يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر

11.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51640

⸱

يونيو 2, 2014

 ,  , 
1Monell Chemical Senses Center

في هذه المقالة

ملخص

حاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات ترميز الهوية رائحة، ولكن عدم وجود بيانات نشرت تحديد بروابط الرائحة لمستقبلات الشمية الثدييات يعيق تطوير نموذج شامل للرائحة الترميز. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتسهيل التعرف الإنتاجية العالية من مستقبلات الشمية بروابط النوعي والكمي لتنشيط مستقبلات.

الملخص

عطر خلق أنماط فريدة من نوعها وتداخل تنشيط مستقبلات حاسة الشم، والسماح لأسرة مكونة من حوالي 1،000 الفئران و 400 مستقبلات الإنسان للاعتراف الآلاف من عطر. وقد نشرت بروابط الرائحة لأقل من 6٪ من مستقبلات الإنسان 1-11. ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات معربا عن ظيفيا هذه المستقبلات في أنظمة مغايرة هذا النقص في البيانات. هنا، نحن تصف طريقة للتعبير عن الأغلبية من عائلة مستقبلات الشمية في الخلايا Hana3A، تليها تقييم الإنتاجية العالية من تفعيل مستقبلات حاسة الشم باستخدام مقايسة luciferase المراسل الصحفي. هذا الاختبار يمكن استخدامها ل(1) لوحات شاشة عطر ضد مستقبلات الشمية لوحات؛ (2) تأكيد التفاعل الرائحة / مستقبلات عبر منحنيات الاستجابة للجرعة؛ و (3) مقارنة مستويات تنشيط مستقبلات بين المتغيرات مستقبلات. في نموذج البيانات لدينا، تم فحص 328 المستقبلات الشمية مقابل 26 عطر. كانت الرائحة أزواج / مستقبلات مع اختلاف درجات استجابة سلكتيد واختبارها في الاستجابة للجرعة. وتشير هذه البيانات إلى أن الشاشة هي وسيلة فعالة لإثراء للأزواج الرائحة / مستقبلات التي سيمر تجربة الاستجابة للجرعة، أي المستقبلات التي لديها استجابة حسنة النية إلى الرائحة. وبالتالي، فإن هذا الإنتاجية العالية luciferase الفحص هو وسيلة فعالة لتوصيف مستقبلات حاسة الشم وخطوة أساسية نحو نموذج من الترميز رائحة في نظام حاسة الشم لدى الثدييات.

المقدمة

نظام حاسة الشم لدى الثدييات لديه القدرة على الرد على عدد كبير من المحفزات معطر، مما يسمح للكشف والتمييز الآلاف من عطر. المستقبلات الشمية (نسب الأرجحية) هي أجهزة الاستشعار الجزيئية التي أعرب عنها الخلايا العصبية الحسية الشمية في الظهارة الشمية 12. يحدث الاعتراف رائحة الثدييات من خلال تفعيل الفرق من نسب الأرجحية التي كتبها عطر، والأسرة الجين أو واسعة النطاق، مع ما يقرب من 1،000 الفئران و 400 مستقبلات الإنسان 12-16. وقد أظهرت التحليلات الفنية السابقة من نسب الأرجحية في الخلايا العصبية الشمية في الخلايا والتي مغاير عطر مختلفة معترف بها من قبل فريدة من نوعها، ولكن تداخل الفرق من نسب الأرجحية 10،17-20. مطابقة لنسب الأرجحية بروابط أمر بالغ الأهمية لفهم رمز الشم وضرورية لبناء نماذج قابلة للتطبيق من الشم. بسبب صعوبات التعبير عن نسب الأرجحية في أنظمة مغايرة فضلا عن عدد كبير من كل من عطر ونسب الأرجحية، كانت غائبة إلى حد كبير هذه البيانات من ودرع؛ في الواقع، فإن أقل من 6٪ من نسب الأرجحية البشرية لديها يجند نشرت 1-11. يصف هذا البروتوكول استخدام مقايسة luciferase المراسل لوصف الرائحة / أو التفاعلات. هذا الاختبار يمكن توصيف الإنتاجية العالية من أملاح الإماهة الفموية، وهي مهمة ضرورية لفهم الرائحة / أو التفاعلات وكذلك تطوير نموذج للرائحة الترميز.

