل الجنين ذبابة الفاكهة جعله نموذجا للاختيار للشاشات الوراثية، وكثير منها قد كشفت مسارات التنموية الأساسية 3،4. وقد اتسمت العديد من الظواهر في الجنين ذبابة الفاكهة والتأويل هي بسهولة، وغالبا ما توفر وسيلة لتحديد الآليات الوراثية الجزيئية الكامنة وراء مسؤولة عن سمة غير طبيعية.

تاريخيا، كان أحد أوجه القصور في نموذج جنين ذبابة صعوبة إدخال جزيئات صغيرة إلى الأنسجة الجنينية. لقد طرحت هذه العقبة القيود على: 1) لناجي النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة المعروفة باسم تحقيقات لاستجواب الآليات التنموية و2) باستخدام هذا النموذج الذي أنشئ لتقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized. نتيجة لذلك، لم تستغل استغلالا كافيا إمكانية فحص الجنين ذبابة في توصيف النشاط جزيء صغير.

تسليم الجزيئات الصغيرة إلى الجنين ذبابة يمكن أن يتحقق مع طريقتين: 1) permeabilization من قشر البيض و2) حقن مكروي. تقدم هذه المقالة التقدم لطريقة permeabilization التي هي سهلة لتنفيذ في إعداد مختبر ذبابة الفاكهة التقليدية. تجدر الإشارة إلى أن التطورات الحديثة في طرق حقن مكروي مع التكنولوجيا على microfluidics تساهم أيضا إلى أساليب إدخال المركبات إلى 5،6 الجنين. إدخال جزيئات إلى الجنين والوقاية منها عن طريق طبقة شمعية من قشر البيض 7. يتكون قشر البيض ذبابة الفاكهة من خمس طبقات. منالداخل الى الخارج وهم: الغشاء المحي، وطبقة شمعية، وطبقة المشيمية الداخلية، وباطنة المشيماء ومشيماء أديمية ظاهرة 8. يمكن إزالة طبقات المشيمي الخارجي الثلاثة الطلوع وجيزة من الجنين في تمييع التبييض، ويشار إليها باسم خطوة dechorionation. ويمكن بعد ذلك للخطر طبقة شمعية كشفها بواسطة التعرض للمذيبات العضوية، مثل هيبتان واوكتان 7،9، مما يجعل الجنين dechorionated قابلة للاختراق، في حين لا يزال المغطى في الغشاء المحي الأساسية. ومع ذلك، واستخدام هذه المذيبات يدخل المضاعفات الناجمة عن سميتها وصعوبة في تنظيم عملها permeabilizing قوية، وكلاهما له آثار سلبية على سلامة الجنين صارخ 9،10.

وثمة طريقة permeabilization باستخدام تكوين الجنين يطلق permeabilization المذيبات (EPS) التي سبق وصفها 1. يتكون هذا المذيب من د الليمونين والمشتقة من النباتات، التي تمكن السطحي المذيب لتكون misciblالبريد مع مخازن مائي. سمية منخفضة من د الليمونين والقدرة على تمييع المذيبات لتركيزات المطلوب قد حقق وسيلة فعالة لتوليد أجنة قابلة للاختراق مع قابلية عالية 1. ومع ذلك، فقد استمرت اثنين من العوامل الذاتية لتحقيق القيود على التطبيق. الأولى، إثبات عدم التجانس الأجنة في نفاذية بعد العلاج EPS، حتى عندما يتم الحرص على الحفاظ على التدريج التنموية وثيق. الثانية والأجنة أثبتت مضى عليها أكثر من ثماني ساعات تقريبا الصعب permeabilize، بما يتفق مع تصلب قشر البيض الذي يحدث بعد وضع البيض 11.

