مقالة منهجية

و خارج الحي نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية

DOI:

10.3791/51641

⸱

يونيو 6, 2014

 ,  ,  , 
1Pole of Cell Biology, Université catholique de Louvain & de Duve Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تشريح أنلاجين الغدة الدرقية الجنينية للفأر وثقافة النباتات السطحية على مرشحات شبه مسامية أو على شرائح بلاستيكية مجهرية. هذا النظام مثالي لدراسة الأحداث المورفولوجية أو التمايز التي تحدث أثناء تطور الغدة الدرقية للأجنة البرية أو الأجنة بالضربة القاضية ، وهو قابل لتجارب اكتساب وفقدان الوظيفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة الدرقية هي غدة الصماء bilobated المترجمة في قاعدة العنق، وتنتج هرمونات الغدة الدرقية T3، T4، والكالسيتونين. ويتم إنتاج T3 و T4 من قبل thyrocytes المتباينة، التي نظمت في مجالات مغلقة تسمى المسام، في حين يتم تصنيعه بواسطة C الكالسيتونين الخلايا، ويتخلل بين بصيلات وشبكة كثيفة من الشعيرات الدموية. على الرغم من أن العمارة الغدة الدرقية الكبار وظائف وقد وصفت على نطاق واسع، ودرس، وتشكيل وحدات "الوعاء الجريبي"، وتوزيع خلايا C-في لحمة والاتصالات نظير الصماوي بين الظهارية والخلايا البطانية بعيد كل البعد عن أن يكون مفهوما.

يصف هذا الأسلوب في خطوات متتابعة من الماوس الغدة الدرقية الجنينية ANLAGEN تشريح وثقافتها على مرشحات semiporous أو على شرائح البلاستيك المجهري. في غضون أربعة أيام، وهذا النظام الثقافة يلخص بأمانة في التنمية الغدة الدرقية الجسم الحي. في الواقع، (ط) مليارobation من الجهاز يحدث (لإإكسبلنتس E12.5)، (ب) تنظيم thyrocytes السلائف في بصيلات واستقطاب، (ج) C وthyrocytes الخلايا التفريق، و (iv) الخلايا البطانية موجودة في الأنسجة تتكاثر microdissected، تهاجر إلى فصوص الغدة الدرقية، وبشكل وثيق مع ربط الخلايا الظهارية، كما يفعلون في الجسم الحي.

ويمكن الحصول على أنسجة الغدة الدرقية من النوع البري، بالضربة القاضية أو الأجنة وراثيا الفلورسنت. علاوة على ذلك، إإكسبلنتس الثقافة يمكن التلاعب بها عن طريق إضافة مثبطات، ومنع الأجسام المضادة، عوامل النمو، أو حتى الخلايا أو المتوسطة مكيفة. يمكن تحليلها خارج الحي التنمية في الوقت الحقيقي، أو في أي وقت من الثقافة التي كتبها المناعية وRT-QPCR.

في الختام، والثقافة ازدراع الغدة الدرقية جنبا إلى جنب مع المصب كامل جبل أو على توفر أقسام التصوير والتعبير الجيني التنميط نظام قوي لمعالجة ودراسة التخلق والتمايز أحداث س الغدة الدرقيةrganogenesis.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة الدرقية هي عبارة عن مجموعة من المجالات الظهارية مستقلة، ودعا بصيلات، وتحيط بها شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية البطانية. هذه المنظمة تسمح وظيفة الغدة الدرقية: توفير الشعيرات الدموية البطانية thyrocytes مع اليود، اللازمة لT3 و T4 هرمون التوليف، وتوزيع هذه الأخيرة إلى الجسم كله. منتشرة في بين بصيلات والشعيرات الدموية، C خلايا إنتاج هرمون الكالسيتونين نقص كلس الدم 1. على الرغم من أن العمارة الغدة الدرقية الكبار وظائف معروفة، الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في التطور الجنيني الغدة الدرقية (تشكيل المسام والتمايز) بعيدة كل البعد عن أن يكون مفهوما.