تواجه الدراسات الإنتاجية العالية من نسب الأرجحية ثلاثة تحديات رئيسية. أولا، تم الإبقاء على نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الخلايا مغاير في ER وتدهورت في وقت لاحق في proteasome و21،22، ومنع نسب الأرجحية من التفاعل مع عطر في نظام مقايسة 23-25. وقد وجهت هذه المشكلة عن طريق اكتشاف البروتينات التي تسهل التبعي مستقرة التعبير سطح الخلية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية 19،26،27. مستقبلات نقل البروتينات 1 و 2 (RTP1 و2) تعزيز أو التعبير سطح الخلية وتفعيل ردا على التحفيز الرائحة 19. على أساس هذا العمل، وكانت الخلايا HEK293Tتعديل للتعبير ثابت RTP1 طويلة (RTP1L) وRTP2، مستقبلات البروتين تعزيز التعبير 1، وG αolf، مما أدى إلى خط الخلية Hana3A 19،27. بالإضافة إلى ذلك، نوع 3 المسكارينية مستقبلات الأستيل كولين (M3-R) يتفاعل مع نسب الأرجحية على سطح الخلية ويعزز التنشيط استجابة لعطر 26. شارك في ترنسفكأيشن لأو مع RTP1S وM3-R في Hana3A خلايا النتائج في التعبير قوية ومتسقة وظيفية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية على سطح الخلية 27. الثانية، الثدييات أو ذخيرة كبيرة جدا. في البشر، على سبيل المثال، مرجع أو هو أمر من حجم أكثر عددا من مستقبلات ذخيرة الذوقية، و 2 أوامر من حجم أكثر عددا من مستقبلات بصرية ذخيرة. على الرغم من أن استنساخ واحد أو هو بروتوكول بسيط نسبيا، مطلوب جهد مقدما كبيرة لإنشاء مكتبة شاملة. الثالث، على الرغم من أننا نعرف أن في الرؤية، والطول الموجي يترجم إلى لون وفي وتيرة الاختبار يترجم إلى الملعب، ومن المفهوم تنظيم الروائح سيئة، مما يجعل من الصعب على الباحثين أن أقحم من عينة تمثيلية من عطر. على الرغم من إحراز بعض التقدم على هذه الجبهة 10،28، وخريطة المشهد حاسة الشم لا تزال غير مكتملة. فحص عشرات الآلاف من الجزيئات ضد المئات من نسب الأرجحية هي مهمة شاقة؛ تتطلب شاشات عالية الإنتاجية في هذا المجال حملات محددة بعناية. التحديات الرئيسية المتبقية هي تلك الخدمات اللوجستية والتكلفة بدلا من المشاكل الملازمة لهذه التقنية. على الرغم من أن الفحص مغاير لم يستخدم على نطاق واسع لتحديد بروابط من قبل الجماعات الأكاديمية، وقد استخدمت شركة خاصة نفس الأسلوب لتحديد بروابط نسب الأرجحية ل100 الإنسان 29. للأسف، لا تزال هذه البيانات الشخصية.

مقايسة luciferase المراسل الإنتاجية العالية المذكورة هنا لديها العديد من المزايا أكثر من الطرق البديلة المستخدمة لتقييم أو التنشيط. على الرغم من أن المسؤولةوقد تم قياس سيس من الخلايا العصبية الحسية الشمية الأم باستخدام الكهربية والتصوير الكالسيوم، وهذه التقنيات يجدون صعوبة في إغاظة وبصرف النظر الذي يؤدي إلى استجابة أو الخلايا العصبية بسبب عدم التداخل في خصائص استجابة الخلايا العصبية لحاسة الشم. على الرغم من أن يطرق-في GFP المسمى نوع مستقبلات 30،31، وتقديم مستقبلات معينة عبر اتش لالفئران الخلايا العصبية الشمية 32،33، أو أداء RT-PCR بعد التسجيلات 17،24،33 يمكن ربط تسجيلات لأنواع مستقبلات واحدة، وهذه الأساليب هي منخفضة الإنتاجية وغير مناسبة للشاشات واسعة النطاق. أنظمة الفحص مغايرة هي أكثر استيعابا، وتوجد شكلين رئيسيين في الأدب: مسار للصحفيين المخيم واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) للصحفيين المسار. على التحفيز رائحة، نسب الأرجحية تنشيط إشارة تتالي تنبيغ G αolf أن النتائج في إنتاج دوري امبير (المخيم) 12. من قبل المشترك transfecting على يراعة luciferase مراسل الجينات تحت سيطرة ميلانAMP عنصر الاستجابة (لجنة المساواة العرقية)، ويمكن قياس إنتاج luciferase المراسل بوصفها وظيفة من استجابة رائحة، مما يسمح لتقدير حجم أو التنشيط. أو التنشيط ويمكن أيضا أن تكون مرتبطة مسار IP3 قبل المشترك، معربا عن G-البروتينات مثل G α15/16 أو G-α15 جبهة تحرير أورومو الوهم 24،25،34. اخترناه مقايسة المقدمة هنا على أساس ثلاثة عوامل هي: (1) شارك في التعبير عن RTP1 مع المستقبلات الشمية رو الموسومة يحسن التعبير عن مستقبلات الشمية على سطح الخلية 19،27؛ (2) استخدام الجينات مراسل المخيم تستجيب يسمح لقياس أو التنشيط من خلال الكنسي الثاني مسار رسول؛ و (3) الفحص هو مناسبة تماما لشاشات عالية الإنتاجية.

