ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

Summary

ثابت التصاق الاختبار هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لنموذج التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية T وأنواع الخلايا الأخرى. يتم إنشاؤها التفاعلات عن طريق حقن خلايا T وصفت في الآبار المغلفة مع جزيئات الالتصاق، في حين يتم استخدام قارئ لوحة لتحديد عدد الخلايا الملتصقة التالية يغسل المسلسل.

Abstract

مطلوب تي اللمفاويات التصاق لعدة وظائف الخلايا التائية، بما في ذلك الهجرة إلى مواقع الالتهاب وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا المناعية تقديم المستضد. خلايا T إنجاز التصاق التنظيم من خلال التحكم في خصائص لاصقة من لل integrins، فئة من جزيئات التصاق الخلية تتكون من أزواج من البروتينات عبر الغشاء heterodimeric التي تتفاعل مع الجزيئات المستهدفة على الخلايا شريك أو المصفوفة خارج الخلية. أبرز الخلايا التائية إنتغرين هي وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد (LFA) -1، وتتألف من وحدات فرعية αL وβ2، هدفها هو جزيء التصاق الخلايا (ICAM) -1. قدرة الخلايا التائية للسيطرة على التصاق مستمد من القدرة على تنظيم الدول تقارب لل integrins الفردية. يصف من الداخل إلى الخارج إشارات العملية التي الإشارات داخل الخلية يسبب المجالات الخارجية لل integrins لتولي دولة تفعيلها. ويستند الكثير من معرفتنا لهذه الظواهر المعقدة على الآليةالدراسات التي أجريت في نظم مبسطة في نموذج المختبر. تي اللمفاويات التصاق مقايسة الموصوفة هنا هو أداة ممتازة تسمح خلايا T التمسك استهداف جزيئات، في ظل ظروف ثابتة، ومن ثم يستخدم قارئ لوحة الفلورسنت لتحديد الإلتصاق. وكان هذا الاختبار مفيدا في تحديد المواد المحفزة أو المثبطة التصاق التي تعمل على الخلايا الليمفاوية، فضلا عن تميز الأحداث يشير المعنية. على الرغم من وصفها هنا لLFA-1 - ICAM-1 التصاق بوساطة؛ هذا الاختبار يمكن تكييفها بسهولة للسماح لدراسة التفاعلات الأخرى لاصقة (مثل VLA-4 - فبرونيكتين).

Introduction

تي اللمفاويات التصاق هو عملية أساسية في الاستجابة المناعية ^1. هو مطلوب منها لT تفاعل الخلايا مع الخلايا البطانية تزيين جدران الشعيرات الدموية، لمسح مستضد تقديم الخلايا (APC) داخل الغدد الليمفاوية، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعية (IS) مع الخلايا المستهدفة ^2. هذه المتطلبات وظيفيا ومتميزة kinetically. تتكون عملية التسرب من الخلايا الليمفاوية chemoattraction، المتداول، التصاق شركة، والتهجير. الانتقال من المتداول لشركة التصاق خلايا T يتطلب للرد على بروتين G جانب إشارة مستقبلات بسرعة. هذا الرد ينتج التفاعل يجند إنتغرين التي تبطئ والاعتقالات الخلية المتداول ^3. تغيير فوري في الطمع إنتغرين يتوسط هذه العملية. يتطلب الهجرة التفاعلات betweenTcells ديناميكية والخلايا البطانية مع تشكيل الالتصاقات في "الواجهة الأمامية" والكسر من التصاقات في "النهاية الخلفية"مع فاصل من حوالي دقيقة واحدة بين تشكيل وكسر ^4. ويشكل IS inminutes، ولكن يجب أن يظل سليما لساعات ^6.