خلال مرحلة التطور الجنيني، thyrocytes السلف كما تنبع سماكة (بدأة خط الوسط) من الجدار البطني من الأديم الباطن المعى الأمامي في اليوم الجنينية (ه) 8.5 في جنين الفأر، في حين C خلايا الأسلاف تنشأ في E11.5 كما نتوءات على شكل قطرات ( بو التالية للخيشوميةيموت) من الحقائب البلعوم الرابع 2-6. برعم خط الوسط ثم يفصل من الأديم الباطن، ويوسع ثنائيا لتندمج في E13.5 مع الهيئات التالية للخيشومية على كل جانب من القصبة الهوائية. أخيرا، thyrocytes تنظيم في بصيلات وخلايا C-التفريق.

المعرفة الحالية على تشكيل الغدة الدرقية يأتي أساسا من التحليل النسيجي لأنسجة ثابتة، ولكن الأحداث التخلق المشاركة في تشكيل الغدة الدرقية هي ديناميكية للغاية وتنطوي على الاتصالات والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا ومع المصفوفة خارج الخلية. وأظهرت الأعمال الأخيرة التي الأسلاف thyrocyte تنتج مستويات عالية من VEGF لتجنيد الخلايا البطانية إلى الغدة الدرقية النامية، وبدوره بتجنيد الخلايا البطانية تشجيع تشكيل بصيلات وخلايا C التمايز 7.

وقد أجريت معظم الدراسات المجراة سابقا على الغدة الدرقية على الخلايا المشتقة من الغدة الدرقية الكبار معزولة، ونمت إما على 2D البلاستيك زراعة الأنسجة ديتضاءل المجموع المذكور أعلاه أو في المصفوفات 3D. باستخدام هذه الأنواع من الثقافات، والخلايا الجريبي متباينة إما البقاء الاستقطاب وتنظيمها في بصيلات أو إعادة الاستحواذ على منظمة 3D 8-10. ومع ذلك، وهذه الخلايا الظهارية نقية، explanted من بيئتهم الفسيولوجية، والمثقف في 2D، تجاهل التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية، السيتوكينات وعوامل النمو ومع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا البطانية أو الأعصاب التي يواجهونها عادة في الجسم الحي. وصفت دراسة لطيفة جدا مؤخرا بروتوكول تمايز الخلايا ES في بصيلات الغدة الدرقية باستخدام الخطوة النهائية في الثقافة 3D matrigel 11. ومع ذلك، هذه الثقافات 3D تفتقر اتصال مع أنواع الخلايا الأخرى.

بناء على الخبرة السابقة على البنكرياس والغدد اللعابية ثقافة الجهاز 12-14، طريقة لتشريح الفأر الجنينية ANLAGEN الغدة الدرقية وزراعة لل explants على مرشحات semiporous أو على شرائح البلاستيك المجهر وقد وضعت.

عندماالعمل مع الأجنة E12.5، والأصل المزدوج للANLAGEN الغدة الدرقية (بدأة خط الوسط واثنين من الهيئات التالية للخيشومية الجانبي) فرضت تسليخ مجهري من جزء كبير من الأنسجة. يرد هذا القصبة الهوائية، ولكن ليس المريء، وامتدت من الشرايين البلعوم القوس حتى تورم الطرجهالي. عند تربيتها على مرشحات، وبدأة خط الوسط يمتد أفقيا على كل جانب من القصبة الهوائية، حيث تلتحم مع الهيئات التالية للخيشومية لتشكيل اثنين من فصوص الغدة الدرقية، لا تزال متصلة بواسطة برزخ ضيق.

في الثقافة، وتتكاثر الخلايا الظهارية، وتنظيم في بصيلات والتمايز إلى خلايا thyrocytes وC، اعتمادا على أصلهم. الخلايا البطانية الواردة في الأنسجة microdissected أيضا تتكاثر وتغزو فصوص الغدة الدرقية لربط أخيرا بشكل وثيق مع هيكل مسامي الظهارية، بصرف النظر عن تدفق الدم أو عوامل المنتشرة. كما تطور لل explants يلخص بأمانة في الجسم الحي تطويرمنة، وهذا النظام هو الأمثل الثقافة لدراسة التخلق والتمايز الأحداث التي تحدث أثناء نمو الغدة الدرقية.