هذا luciferase الفحص الإنتاجية العالية هي التي تنطبق على مجموعة متنوعة من دراسات قيمة في مجال الشم. أولا، عدد كبير من نسب الأرجحية يمكن فحص ضد الرائحة واحد من أجل تحديد نمط تنشيط مستقبلات ليرة سوريةالرائحة ecific. هذا النوع من الدراسة تحديد OR7D4 كما OR ​​المسؤولة عن الاستجابة لandrostenone الرائحة الستيرويد 8. على العكس، واحدة أو يمكن فحص ضد فريق من عطر من أجل تحديد ملف استجابة مستقبلات 10. عندما يتم تحديد مرشح حاسة الشم الرائحة / أو أزواج عبر هذه الشاشات، ويمكن التأكد من التفاعل عن طريق إجراء تجربة الاستجابة للجرعة دراسة استجابة أو لتركيزات متزايدة من الرائحة. يمكن منحنيات الاستجابة للجرعة أيضا تقييم مدى الاختلاف الجيني في أو يؤثر في استجابة الرائحة المختبر 8،9،11،35، ويمكن تمديد هذه الدراسات إلى الاختلاف بين الأنواع أو، مما يسمح لفحص تطور مستقبلات عبر الأنواع والطفرات المسببة في تطور 36،37، وأخيرا، وهذا الفحص يمكن استخدامها للكشف عن مضادات الرائحة التي هي قادرة على استعداء أو ردا على الرائحة خاص لزوج الرائحة / مستقبلات المعروفة 38،39. باختصار، هذا عالية-الإنتاجية luciferase الفحص ينطبق على مجموعة من الدراسات التي تساعد تميز أو أنماط التنشيط وتوفير فهم أفضل للرائحة الترميز في نظام حاسة الشم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ثقافة خلايا Hana3A

  1. إعداد وسائل الاعلام من خلال استكمال M10 الأساسية الدنيا والمتوسطة (MEM) مع 10٪ (V / V) FBS.
  2. صيانة الثقافة
    1. الحفاظ على خلايا في وسائل الإعلام M10. ملاحظة: ناقلات التعبير عن RTP1L، RTP2، REEP1، وG αolf تمنح مقاومة بوروميسين إلى خلايا Hana3A، ولكن الحفاظ على الخلايا مع هذه المضادات الحيوية لا تؤثر تأثيرا كبيرا على نتائج الفحص.
    2. ثقافة فرعية بنسبة 01:08 في 10 سم الأطباق كل 2-3 أيام.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

2. الخلايا تصفيح لترنسفكأيشن

  1. وسائل الإعلام نضح من 100٪ متموجة 10 سم طبق من الخلايا Hana3A.
  2. غسل الخلايا بإضافة 10 مل PBS، يحوم الطبق، والشفط في برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA وانتظر الخلايا لفصل (حوالي 1 دقيقة).
  4. تعطيل التربسين وذلك بإضافة 5 مل M10 وتفتيت كتل الخلية عن طريق الطحن تقريبا 10X و# 160؛ مع ماصة 10 مل. ماصة بعناية لتجنب إدخال فقاعات الهواء إلى وسائل الإعلام.
  5. لكل لوحة 96 جيدا، ونقل 1 مل من الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية، أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف دون الإخلال بيليه الخلية.
  6. resuspend الخلايا في 6 مل M10 في 1 مل من الخلايا المنقولة في الخطوة 2.5.
  7. ماصة 50 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