الموصوفة هنا هي التقدم في طريقة EPS ما يلي: 1) المساعدة في تحديد وتحليل الأجنة permeabilized شبه مماثل، حتى بعد تنفيذ الخطوات التثبيت والمناعية و2) تمكين permeabilization الأجنة في وقت متأخر من النقاط الزمنية التنموية (> 8 ساعة، المرحلة 12 وما فوق). على وجه التحديد، وتطبيق صبغة الحمراء بعيدة،حمض الكربوكسيلية CY5، يوصف يخدم كمؤشر النفاذية، والتي استمرت في الجنين خلال تطوير والفورمالديهايد بعد التثبيت. بالإضافة إلى ذلك، وتبين أن تربية الأجنة عند 18 درجة مئوية يحافظ على قشر البيض في حالة حساسة EPS، وتمكين permeabilization الأجنة في المراحل المتأخرة (12-16 المراحل).

هذه التطورات التغلب على القيود التي سبق ذكرها للمنهجية EPS. وبالتالي فإن هذا التطبيق توفير المحققين مع وسيلة لإدخال جزيئات صغيرة من الفائدة إلى الجنين في نقاط متميزة الوقت التنموية مع الحفاظ على قدرتها على البقاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير للثقافات يطير، حلول وأجهزة المناولة الأجنة

  1. إعداد الأقفاص من ذبابة الفاكهة. وضع 500 + الذباب التزاوج من سلالة المطلوب في قفص السكان مزودة 10 سم لوحة آغار العنب وبقعة من معجون الخميرة. الحفاظ على الثقافة في حاضنة تسيطر 25 درجة مئوية الرطوبة. ملاحظة:   الثقافات القفص تتطلب يوم او يومين من تكييف للحصول على جنين زرع أنماط متناسقة. يتم تغيير لوحات العنب مع عجينة الخميرة مرة واحدة في الصباح ومرة ​​في المساء خلال تكييف.
  2. إعداد EPS. حلول الدافئة السطحي (كوكاميد DEA والكحول سلس) في 37 درجة مئوية. ماصة 18 مل من د الليمونين إلى قارورة زجاجية التلألؤ مجهزة بقضيب الصغيرة. ماصة 1 مل كل من اثنين السطحي (5٪ تركيز النهائي من كل منهما) إلى د الليمونين. تخلط جيدا وإزالة بقضيب. ملاحظة: هذا الحل الأسهم EPS من هو جيد لحوالي 2 أشهر في درجة حرارة الغرفة. الحليجب أن تكون درجة حرارة عند 37 درجة مئوية وملتف إلى ذوبان كامل السطحي قبل استخدامها. يجب أن يتم تخزين EPS ود الليمونين في وعاء زجاجي لأنها سوف تذوب بعض المواد البلاستيكية على مر الزمن.
  3. إعداد حل الجنين dechorionation، وسائل الحضانة، وصبغ والحلول المخدرات. خلط 25 مل من التبييض مع 25 مل H 2 O ووضعه في طبق ضحل. إعداد تعديل المتوسطة الأساسية الحضانة (MBIM) وMBIM-T وفقا لصفة قبل 1،12. إعداد شيلدز وسانغ M3 خلية مستنبت وبرنامج تلفزيوني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر قائمة المواد). إعداد محلول المخزون من permeabilization الصبغة في 10 ملي التركيز في DMSO.
  4. تجميع الأجهزة الجنين للمناولة واللوازم:
    1. إعداد dechorionation وسلة العلاج EPS (انظر الشكل 1A). قطعت قسما 3 سم من المتاح البولي بروبلين 50 مل الطرد المركزي / الثقافة أنبوب مع منشار ذو أسنان غرامة. جعل دافق سطح اللحام عن طريق فرك قسم أنبوب على الالتزام الصنفرةعلى سطح الفوق. لحام المقطع أنبوب لNitex شبكة من النايلون من قبل ذوبان حافة الباب أنبوب فوق لهب والملحة إلى شبكة على لوحة زجاجية. السماح لتبرد وتقليم قبالة شبكة إضافية. ملاحظة: ان الجانبين الهائل وأسفل تسمح الشطف السريع والكامل الخروج من التبييض المتبقية وEPS في الخطوات منها. وينبغي القيام بالخطوات اللحام تحت غطاء الدخان.
    2. إعداد سلة التنمية. قطع الجزء العلوي من أجهزة الطرد المركزي 50 مل / الثقافة أنبوب تدفق مع حافة الغطاء. إزالة وتعديل الحد الأقصى عن طريق الاستغناء عن افتتاح المركزية والشقوق على طول الحافة كما هو مبين في الشكل 1B. المسمار الغطاء على شبكة وعلى المواضيع من قطع أنبوب الباب وتقليم شبكة إضافية. ملاحظة: غطاء يحتوي على الشقوق في حافة تسمح نشرها إلى متوسطة الأكبر عند وضعه في خزان صحن 60 ملم (الشكل 1B).
    3. إعداد مكونات غرفة الشريحة. قطع مربع من الغشاء DO أكبر منغرفة فتح الشريحة. تطبيق طبقة رقيقة جدا من الشحوم فراغ إلى الشفة داخل فتح. يلصق غشاء DO في افتتاح ختم ضد الشحوم مع عصابة التجنيب. تقليم الغشاء DO الزائدة عن طريق خفض إعادته بالقرب من الدائري التجنيب. ملاحظة: مواصفات غرفة الشريحة يمكن العثور عليها في Kiehart 13 آخرون هذه الغرفة ليست متاحة تجاريا ويتطلب تصنيع مخصصة من قبل ورشة ميكانيكا.