ويمكن الحصول على أنسجة الغدة الدرقية من النوع البري، بالضربة القاضية أو الأجنة وراثيا الفلورسنت، ونظام الثقافة هي قابلة للخسارة والربح من وظيفة التجارب. أخيرا، يمكن استغلال الوقت الفاصل بين التصوير من إإكسبلنتس الغدة الدرقية fluorescently المسمى على أطباق البلاستيك المجهري للتحقيق أفضل حركية واستمرارية حركات التخلق التي تحدث في الجسم الحي. وقد تم بالفعل استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لدراسة التشكل المتفرعة من البنكرياس 15،16 أو الحالبي برعم 17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأثيرت الفئران ومعالجتها وفقا لمبادئ رعاية الحيوان المعملية لجنة رعاية الحيوان جامعة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات والبروتوكولات التي كتبها هذه اللجنة.

1. طلاء من البلاستيك المجهر الثقافة الغرف

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي. نوعين من الطلاء وظيفيا ما يعادلها.

  1. غرف الثقافة معطف من البلاستيك مع فبرونيكتين قبل يوم واحد إلى العزلة من أنسجة الغدة الدرقية:
    1. تمييع فبرونيكتين العقيمة إلى تركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل في المتوسط ​​M199 تستكمل مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 0.25 ميكروغرام / مل fungizone و 2 ملي الجلوتامين 12.
    2. تغطية الآبار مع 200 ميكرولتر من فبرونيكتين المخفف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية الثلاجة.
    3. في يوم من تشريح، نضح فبرونيكتين، وشطف الآبار مرة واحدة مع M199 وإضافة الحد الأدنى من حجم 200 ميكرولتر من M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين.
    4. مغادرة الغرف المغلفة في الحاضنة حتى جاهزة للوحة لل explants.
  2. معطف من البلاستيك غرف الثقافة مع النوع الأول من الكولاجين 2 ساعة قبل عزل أنسجة الغدة الدرقية:
    1. تمييع نوع العقيمة الأول من الكولاجين لتركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل في حمض الهيدروكلوريك 10 ملم. ملاحظة: حافظ على الكولاجين محلول المخزون على الجليد.
    2. تغطية الآبار مع 200 ميكرولتر من نوع المخفف الأول من الكولاجين واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. نضح نوع أنا الكولاجين الحل، شطف الآبار مرة واحدة مع M199 وإضافة الحد الأدنى من حجم 200 ميكرولتر من M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين.
    4. مغادرة الغرف المغلفة في الحاضنة حتى جاهزة للوحة لل explants.

2. تشريح الغدة الدرقية ANLAGEN التي تحتوي على الأنسجة (E12.5) أو الغدة الدرقية فصوص (E13.5-E14.5)

ملاحظة: استخدام أدوات تشريح نظيفة ولوحات بيتري / الثقافة. الخطوات العامة وشقوق المبينة أدناه هي نفسها بالنسبة للأجنة E14.5 E12.5 و.