3. ترنسفكأيشن من المستقبلات الشمية

  1. إعداد البلازميد الحمض النووي
    1. إعداد الحمض النووي البلازميد عبر بروتوكول خالية من الذيفان الداخلي. ملاحظة: إعداد مجموعات استخدام البلازميد الحمض النووي المعين "خالية من الذيفان الداخلي"، أو إضافة خطوة استخراج الفينول كلوروفورم إلى البلازميد الحمض النووي بروتوكول الإعداد.
    2. تمييع DNA إلى تركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر في TE العازلة.
  2. مراقبة الخلايا مطلي (الخطوة 2.7) لضمان confluency السليم للapproximately 30-50٪ لكل بئر والعودة إلى الحاضنة. ملاحظة: في حين أن هذا confluency ليس الأمثل للكاشف ترنسفكأيشن الدهون، وconfluency من 30-50٪ في هذه الخطوة هو الأمثل لقياس luciferase النشاط 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
  3. إعداد ترنسفكأيشن ميكس
    1. ماصة RTP1S-PCI، M3-R-PCI، PCRE لوك، وpSV40-RL البلازميدات إلى MEM المتوسطة في وحدات التخزين بالتفصيل في الجدول 1 لجعل المزيج البلازميد (أحجام المبينة هي لكل لوحة 96 أيضا).
      مزيج البلازميد
      لكل بئر في لوحة 96 جيدا
      MEM - 500 ميكرولتر
      RTP1S-PCI 5 نانوغرام 480 نانوغرام
      M3-R-PCI 2.5 نانوغرام 240 نانوغرام
      PCRE لوك 10 نانوغرام 960 نانوغرام
      pSV40-RL 5 نانوغرام 480 نانوغرام

      الجدول 1. مكونات المزيج البلازميد. لكل بشكل جيد وحدات التخزين في لوحة 96 جيدا من RTP1S-PCI، M3-R-PCI، PCRE لوك، وpSV40-RL، وMEM.
    2. لكل لوحة 96 جيدا، وتمييع 18 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن الدهون في 450 ميكرولتر MEM المتوسطة.
    3. ماصة البلازميد مزيج (من الخطوة 3.3.1)، الموسومة مستقبلات الشمية في رودوبسين PCI البلازميد (رو-OR-PCI)، والدهون مزيج ترنسفكأيشن (من الخطوة 3.3.2) لجعل مجمع مفصلة في الجدول 2. مزيج الحل بواسطة سحن ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وقف رد الفعل بإضافة M10 وفقا للجدول 2 ملاحظة: هذا هو رد فعل حساسة للوقت، وينبغي ألا يسمح له بالاستمرار لأكثر من 30 دقيقة. البئر الحساب + 10٪ المهم التأكد من حجم كاف لخطوات لاحقة.
      مجمع
      لكل بئر لكل بئر + 10٪
      مزيج البلازميد 4.2 ميكرولتر 4.58 ميكرولتر
      رو-OR-PCI 0.05 نانوغرام 0.06 نانوغرام
      مزيج ترنسفكأيشن الدهون 4.2 ميكرولتر 4.58 ميكرولتر
      M10 41.7 ميكرولتر 45.83 ميكرولتر

      الجدول 2. مكونات مجمع. لكل بشكل جيد ولكل بئر + 10٪ حجم المزيج البلازميد (الجدول 1)، الشم البلازميد مستقبلات (رو-OR-PCI)، ومزيج ترنسفكأيشن الدهون. يضاف M10 لإرواء رد فعل بعد الحضانة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  1. الاستفادة من وسائل الإعلام على لوحات الخلية.
  2. ماصة 50 ميكرولتر من مجمع إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