ومن المثير للاهتمام، واحدة جزيء التصاق، وظيفة الخلايا اللمفاوية أفراد الأسرة إنتغرين المستضد المرافق (LFA) - 1، أمر ضروري لجميع هذه العمليات ^5. LFA-1 تتوسط الالتصاق من خلال التفاعل مع عدد من أعضاء الفصيلة المناعي. يجند معظم درس على نطاق واسع وفقا لأعلى تقارب إلى LFA-1 هو جزيء التصاق بين الخلايا (ICAM) -1. الخلايا الليمفاوية المنتشرة غير تنشيط تعبير عن انخفاض تقارب LFA-1 على سطح الخلية، وبالتالي غير قادر على الانضمام إلى السطوح ICAM-1-المغلفة. LFA-1 تقارب هو متغير وينظم العديد من الأحداث يشير مثل البروتين يقترن G تنشيط مستقبلات، والتحفيز خلوى، والإشارات بوساطة مستقبلات الخلايا التائية (TCR). الناتج شكل تقارب عالية من LFA-1 ينقل تنشيط الخلايا إلى الفضاء خارج الخلية رالتفاعلات hrough مع ICAM-1. ويطلق على هذا المسار من الداخل إلى الخارج مما يشير ^7. وبالمثل، من خلال إشارات LFA-1 من الفضاء خارج الخلية يسمى خارج في الإشارة.

في داخل الخلايا مما يشير شلالات تشارك في الداخل إلى الخارج وخارجها في إشارة هي نقطة تركيز رئيسية في الأبحاث الحالية. برزت في الآونة الأخيرة GTPase Rap1 الصغيرة كعنصر رئيسي من الداخل إلى الخارج مما يشير إلى أن من الشائع أن كلا ربط TCR ويشير خلوى ^8. وسلط الضوء على الدور الحاسم للRap1 في تفعيل إنتغرين من اكتشاف أن overexpression من Rap1 يحفز تعتمد على إنتغرين التصاق الخلايا T، في حين تم منع التصاق الخلايا التائية عن طريق التعبير عن المهيمنة Rap1 السلبية ^9. وقد تم إنجاز هذا التقدم في فهمنا للتنظيم إنتغرين بواسطة Rap1 باستخدام الأدوات في المختبر. من بينها هو مقايسة التصاق ثابت الموصوفة هنا.

الهدف العام من هذا الأسلوب هو دراسة Tالإلتصاق الخلية إلى ICAM-1 الأسطح المطلية. وبشكل أكثر تحديدا، يتم استخدامه لقياس موضوعي وقياس LFA-1 تقارب نحو بروابط مضادة في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، في ظل ظروف مختلفة. يستخدم هذا الأسلوب الآبار البوليسترين المغلفة مع ICAM-1 لتقليد السطوح الخلوية أن الخلايا T التفاعل معه. وكانت العديد من فحوصات التصاق الخلية T ثابت سبق وصفها معقدة تجريبيا. هذه المقايسات اللازمة لفي كثير من الأحيان الخلايا التائية ليكون المسمى بالإشعاع، استخدمت خلايا القرنية البقري مثقف لإنشاء المصفوفة خارج الخلية والركيزة لالتصاق الخلايا التائية، أو دعا لغير الفسيولوجية تحفيز الخلايا التائية على مدى فترة طويلة لتعزيز التصاق الخلية T ^10. استخدام القياس فلوروميتريك لتحديد خلايا T بعد الحضانة التصاق هي طريقة أكثر حساسية ودقة من القياس الكمي بالمقارنة مع التدفق الخلوي والفحص المجهري، كما تستخدم في العديد من أنظمة الفحص الأخرى ^11. بالإضافة إلى ذلك، microscop خلية واحدةلا يسمح تحليل جيم من إنتغرين توطين ل، تحليل واسع النطاق السكان مقرها في بنفس طريقة قياس فلوروميتريك. في حين أن التنشيط محددة للدولة LFA-1 الأضداد المتاحة تجاريا، هذه الأجسام المضادة توفر حساسية منخفضة نسبة إلى الطريقة الموضحة هنا. والميزة الرئيسية على التقنيات البديلة هو بساطته والقدرة على دراسة ظروف تجريبية متعددة في نفس الوقت. عند النظر في هذا الأسلوب من أجل تطبيق معين، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار أن الخلايا T يجب أن يكون محددا سلبيا، طازجة معزولة، والمسمى مع علامة فلوري.

Protocol

1. طلاء صفيحة ميكروسكوبية ويلز

ملاحظة: إن الهدف من هذه الخطوة هو على الأسطح معطف البوليسترين مع ICAM-1 لتكون بمثابة بروابط لخلية T LFA-1.