  1. التضحية توقيت الحوامل إناث الفئران الجنينية المطلوب في (ه) يوم (من E12.5 لE14.5) وإزالة الرحم باستخدام أدوات تشريح.
  2. وضع الرحم تشريح في 10 سم لوحة تحتوي على HBSS.
  3. عقد واحد من أقصى الرحم مع ملقط وفتح الرحم مع مقص صغير لتحرير تدريجيا جميع الأجنة.
  4. فصل الأجنة من المشيمة مع مقص ونقل الأجنة مع الأغشية خارج الجنين في جديدة 10 سم لوحة تحتوي على HBSS.
  5. إزالة الكيس المحي والسلى. ملاحظة: من هذه النقطة، والعمل تحت stereomicroscope مع تضوء من أدناه؛ زيادة التكبير مع خطوات تشريح. استخدام الإبر التنغستن في الشعيرات الدموية الزجاج كأدوات تشريح.
  6. باستخدام الإبر مثلسكين وشوكة، وإزالة الجزء العلوي من الرأس، بما في ذلك الفك العلوي والأذنين (1A الشكل، وقطع على طول).
  7. عقد الجنين على ظهرها وإزالة أول قطعة اضافية من الأنبوب العصبي (1A الشكل، وقطع على طول ب)، ثم الجزء السفلي من الجنين، فقط تحت أطرافه الأمامية وفوق القلب (الشكل 1B).
  8. نقل الجنين شريحة تحتوي على اللسان (لتوجيه الأنسجة) ومنطقة الرقبة في جديدة 10 سم لوحة تحتوي على HBSS.
  9. إزالة الأنبوب العصبي والأنسجة الخلفية إلى المريء / القصبة الهوائية (الشكل 1C، وقطع على طول).
  10. بلطف القسم شريحة الأنسجة على جانبي اللسان (الشكل 1C، وقطع على طول ب وب ').
  11. تحديد موقع المريء والقصبة الهوائية، في إطالة اللسان، وتشريح بعيدا اللسان، وترك الطرجهالي تورم (1D الشكل، وقطع على طول)، والنسيج على بوتح الجانبين من المريء / القصبة الهوائية (الشكل 1D، وقطع على طول ب وب ').
  12. إزالة المريء، والقصبة الهوائية مع وضع جانبها بطني مواجهة.
  13. تشريح الأنسجة بعيدا غير مرغوب فيها مثل الغدة الصعترية (الشكل 1E) وجميع الأنسجة الموجودة أفقيا إلى الشرايين القوس البلعومية. لE13.5 أو E14.5 الأجنة، تصور فصوص الغدة الدرقية على كل جانب من القصبة الهوائية (الشكل 1F؛ الخطوط المنقطة الحمراء)، وكذلك تشريح فصوص من القصبة الهوائية.
  14. نقل معزولة المنطقة E12.5 القصبة الهوائية، أو فصوص الغدة الدرقية E13.5-E14.5 في لوحة الثقافة التي تحتوي على 35 مم قبل حرارة متوسطة M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين. نقل إإكسبلنتس باستخدام تلميح مرشح prewetted على micropipette P-200. لإإكسبلنتس E12.5، وقطع طرف من طرف لتوسيع الافتتاح. ملاحظة: بشكل روتيني، وإذا الأجنة لها نفس التركيب الوراثي، نفذ الخطوات 6 و 7 على جميع الأجنة، ون 9-11، وأخيرا 12 و13.

3. الطلاء وثقافة الغدة الدرقية إإكسبلنتس

  1. غسل لل explants عن طريق التحويل المتعاقبة في ثلاثة آبار من لوحة 24 أيضا يحتوي على 1 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة (= M199 تستكمل مع المضادات الحيوية، والجلوتامين و 10٪ مصل العجل الجنين).
  2. طلي من فصوص الغدة الدرقية على البلاستيك المغلفة المجهر غرف الثقافة:
    1. نضح M199 مستنبت من الغرف المغلفة.
    2. بعناية، ونقل لل explants الغدة الدرقية في غرف الثقافة باستخدام micropipette وتصفية النصائح. وضع ازدراع واحدة في وسط كل دائرة.
    3. إزالة الزائدة المتوسطة ووضع غرفة الثقافة في حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 2 ساعة للسماح لل explants نعلق على المصفوفة.
    4. إضافة بلطف 200-300 ميكرولتر من قبل حرارة متوسطة الثقافة إلى كل بئر.
    5. احتضان لثقافة طويلة الأمد في حاضنة زراعة الأنسجة.
  3. الطلاء سو منطقة القصبة الهوائية أو الغدة الدرقية فصوص على مرشحات semiporous:
    1. ملء عدد من الآبار من 24 لوحة جيدا المطلوبة مع 330 ميكرولتر من قبل حرارة متوسطة الثقافة.
    2. المكان مرشحات (مثل 0.4 ميكرون ميليبور فلتر) على المتوسط، مع الحرص على تجنب محاصرة من فقاعات الهواء تحت التصفية الثقافة.
    3. بعناية، باستخدام micropipette وتصفية نصائح، ونقل لل explants الغدة الدرقية مع حجم الحد الأدنى من المتوسط ​​على مركز للمرشحات (الحد الأقصى 4/filter).
    4. إزالة الزائدة المتوسطة والفضاء خارج لل explants مع إبرة التنغستن.
    5. احتضان لثقافة طويلة الأمد في حاضنة زراعة الأنسجة. ملاحظة: تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم تحت غطاء تدفق الصفحي. ثقافة لل explants تصل إلى 7 أيام.

4. جبل لالجامع المناعي بروتوكول تلطيخ لالغدة الدرقية إإكسبلنتس

طرد إإكسبلنتس نمت على المرشحات (بعد الخطوة 2 أدناه) باستخدام الإبر التنغستن أوملقط غرامة ونقل في 24 لوحة جيدا لجميع الخطوات، باستثناء الأولية (الخطوة 5) والثانوية (الخطوة 7) حضانات الضد (لوحة 96 أيضا). لإإكسبلنتس تمسكا مثقف على المجهر غرف البلاستيك، وتنفيذ كافة الخطوات في غرف الثقافة.