4. رائحة تحفيز

  1. مراقبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل لضمان confluency السليم لل50-80٪ لكل بئر والعودة إلى الحاضنة. ملاحظة: إذا الخلايا هي أقل من 50قد يكون٪ متموجة، يراعة و luciferase renilla luciferase المراسل قراءات منخفضة للغاية لقياس تنشيط مستقبلات. النظر في التخلص من لوحة.
  2. إعداد 1 M حلول الأوراق المالية من كل رائحة في DMSO.
  3. إعداد الحلول التحفيز رائحة CD293 في المتوسط.
    1. للتجارب الفرز، وتمييع الحل الأسهم من رائحة إلى 100 ميكرومتر. إعداد أيضا عنصر تحكم لا رائحة (CD293 فقط) من أجل السيطرة أو لتفعيل الخلفية. ملاحظة: للحصول على التجارب الفرز، يتم اختبار كل زوج أو / الرائحة فقط مرة واحدة في التجربة. لأن بعض الآبار عبر نشر رائحة غير ممكن، فمن المستحسن لتحفيز الرائحة مع واحدة لكل لوحة.
    2. للتجارب الاستجابة للجرعة، وإعداد سبعة أضعاف التخفيفات 10 من المسلسل محلول المخزون رائحة في ثلاث نسخ ابتداء من الساعة 1 ملم لكل مستقبلات. أيضا بإعداد نفس التخفيفات الرائحة في ثلاث نسخ للخلايا transfected ناقلات الفارغة من أجل السيطرة لتفعيل الخلفية رائحة. ملاحظة: للحصول على التجارب الاستجابة للجرعة، كل سوينبغي إجراء العلاج تركيز الدر في ثلاث نسخ.
  4. الاستفادة من وسائل الإعلام على لوحات الخلية.
  5. ماصة 25 ميكرولتر من رائحة حل التحفيز إلى كل بئر واحتضان لمدة 4 ساعة.

