ثابت التصاق الاختبار هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لنموذج التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية T وأنواع الخلايا الأخرى. يتم إنشاؤها التفاعلات عن طريق حقن خلايا T وصفت في الآبار المغلفة مع جزيئات الالتصاق، في حين يتم استخدام قارئ لوحة لتحديد عدد الخلايا الملتصقة التالية يغسل المسلسل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مطلوب تي اللمفاويات التصاق لعدة وظائف الخلايا التائية، بما في ذلك الهجرة إلى مواقع الالتهاب وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا المناعية تقديم المستضد. خلايا T إنجاز التصاق التنظيم من خلال التحكم في خصائص لاصقة من لل integrins، فئة من جزيئات التصاق الخلية تتكون من أزواج من البروتينات عبر الغشاء heterodimeric التي تتفاعل مع الجزيئات المستهدفة على الخلايا شريك أو المصفوفة خارج الخلية. أبرز الخلايا التائية إنتغرين هي وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد (LFA) -1، وتتألف من وحدات فرعية αL وβ2، هدفها هو جزيء التصاق الخلايا (ICAM) -1. قدرة الخلايا التائية للسيطرة على التصاق مستمد من القدرة على تنظيم الدول تقارب لل integrins الفردية. يصف من الداخل إلى الخارج إشارات العملية التي الإشارات داخل الخلية يسبب المجالات الخارجية لل integrins لتولي دولة تفعيلها. ويستند الكثير من معرفتنا لهذه الظواهر المعقدة على الآليةالدراسات التي أجريت في نظم مبسطة في نموذج المختبر. تي اللمفاويات التصاق مقايسة الموصوفة هنا هو أداة ممتازة تسمح خلايا T التمسك استهداف جزيئات، في ظل ظروف ثابتة، ومن ثم يستخدم قارئ لوحة الفلورسنت لتحديد الإلتصاق. وكان هذا الاختبار مفيدا في تحديد المواد المحفزة أو المثبطة التصاق التي تعمل على الخلايا الليمفاوية، فضلا عن تميز الأحداث يشير المعنية. على الرغم من وصفها هنا لLFA-1 - ICAM-1 التصاق بوساطة؛ هذا الاختبار يمكن تكييفها بسهولة للسماح لدراسة التفاعلات الأخرى لاصقة (مثل VLA-4 - فبرونيكتين).
المقدمة
تي اللمفاويات التصاق هو عملية أساسية في الاستجابة المناعية 1. هو مطلوب منها لT تفاعل الخلايا مع الخلايا البطانية تزيين جدران الشعيرات الدموية، لمسح مستضد تقديم الخلايا (APC) داخل الغدد الليمفاوية، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعية (IS) مع الخلايا المستهدفة 2. هذه المتطلبات وظيفيا ومتميزة kinetically. تتكون عملية التسرب من الخلايا الليمفاوية chemoattraction، المتداول، التصاق شركة، والتهجير. الانتقال من المتداول لشركة التصاق خلايا T يتطلب للرد على بروتين G جانب إشارة مستقبلات بسرعة. هذا الرد ينتج التفاعل يجند إنتغرين التي تبطئ والاعتقالات الخلية المتداول 3. تغيير فوري في الطمع إنتغرين يتوسط هذه....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. طلاء صفيحة ميكروسكوبية ويلز
ملاحظة: إن الهدف من هذه الخطوة هو على الأسطح معطف البوليسترين مع ICAM-1 لتكون بمثابة بروابط لخلية T LFA-1.
- إعداد الحلول التالية:
- إعداد الحل الطلاء عن طريق إعادة التعليق المؤتلف ICAM-1 مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 ملي KH 2 PO 4، ودرجة الحم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وفيما يلي مثال على مقايسة التصاق باستخدام خلايا T الأولية حفز مع تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة لمكافحة CD3. فمن المفيد معرفة مضان من الخلايا غير مغسولة (أي التحميل المجموع). خلايا Unstimulated بمثابة سيطرة سلبية وسلطة النقد الفلسطينية الخلايا المعالجة هي مراقبة إيجابية للأجسام المضادة للCD3. الخلايا مطلي في الآبار غير المصقول بمثابة الرقابة على ICAM-1. في تجربة نموذجية النسبة المئوية للخلايا ملتصقة تعامل سلطة النقد الفلسطينية ما بين 40٪ إلى 50٪ في حين بلغت نسبة الخلاي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك عدة فحوصات لدراسة الإشارات إلى LFA-1 وتفعيل الخلايا التائية التصاق 12. التدفق الخلوي يستخدم لقياس LFA-1 على تقارب في الخلايا الحية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تربط بشكل انتقائي لمحني إما تمديد أو LFA-1. واحدة من القيود المفروضة على هذه الطريقة هو أنه لا يأخذ في الاعتبار الطمع ولل integrins '. المقايسات الهجرة هي أدوات مفيدة لكنها قياس الهجرة، وليس التصاق تافه عند نقطة زمنية محددة. نماذج الماوس لدراسة الخلايا اللمفاوية T الهجرة (على سبيل المث.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
Hirschil الثقة، مايكل سابرستين الطبية علماء أبحاث صناديق، وزمالة جامعة نيويورك وايتهيد أيد هذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قارئ الألواح | BioTek | Synergy H1 ماصة هجينة | |
| متعددة القنوات | فيشر | 21-377-829 | |
| صفيحة دقيقة 96 بئر مع قاع بصري | Corning Costar | 3603 | |
| المؤتلف ICAM-1 | R & D Systems | ADP4-050 | |
| الأجسام المضادة ل CD3 | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | المجسات الجزيئية | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم | Gibco | 14190250 | |
| الخلايا الليمفاوية الطرفية | < > على سبيل المثال < / م > الماوس أو كلوريد المغنيسيوم البشري | ||
| سيجما ألدريتش | M8266 | ||
| كلوريد الكالسيوم | سيجما ألدريتش | 499609 | |
| برنامج الجيل الخامس المفتوح | BioTek | الإصدار 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| أنابيب الطرد المركزي 15 و 50 مل | فيشر | 352099 ، 352070 | |
| ماصات باستور بلاستيكية يمكن التخلص منها | فيشر | 13-711-7M | |
| قوارير ثقافة T-75 | فيشر | 50-754-1366 | |
| RosetteSep طقم تشويه الخلايا | التائية StemCell Technologies | 15061 |
المراجع
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