  1. نضح M199 مستنبت وإصلاح يزدرع مع الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 20 دقيقة (500 ميكرولتر في طبق 24 جيدا و 300 ميكرولتر في الشرائح المجهر).
  2. غسل 2X 10 دقيقة في تريس مخزنة المالحة مع تريتون (TBST؛ 50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0،1٪ تريتون X-100) في RT.
  3. معالجة لل explants مباشرة أو تخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: للحصول على تخزين طويل الأجل في -20 درجة مئوية، يذوى لل explants في الميثانول من خلال زيادة التركيز تدريجيا الميثانول في TBST لتصل إلى 100٪ الميثانول. عندما استعداد لمواصلة مع المناعية (الخطوة 4)، ترطيب لل explants بإضافة TBST تدريجيا إلى الميثانول.
  4. استبدال TBST مع عرقلة الحل (10٪ مصل الماعز العادية في TBST)، واحتضان على الكرسي الهزاز ورأى البحر لمدة 30-60 دقيقة في RT.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل (100-200 ميكرولتر لكل حالة). نقل لل explants "تصفية" من 24 لوحة جيدا لوحة 96 جيدا. احتضان إإكسبلنتس مع الأجسام المضادة الأولية على الكرسي الهزاز البحر ورأى بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  6. في اليوم التالي، ونبذ الحل الأجسام المضادة الأولية، ونقل لل explants "تصفية" مرة أخرى في 24 لوحة جيدا، وغسل خمس مرات على الأقل مع TBST على الكرسي الهزاز البحر ورأى ل45-60 دقيقة لكل منهما في RT.
  7. تمييع الضد الثانوية (مثل الماعز المضادة للX-اليكسا فلور في 1:2،000 التخفيف) في TBST تحتوي على 1٪ من مصل الماعز العادي واحتضان لل explants مع هذا التخفيف بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز البحر ورأى في 4 درجات مئوية، وفي الظلام. لcounterstaining النووية، وتشمل 1 ميكروغرام / مل من مكرر Benzimide (هويشت) جنبا إلى جنب مع الحل الضد الثانوية.
  8. في اليوم التالي، ونبذ الحل الضد الثانوية وغسل 5X مع TBST على رأى البحرالروك ل45-60 دقيقة لكل منهما في RT. خلال يغسل، والحفاظ على إإكسبلنتس في الظلام.
  9. إجراء غسيل إضافية في TBST يحوم بلطف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام.
  10. POSTFIX لل explants immunostained في PFA 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  11. غسل 2X 10 دقيقة مع TBST.
  12. نقل لل explants إما تدريجيا في الميثانول 100٪ للتخزين طويل الأجل في -20 درجة مئوية، أو تحليل الفور. لإإكسبلنتس مثقف على مرشحات، وimmunostained في 24 لوحة جيدا، ونقل في غرفة المجهر (على سبيل المثال LabTek أو Ibidi) مع TBST أو أفضل متوسط ​​الفلورسنت تصاعد قبل التحليل مع Multiphoton أو المجهر متحد البؤر.

5. استخراج الحمض النووي الريبي من الغدة الدرقية

العمل في بيئة خالية من ريبونوكلياز. وبالتالي، استخدام الحمض النووي ونوكلياز نصائح مجانية ماصة وتنظيف كل مقاعد البدلاء والمعدات من الملوثات وRNases. هذا البروتوكول كونها مبنية على الفينول / الكلوروفورم، نفذ الخطوة الأولىق (1-7) تحت غطاء الكيميائية.