5. قياس أو آخر عبر luciferase الفحص

  1. في resuspend الركيزة يراعة luciferase فقا لتعليمات الشركة المصنعة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. ذوبان الجليد 1 مل من يراعة luciferase المراسل الركيزة لكل لوحة 96 جيدا.
  3. إعداد رد فعل يراعة luciferase الطازجة وفاكهه تقضي Renilla luciferase المراسل الركيزة كاشف (5 ميكرولتر luciferase المراسل فاكهه تقضي / Renilla luciferase المراسل الركيزة لكل 1 مل من العازلة). ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 1 مل من كاشف لكل لوحة 96 جيدا.
  4. إعداد القارئ الانارة صفيحة ميكروسكوبية. فتح برنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية. ضمن رمز النظام:
    1. تحت عنوان "قبل التدفئة" الجدولة، حدد المربع ل "ON" وضبط درجة الحرارة من الجهاز إلى 25 درجة؛ C.
    2. تحت عنوان "مصدر" علامة التبويب، رئيس كل موزع مع 1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪ تليها 1،000 ميكرولتر من الماء المقطر. ملاحظة: استخدم مأخوذة منفصلة من الماء والكحول لكل موزع. يستخدم الايثانول لتطهير موزعات، والماء يزيل الايثانول المتبقية.
    3. رئيس كل موزع مع 1،500 ميكرولتر من الهواء (إزالة موزعات من السائل). ملاحظة: فتيلة بالهواء يضمن ركائز luciferase المراسل لا المخفف بالماء المتبقية.
    4. رئيس موزع 1 مع 1،080 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل اليراع (من الخطوة 5.2). رئيس موزع 2 مع Renilla luciferase المراسل الركيزة (من الخطوة 5.3). ملاحظة: يجب الحرص على عدم تلويث عبر ركائز luciferase المراسل. فتيلة مع ركائز luciferase المراسل يملأ الفضاء الميت في موزعات كاشف.
  5. إعداد بروتوكول التالية لقراءة كل اليراع وRenilla luciferase المراسل التلألؤ. ضمن البرامج المصاحبة للقارئ صفيحة ميكروسكوبية، من الامم المتحدةدير القائمة "ملف"، انقر على "مهمة جديدة". تسليط الضوء على "البروتوكولات" وانقر على "إنشاء جديد". في الإطار التالي، يجب أن يتم تحديد الدائرة بجانب "بروتوكول قياسي". انقر على زر "موافق". انقر مرتين على "الداخلي" على الجانب الأيسر من الشاشة.
    1. الاستغناء 10 ميكرولتر من يراعة luciferase المراسل الركيزة لجميع الآبار باستخدام موزع 1. تحت قائمة "الأعمال"، انقر فوق "الاستغناء". في الإطار "الاستغناء عن الخطوة"، مجموعة: "الصيدلي" إلى 1، "فتيلة" لا شيء "، المجلد الاستغناء" إلى 10 ميكرولتر و "قيم" إلى 225 ميكرولتر / ثانية. انقر على زر "موافق".
    2. يهز لوحة لمدة 30 ثانية. تحت قائمة "الأعمال"، انقر فوق "اهتز". في الإطار "اهتز الخطوة"، مجموعة "شدة" إلى متوسط ​​و "المدة" ل00:30 MM: SS. انقر على زر "موافق".
    3. قراءة التلألؤ جميع الآبار لل0.5 ثانية لكل بئر. تحت قائمة "الأعمال"، انقر فوق "اقرأ"؛ في الإطار "اقرأ الخطوة"، مجموعة: "أسلوب اكتشاف" لالتلألؤ، "قراءة نوع" لنقطة النهاية، "تكامل الوقت" ل00:00:50 MM: SS: SS، "تصفية مجموعات" إلى 1، "الانبعاث" لهول "، البصريات المركز" إلى أعلى "كسب" إلى 135، و "قراءة الارتفاع" إلى 1.00 ملم. انقر على زر "موافق".
    4. الاستغناء 10 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل Renilla لجميع الآبار باستخدام موزع 2. تعيين الشروط كما في الخطوة 5.6.1، باستثناء مجموعة "مصدر" إلى 2.
    5. يهز لوحة لمدة 30 ثانية. تعيين شروط كما في الخطوة 5.6.2.
    6. قراءة التلألؤ جميع الآبار لل0.5 ثانية لكل بئر. تعيين شروط كما في الخطوة 5.6.3.
  6. إزالة الغطاء عن لوحة 96 جيدا ووضع لوحة في قارئ صفيحة ميكروسكوبية. بدء تشغيل البرنامج الذي أنشئ في الخطوة 5.5 لقراءة لوحة التلألؤ.
  7. تنظيف مضخات موزع كاشف. من رمز النظام تحت "مصدر" علامة التبويب:
    1. تطهير 1،000 ميكرولتر من وirefly الركيزة luciferase المراسل من موزع يراعة luciferase في أنبوب الانتعاش. ملاحظة: يمكن تخزين luciferase المراسل اليراع في -80 درجة مئوية وإعادة استخدامها.
    2. رئيس كل موزع مع 1،000 ميكرولتر من الماء المقطر، تليها 1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪، وأخيرا 1،500 ميكرولتر من الهواء (إزالة موزعات من السائل). ملاحظة: الماء يزيل ركائز luciferase المراسل من مضخات الكاشف، يطهر الإيثانول، والهواء يجف أي الإيثانول المتبقية.

6. تحليل البيانات

  1. تصدير البيانات
    1. في برنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية، انقر مرتين على "بناة تقرير / التصدير" على الجانب الأيسر من الشاشة.
    2. انقر على زر "تصدير إلى Excel جديد" وانقر على زر "موافق".
    3. تسليط الضوء Export1 وانقر على "تحرير".
      1. تحت عنوان "المحتوى" تحقق "وصف النظام"، "الداخلي"، "لوحة الوصف"، و "لوحة تخطيط ماتريكس". وتشمل "البيانات الخام" لالثانية "محسوب البيانات".
      2. تحت عنوان "سير العمل"، تحقق "Autoexecute على الانتهاء من الإجراء". تحت وضع التصدير، تحقق "جميع لوحات في نفس المصنف" و "ورقة عمل جديدة".
      3. تحت عنوان "ملف" اختيار تنسيق اسم الملف وموقع ملف، وانقر على زر "موافق".
      4. إغلاق "تقرير / التصدير بناة" نافذة.
  2. الحصول على قيم luciferase المراسل تطبيع، تقسيم يراعة luciferase المراسل القراءة التلألؤ لكل بئر (الخطوة 5.6.3) من خلال القراءة التلألؤ Renilla لكل بئر (الخطوة 5.6.6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