1. إعداد الحلول التالية:
   1. إعداد الحل الطلاء عن طريق إعادة التعليق المؤتلف ICAM-1 مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا ₂ هبو _4، 2 ملي KH ₂ PO _4، ودرجة الحموضة 7.4) المخصب مع الكالسيوم (1 ملم و CaCl ₂₎ والمغنيسيوم (2 نانومتر MgCl _2). تأكد من أن تركيز النهائي من ICAM-1 هو 10 ميكروغرام / مل، مصنوعة من محلول المخزون 0.7 ملغ / مل ويوضع في الفريزر -80 درجة مئوية.
   2. إعداد الحل التصاق من خلال إثراء برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ الإنسان (أو البقري) ألبومين المصل (هسا / BSA)، 2 مم MgCl _2، و 1 مم CaCl _2.
   3. إعداد الحل غسل بإضافة 2 ملي MgCl ₂ و 1 مم CaCl ₂ إلى برنامج تلفزيوني. تدفئة جميع الحلول إلى 37° C قبل الاستخدام.
2. غسل 24 بئرا مع 50 ميكرولتر من محلول الغسيل. وسوف تشمل هذه الآبار غير مغسولة، (سلطة النقد الفلسطينية معاملة الخلايا) إيجابية، وسلبية (الآبار غير المصقول) الضوابط. لكل حالة تعيين ثلاثة على الأقل من الآبار (ثلاث نسخ).
3. إضافة 50 ميكرولتر من محلول الطلاء إلى كل بئر. لا تضيف إلى آبار المراقبة غير المصقول. احتضان لمدة ساعة واحدة داخل الحاضنة 37 درجة مئوية.
4. نضح الحل طلاء بلطف، دون السماح للطرف للمس الجزء السفلي من الآبار. يغسل مرة واحدة مع 50 ميكرولتر من محلول الغسيل.
5. إضافة 50 ميكرولتر من حل التصاق واحتضان صفيحة ميكروسكوبية لساعة واحدة داخل الحاضنة 37 درجة مئوية.
6. نضح بلطف ويغسل مرة واحدة مع 50 ميكرولتر حل غسل. استخدام لوحة في نفس اليوم، ومع ذلك فمن الممكن أن يبقيه عند 4 درجات مئوية خلال الليل، واستخدامها في اليوم التالي.

2. تي خلية عزل من الدم

1. إضافة T كوكتيل إثراء خلية الإنسان على 50 ميكرولتر / مل سو الدم الكامل (على سبيل المثال لمدة 3 مل من تخثر (الهيبارين، EDTA أو سيترات) الدم الكامل، إضافة 150 ميكرولتر من الكوكتيل). تخلط جيدا.
2. احتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل إضافة 3 مل من الدم المعالج وحجم مساو من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) المخصب مع 1٪ D-جلوكوز في درجة حرارة الغرفة. المزيج بلطف مع ماصة باستور.
4. إضافة 15 مل Ficoll-PLUS Paque إلى أنبوب الطرد المركزي.
5. طبقة بعناية 6 مل مخففة عينة من الدم على المدى المتوسط ​​لمفاوية العزلة.
6. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع كسر قبالة.
7. رسم قبالة الطبقة العليا باستخدام ماصة باستير نظيفة، وترك طبقة الخلايا اللمفاوية دون عائق في واجهة. الطبقة العليا من البلازما يمكن حفظها لاستخدامها لاحقا. باستخدام ماصة باستير نظيفة نقل طبقة الخلايا اللمفاوية إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة.
8. إضافة 3 مجلدات (9 مل) من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا الليمفاوية. تعليق الخلايا بلطف جدرانالجناح لهم داخل وخارج ماصة باستور.
9. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
10. إزالة طاف. وينبغي الآن علقت الخلايا الليمفاوية في المناسبة المتوسطة إلى التطبيق. نقل الخلايا إلى ثقافة قارورة T-75 في 20 مل 1640 RPMI وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.

3. إعداد خلايا

ملاحظة: ثمة شرط أساسي هو للخلايا التي يتم وسمها مع كاشف الفلورسنت. في هذا البروتوكول استخدام كربوكسي فلوريسئين succinimidyl استر (CFSE)، بروتين فلوري ولكن الأخضر (GFP) الخلايا معربا هي بديل مقبول.