  1. التجانس واحد ازدراع الغدة الدرقية أو الغدة الدرقية فصين مع 300 ميكرولتر من الحل استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مدقة المتاح للأنبوب 1.5 مل. في بين العينات، وغسل مدقة في 2٪ SDS، ثم الماء، ثم الايثانول.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من حل آخر استخراج الحمض النووي الريبي، دوامة 10 ثانية واحتضان على RT لمدة 10 دقيقة.
  3. دوامة لمدة 30 ثانية وإضافة 20 نانوغرام من الحمض الريبي النووي النقال إلى كل عينة.
  4. دوامة لمدة 1 دقيقة وإضافة 80 ميكرولتر من الكلوروفورم.
  5. دوامة بقوة لمدة 30 ثانية واحتضان 15 دقيقة في RT.
  6. تدور لمدة 15 دقيقة في 19،000 XG في درجة حرارة مضبوطة (4 ° C) الطرد المركزي.
  7. نقل بعناية المرحلة المائية العليا عديم اللون في أنبوب الطازجة التي تحتوي على 20 ميكروغرام من الجليكوجين كما coprecipitant.
  8. دوامة وإضافة 200 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول الكحول.
  9. دوامة بقوة لمدة 15-30 ثانية والسماح RNA يعجل في -20 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة أو في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. تدور لمدة 30 دقيقة في 19،000XG في 4 درجات مئوية، والقضاء طاف.
  11. غسل بيليه مع 450 ميكرولتر من الايثانول 75٪ البرد ودوامة لطرد بيليه.
  12. تدور لمدة 10 دقيقة في 19،000 XG في 4 درجات مئوية، والقضاء طاف.
  13. تجفيف بيليه تحت غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق.
  14. resuspend الكرية مع 10 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه واحتضان 10 دقيقة في RT.
  15. تركيز الحمض النووي الريبي الفحص، مخزن في -80 درجة مئوية أو عكس نسخ لتحليل التعبير الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تشريح anlages الغدة الدرقية (خط الوسط وUB، جنبا إلى جنب مع الأنسجة المحيطة بها)، وفصوص الغدة الدرقية من أجنة الفئران في E12.5 وe13.5/e14.5، على التوالي (الشكل 1). بعد يوم واحد في الثقافة على مرشح، وبدأة خط الوسط مرئيا (الشكل 2A) باعتبارها نسيج ممدود تمتد على الجزء العلوي من القصبة الهوائية. أنها تشكل تدريجيا فصين على كل جانب من القصبة الهوائية. إذا فصوص الغدة الدرقية معزولة (E13.5 أو E14.5) هي مثقف، وسوف تتوسع، وسوف يخضع التشكل وتنظيم الخلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتصف هذه الورقة طريقة لتشريح وزراعة إإكسبلنتس الغدة الدرقية (E12.5) أو فصوص (E14.5) من أجل دراسة وفهم أفضل للأحداث المعقدة التي تفضي إلى تشكيل الغدة الدرقية. ويرجع ذلك إلى الأصل المزدوج للANLAGEN الغدة الدرقية (بدأة خط الوسط واثنين من الهيئات التالية للخيشومية الجانبية)، وصغر حجمها، وهو جزء من النسيج E12.5 المترجمة منقاري إلى الشرايين البلعوم القوس، والتي تحتوي على القصبة الهوائية، ولكن ليس المريء وmicrodissected. كما يتضح، في غضون فترة أربعة أيام، وهذا النظام الثقافة يلخص بأمانة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل بمنح من جامعة لوفان الكاثوليكية (Action de recherché concertées) وصندوق البحث الطبي العلمي (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. زميل دكتوراه من Télévie، A.-C.H. حصل على زمالة من Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (بلجيكا) ، M.V. مدعوم من معهد de Duve و C.E.P. هو باحث مشارك أول في F.R.S.-FNRS (بلجيكا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
& micro ؛ - slide 8 well ، ibiTreat ، معالجة زراعة الأنسجة ، معقمproxylab80826
الكولاجين من النوع الأول ، ذيل الفئرانMillipore08-115
Fibronectin من البلازما البشريةInvitrogen# 33010-018
M199Invitrogen31150-022
HBSSInvitrogen14025-100
سلك التنغستنGoodfellow
(قطر 12 مم)MilliporePICM01250
GlycoBlueInvitrogenAM9516
E-cadherinBD Biosciences6101821/1,000
EzrinThermo ScientificMS-661-P11/400
PECAMBD Biosciences5502741/100
هوشتتسيجماB2261
إدراج لوحة ثقافة LS237450

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
  2. Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
  3. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
  4. Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
  5. De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
  6. De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
  7. Hick, A. -C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
  8. Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
  9. Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
  10. Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
  11. Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
  12. van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
  13. Hick, A. -C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
  14. Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
  15. Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
  16. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
  17. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RT qPCR

مقالات ذات صلة