شاشة الابتدائي اختبار 328 نسب الأرجحية ضد 26 الروائح عند تركيز 100 ميكرومتر. وقد تجلى هذا التركيز رائحة لتنشيط فعالية نسبة كبيرة من أملاح الإماهة الفموية مع بروابط معروف 10. أولا، تم حساب luciferase النشاط تطبيع بقسمة القراءة يراعة luciferase من القراءة luciferase المراسل Renilla. المقبل، وحسبت القيم يحدد الخط الأساسي عن طريق طرح قراءات luciferase المراسل تطبيع للسيطرة لا رائحة من القراءات luciferase المراسل تطبيع لكل بئر (الشكل 1). أجريت منحني...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم ترميز هوية الرائحة بواسطة حاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات، ولكن من المعروف أنماط تنشيط مستقبلات، بما في ذلك المستقبلات التي يتم تنشيطها وإلى أي درجة، لأقل من 6٪ من المستقبلات الشمية الإنسان 1-11. تم بذل جهود لتوصيف المستقبلات الشمية محدودة بسبب الأساليب كثيفة العمالة أو تطبيق لمجموعة فرعية فقط من حاسة الشم 17،23،24،33،34 عائلة مستقبلات. نظام تعبير مغايرة Hana3A يدعم تعبير قوي من غالبية المستقبلات الشمية اختبارها، ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع نظام مراسل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل R01 DC013339، R03 DC011373، وروث L. كيرشتاين خدمة القومي للبحوث جائزة T32 DC000014. تم تنفيذ جزء من العمل باستخدام مونيل حسي كيميائي مستقبلات الإشارات الأساسية، الذي تدعمه، في جزء منه، من خلال تمويل من P30 DC011735 NIH-NIDCD الأساسية غرانت. المؤلفين أشكر C. Sezille للمساعدة في جمع البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا Hana3Aمتوفرة من مختبر ماتسونامي عند الطلب
RTP1S-pCIمتوفرة من مختبر ماتسونامي عند الطلب
M3-R-pCIمتوفرة من مختبر ماتسونامي عند الطلب
pCRE-lucAgilent219076LUC< / a>
pSV40-RLPromegaE2231RL< / a>
الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ، النسرسيجما ألدريتشM4655MEM
FBSLife Technologies16000-044FBS< / a>
PBS (بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>) Cellgro21-040-CVPBS< / a>
Trypsin (0.05٪ Trypsin EDTA) LifeTechnologies25300Trypsin < / a>
CD293Life Technologies11913-019CD293 < / a >
96-well PDL أبيض / شفاف لوحةBD BioCoat356693 لوحات< / أ>
كاشف تعداء الدهون: ليبوفيكتامين 2000تقنيات الحياة11668-019 الليبوفكتامين < / أ >
اليراع لوسيفيراز الركيزة ، يراع لوسيفيراز مروي / < م > رينيلا < م > ركيزة لوسيفيراز: Dual-Glo AssayPromegaE2980dual glo
Synergy S2 برنامج BioTekSLADa href = "http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html" >برنامج قارئ BioTek S2 < / a>
Microplate: برنامج تحليل البياناتGen5 BioTekGen5Gen5< / a>
BIOSTACKBioTekBIOSTACK2WRBioStack
MultifloBioTekMFPMultiFlo
>300 μ ل GripTipsIntegra4433GripTips
12.5 μ ل GripTipsIntegra4414GripTips< / a
>300 &# 956 ؛ ل GripTips ViaFlo96Integra6433نصائح XYZ < / a>
12.5 &# 956 ؛ ل GripTips 384 XYZIntegra6403نصائح XYZ < / a
>384ViaFloIntegra6030384ViaFlo< / a>
TE المخزن المؤقتMacherey Nagel740797.1
DMSOسيجما ألدريتشD2650-100MLDMSO
ForskolinEnzo Life SciencesBML-CN100-0010FOR
<

المراجع

  1. Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  2. Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
  3. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  4. Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
  5. Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
  6. Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
  7. Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
  8. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
  9. Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
  10. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
  11. Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
  12. DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
  13. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
  14. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
  15. Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87(2008).
  16. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
  17. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  18. Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
  19. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  20. Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
  21. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
  22. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
  23. Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  24. Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  25. Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
  26. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
  27. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
  28. Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
  29. Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
  30. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  31. Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  32. Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  33. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  34. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
  35. McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  36. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
  37. Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
  38. Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
  39. Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
  40. Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
  41. Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
  42. Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Hana3A
تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.