2. السقالات وDechorionation، والعلاج EPS من الأجنة

  1. التدريج الأجنة عن طريق جمع في الوقت المناسب. ضبط لوحة العنب / الخميرة الطازجة إلى الأقفاص ذبابة في AM. تسمح الأجنة لتكون وضعت لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. تجاهل هذه اللوحة واستبدالها مع لوحة العنب / الخميرة الطازجة لزرع الجنين اللاحقة من 2 ساعة على 25 درجة مئوية. جمع هذه اللوحة والمكان في 18 درجة مئوية حاضنة لمزيد من التدريج التنموية. ملاحظة: 1 ساعات التنمية في 25 ° C يساوي 2 ساعة للتنميةفي 18 درجة مئوية. ويمكن رؤية تأثير الشيخوخة عند 18 درجة مئوية مقابل 25 درجة مئوية على الحفاظ على permeabilization EPS في الأجنة مرحلة متأخرة في الشكل 2.
  2. Dechorionation. شطف بلطف الأجنة الخروج من لوحة العنب في سلة وشبكة باستخدام 25 ° C ماء الصنبور والفرشاة. شطف الخميرة الزائدة بعيدا عن الأجنة في سلة تحت تيار لطيف من ماء الصنبور. تزج في سلة 50٪ التبييض لمدة 2 دقيقة. غسل الأجنة بدقة تحت تيار من مياه الصنبور. ملاحظة: بخ بلطف محلول التبييض على أجنة بشكل متقطع باستخدام ماصة بلاستيكية. بينما 2 دقيقة وعادة ما يكفي لdechorionation كاملة، يجب فحص هذه المرة الحضانة عن طريق الفحص المباشر وتبعا لذلك. الحفاظ على الأجنة dechorionated في سلة مغمورة في مياه الحنفية والشروع فورا في خطوة EPS.
  3. علاج EPS
    1. إعداد ستة أطباق 60 ملم مع حوالي 10 مل من برنامج تلفزيوني في كل منهما. إعداد التخفيف عن طريق إذابة EPS 75 EPS ميكرولتر في 2.925 مل MBIM (1:40) في دورق 50 مل الزجاج مع دوامات. ملاحظة: A أشكال مستحلب الأبيض من هذا الخليط.
    2. وصمة عار المياه الزائدة من أسفل السلة مع شبكة مختبر قضاء. تزج في سلة EPS المخفف في كوب ودوامة فورا لتفريق الأجنة في حل EPS في أسفل السلة. تواصل يحوم الحركة لمدة 30 ثانية. ملاحظة: التخفيفات EPS ومرات التعرض يمكن أن تختلف على السيطرة النفاذية. فمن المستحسن أن التخفيفات EPS الأمثل ومرات العلاج تنشأ تجريبيا مع سلالات الذباب المستخدمة. زيادة وقت التعرض إلى 60-90 ثانية مواتية لمرحلة 12 و الأجنة السن.
    3. إزالة سلة، وصمة عار بعيدا EPS الزائدة مع مختبر قضاء. المضي قدما مع ست يغسل متتابعة في 10 مل من برنامج تلفزيوني في أطباق 60 ملم. استخدام ماصة بلاستيكية لبخ بلطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني في كل من ستة يغسل. المضي قدما لصبغ وخطوات العلاج من تعاطي المخدرات. ملاحظة: EPS يمكن التخلص من أسفل الحوض.

3. صبغ والدواء علاج Permeabilized الأجنة

  1. صبغ العلاج
    1. إضافة 5 ميكرولتر من 10 ملي CY5 الكربوكسيلية حمض صبغ * إلى 1 مل من MBIM-T (50 ميكرومتر تركيز النهائي) في أنبوب 1.5 مل microfuge ودوامة لخلط. ملاحظة: * اختيار الصبغة يعتمد على تحليل المصب. حمض الكربوكسيلية CY5 فعالة للتحليلات لاحقة باستخدام التثبيت والمناعية. رودامين B مفيد لتحليل الأجنة الحية. انبعاث الحمراء رودامين B، والانبعاثات الخضراء من عناصره 1، يمكن تقديم بعض التعقيدات مع تطبيقات المصب باستخدام مضان. المخدرات أو السم يمكن أن تضاف إلى محلول الصبغة لبدء العلاج في هذه المرحلة، أو للحد من العلاج من تعاطي المخدرات / السم لنبضة في هذه المرحلة. ينبغي توخي الحذر في التعامل معها والتخلص من المخدرات والسموم وفقا لمعايير السلامة MSDS والبيئية.
    2. نقل الأجنة من سلة شبكة لمحلول الصبغة باستخدام الفرشاة. غطاء الأنبوب وعكس بشكل متكرر لضمانالأجنة تطفو بحرية في تعليق في محلول الصبغة. وضع أنبوب على الكرسي الهزاز الإيماء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. إزالة أنبوب من nutator والسماح الأجنة تسوية. إزالة محلول الصبغة مع ماصة غرامة واستبدالها مع 1 مل من MBIM-T لغسل. عكس أنبوب لاعادة تعليق أجنة تماما. دعونا الأجنة تسوية وكرر مع ثلاثة يغسل MBIM-T. إزالة كافة MBIM-T من شطف النهائي، والشروع في الخطوة الحضانة.
  2. الحضانة للتنمية الأجنة
    1. نقل الأجنة إلى واحدة من مجلسين: سلة التطوير أو غرفة الشريحة. ملاحظة: يفضل سلة التنمية لفترات أطول التنموية، ومطلوب إذا تثبيت والمناعية الخطوات اللاحقة ليتم تنفيذها. غرفة الشريحة هو الأمثل لدقة أعلى الوقت الفاصل بين التصوير والأكثر فعالية لفترات قصيرة التنموية (على سبيل المثال، فإن الأحداث الجنينية المبكرة). المخدرات أو السم يمكن أن تضاف إلى متوسطة على مختلف تركيزات والجنين ديمكن رصد التطور، في الوقت الحقيقي مع أجنة حية أو في نقطة النهاية باستخدام التثبيت القياسية والمناعية البروتوكولات.
    2. التنمية في سلال
      1. تنظيف سلة التنمية من خلال التدفق مع الايثانول 70٪، وشطف جيدا مع غير المتأينة المياه وصمة عار الجافة مع مختبر قضاء. إعداد 6 مل من الحضانة المتوسطة مع التركيز المطلوب من المخدرات أو السم. وضع سلة التنمية في المتوسط ​​60 ملم في أخذ الطبق الحرص على عدم اعتراض فقاعات الهواء تحت قاعدة شبكة. ملاحظة: يتم استخدام اثنين من وسائل الإعلام شيوعا: MBIM وحده، أو MBIM/M3 في 50:50 الخليط، وهذا الأخير هو أكثر فعالية لفترات أطول التنمية.
      2. نقل الأجنة permeabilized لشبكة السطحية في قاعدة سلة مع الفرشاة. بخ بلطف الأجنة مع وسائل الاعلام من الخزان المحيطة بها. تفريق الأجنة مع الفرشاة بحيث تكون في أحادي الطبقة على شبكة. ملاحظة: الشروع في التصوير المجهري وتقييم الجدوى permeabilization وخصائص العلاقات العامةeparation (راجع الخطوة 4).
    3. التنمية في غرفة الشرائح
      1. عكس غرفة الشريحة وتطبيق حبة صغيرة من الشحوم فراغ على محيط الافتتاح. وضع 150 ميكرولتر من المتوسطة مع المبلغ المطلوب من المخدرات أو السامة على سطح غشاء DO داخل فتح. ملاحظة: يتم استخدام اثنين من وسائل الإعلام شيوعا: MBIM وحده، أو MBIM/M3 في 50:50 الخليط، وهذا الأخير هو أكثر فعالية لفترات أطول التنمية.
      2. نقل الأجنة permeabilized إلى تراجع وسائل الإعلام مع الفرشاة. تفريق الأجنة جعلها تستقر على الغشاء داخل قطرة.
      3. تطبيق بعناية ساترة 25 مم دائريا فوق افتتاح بالتالي تسطيح المتوسط. اضغط برفق على طول محيط ساترة على شكل خاتم مع الشحوم. ملاحظة: الشروع في التصوير المجهري لتقييم الجدوى permeabilization وخصائص إعداد (راجع الخطوة 4).

4. Identification من Permeabilized الأجنة قابلة للحياة

  1. تحديد الأجنة permeabilized. مراقبة الأجنة تحت المجهر epifluorescence مع مجهزة بكاميرا رقمية. الحصول على صور (في الموجة الزرقاء لتحديد الملف الشخصى صفار تألق ذاتي) من عدة حقول باستخدام المجهر الثابتة وإعدادات الكاميرا.
  2. تحديد permeabilization الأجنة على أساس كثافة مضان النسبي. استخدام stereomicroscope مع مسافة عمل كبيرة لاستيعاب سلة والسماح التلاعب في الأجنة. يجب أن تكون مجهزة المجهر مع مرحلة XYZ برمجة، epifluorescence إضاءة وكاميرا رقمية. الصورة الأجنة مع الحرص على تسجيل التعرض والمعلمات موقف المرحلة من كل صورة الجنين لتمكين إعادة تقييم نفس الأجنة في نقطة وقت لاحق (انظر نتيجة ممثل في الشكل 3). ملاحظة: سوف أنماط امتصاص الصبغة تختلف تبعا الصبغة المستخدمة، وطول العمر والتعرض الجنين. هناك مجموعة واسعةامتصاص الصبغة عبر إعداد واحد هو نموذجي ويعكس الاختلاف في درجة permeabilization.
  3. تحديد الأجنة قابلة للحياة. بعد وسم موقف الأجنة permeabilized، متابعة تطور الجنين في درجة حرارة الغرفة أو 25 درجة مئوية. العودة سلة أو غرفة الشريحة إلى المجهر. مراقبة تحت الأزرق قناة مضان والحصول على صورة من تألق ذاتي صفار في الأجنة التي تم تحديدها سابقا permeabilized. تقييم الجدوى وفقا لتطور الطبيعي للتوزيع صفار (انظر راند وآخرون (1) ونتيجة ممثل في الشكل 3). ملاحظة: معالم شكلية أخرى من الجنين لاحظ مع brightfield المجهري يمكن استخدامها لتقييم الجدوى. فمن المستحسن أن تحديد مستوى النفاذية والتي تتوافق مع قابلية أن تحدد تجريبيا مع كل صبغة وسلالة من ذبابة المستخدمة.
  4. تقييم آثار المخدرات أو السموم في أجنة قابلة للحياة permeabilized.
  5. الأجنة اإلجراءاتssed مع تستعد البروتوكول أعلاه لعدد من التحليلات التقليدية لاحقة إلى المخدرات أو التعرض للسموم. وتعتبر العديد من أنواع مختلفة من التحليلات في مناقشة أدناه وتشمل الملاحظة المباشرة من التشكل في الأجنة الحية وكذلك يحلل آخر تثبيت-المناعية. يتم تحسين كلا من هذين النهجين باستخدام الأصباغ الحيوية (مثل GFP) التي تكشف عن أنماط التعبير الجيني والنسب الخلية وملامح التشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التعامل مع الأجهزة في الصورة الجنين في الشكل رقم 1 للمساعدة في تصور الأجهزة "محلية الصنع" للتلاعب في البروتوكولين أعلاه. النتائج رأينا في الشكل 2 يوضح تأثير قوي من تربية الأجنة عند 18 درجة مئوية على قدرتها على أن permeabilized بواسطة EPS في مراحل متأخرة من التنمية. يتم تطبيق هذا الشرط في الخطوة بروتوكول 2.1. وينظر فعالية حمض صبغ CY5 الكربوكسيلية للكشف عن مستويات مختلفة من نفاذية ينظر عادة في EPS الأجنة المعالجة في الشكل 3. وين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد الأسلوب أعلاه وسيلة الحصول على أجنة قابلة للحياة ذبابة الفاكهة التي هي في متناول العلاجات جزيء صغير عبر مجموعة واسعة التنموية. هذا الأسلوب يقدم الرواية والاستنتاج بسيط هو أن الشيخوخة الأجنة عند 18 درجة مئوية تمكن permeabilization الأجنة مرحلة متأخرة مع نفس فعالية كما رأينا سابقا فقط في الأجنة مرحلة مبكرة. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت استخدام CY5 الصبغة الحمراء بعيدة حمض الكربوكسيلية كمؤشر نفاذية فعالة في التطبيقات وآخر إصلاح لا تتداخل مع علامات الفلورسنت الحمراء والخضرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل NIH / NIEHS R03ES021581 (الممنوحة لدكتوراه في الطب والطب الداخلي) ومركز الصحة البيئية بجامعة روتشستر (NIH / NIEHS P30 ES001247).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قفص الذبابةFlystuff.com59-101http://flystuff.com/general.php
Cocamide DEA [Ninol 11-CM]  شركة Stepan Chemicalلطلب خاصhttp://www.stepan.com/
كحول إيثوكسيليتد [Bio-soft 1-7] شركة Stepan Chemicalللحصول على طلب خاصhttp://www.stepan.com/
d-limonene (درجة نقاء عالية جدا) شركةFlorida Chemical Co. دعوة للحصول على طلب خاصhttp://www.floridachemical.com/
هيبوكلوريت الصوديوم فيشرSS290-4http://www.fishersci.com/
Tween-20 فيشرBP337http://www.fishersci.com/
PBSسيجما56064Chttp://www.sigmaaldrich.com/
الرودامين بسيجماR6626http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 حمض الكربوكسيلLumiprobe# 23090http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSOSigma472310-100http://www.sigmaaldrich.com/
Shields and Sang M3 متوسطSigmaS8398http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex Nylon mesh  Flystuff.com57-102http://flystuff.com/misc.php
غشاء الأكسجين المذاب (DO) ؛YSI#5793http://www.ysireagents.com/search.php
25 مم تعميم رقم 1 غطاء زلة VWR48380-080https://us.vwr.com/
مزيج ألواح العنب والأجار Flystuff.com47-102http://flystuff.com/media.php
NutatorVWR82007-202https://us.vwr.com/
تدعو تدعو مسحوق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
  2. Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
  3. Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
  4. Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
  5. Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
  6. Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
  7. Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
  8. Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
  9. Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
  10. Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
  11. Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
  12. Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
  13. Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
  14. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
  15. Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
  16. Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
  17. Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila D Limonene EPS CY5

مقالات ذات صلة