1. العد 2.4 × 10 ⁶ خلايا T (1 × 10 ⁵ لكل بئر) باستخدام عدادة الكريات.
2. resuspend الخلايا في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الثقافة المصل (التجويع المصل). احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
3. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق (400 x ج). نضح وسائل الإعلام وResuspend في 1 مل PBS.
4. إضافة CFSE في 1:1،000 التخفيف (الأسهم المبذولة ل5 ملم). تغطية عن الضوء واحتضان لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. وقف رد الفعل من خلال إضافة 10 مل من 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني وتدور في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
6. إعادة تعليق بيليه الخلية مع 1.2 مل من محلول التصاق قبل حرارة (1 × 10 ⁵ خلايا لكل 50 ميكرولتر).

4. تحفيز خلايا

ملاحظة: من أجل بدء التصاق، يجب تحفيز الخلايا. في التجربة التالية يتم تحفيز الخلايا عن طريق استخدام أجسام مضادة TCR مكافحة CD3 يشابك، ولكن للذوبان SDF-1 يمكن أن تكون بمثابة بديل. اعتمادا على الهدف من التجارب، ويمكن إضافة مختلف الكواشف الدوائية قبل أو خلال التحفيز لدراسة تأثير ذلك على التصاق الخلوية. Phorbol ميريستات خلات (سلطة النقد الفلسطينية) هو استر phorbol مشابه هيكليا للثاني الجلسرين رسول diacyl (DAG) وينشط كيناز متعددة ولق المصب في TCR (أساسا بروتين كيناز C)؛ هنا يتم استخدامه كعنصر تحكم إيجابية.

1. تدفئة صفيحة ميكروسكوبية إلى 37 درجة مئوية.
2. تقسيم الخلايا في 8 فارغة 1.5 مل أنابيب (150 ميكرولتر في كل أنبوب)، أنبوب واحد لكل حالة.
3. علاج الخلايا تبعا لذلك:
   1. تحفيز أنبوب واحد مع سلطة النقد الفلسطينية في 10 نانوغرام / مل لخدمة التحكم إيجابية. تبقي ثلاثة أنابيب غير المعالجة، لتكون بمثابة الرقابة على التحفيز ("لا التحفيز")، ومراقبة التحميل غير مغسولة ("لا يغسل")، والسيطرة على ICAM-1 طلاء ("غير المصقول").
   2. تحفيز أربعة أنابيب مع تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة لمكافحة CD3 (0.1، 1، 5، و 10 ميكروغرام / مل). الاستمرار في الخطوة التالية دون تأخير.
4. قسامة 50 ميكرولتر من مزيج خلية فارغة في كل حفز جيدا. العدد النهائي للخلايا لكل بئر هو 1 × 10 ^5.
5. وضع صفيحة ميكروسكوبية في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: بعض خطوط الخلايا T تتطلب أقصر stimula وقت نشوئها. خلال هذا الوقت، فإن الخلايا يستقر في قاع الآبار والتمسك بروابط الهدف.

5. تجرف الخلايا غير ملتصقة

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو إزالة الخلايا التي لم تكن قادرة على تشكيل اتصالات مع ضيق السطوح المغلفة يجند. استخدام ماصة الأقنية لهذه الخطوة من أجل ضمان أن نفس القوى المادية يتم تطبيقها على جميع الآبار. فمن المهم للحفاظ على آبار المراقبة المشار إليه غير مغسولة للمساعدة في حساب نسبة الخلايا الملتصقة.

1. إضافة 150 ميكرولتر من حل التصاق الحارة إلى كل الآبار. يهز لوحة بلطف لبضع ثوان قبل إزالة المتوسطة من الآبار. لا تلمس الجزء السفلي من الآبار مع النصائح.
2. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. تغيير اتجاه ماصة عندما pipetting لعازلة داخل وخارج.

6. تحديد نسبة خلايا منتسب

_content "> ملاحظة: في هذه الخطوة يتم استخدام قارئ لوحة الفلورسنت لقياس كثافة الفلورية داخل كل بئر كثافة في علاقة مباشرة مع عدد من الخلايا الملتصقة.

1. بدوره على قارئ لوحة. فتح برنامج قارئ لوحة بالنقر على أيقونة الاختصار على سطح المكتب.
   1. من القائمة "المهام" فوق "جديد" لإنشاء بروتوكول جديد.
   2. من القائمة "إجراءات" اختيار "اقرأ" الخيار. انقر على زر "كثافة نيون" وضرب "موافق" علامة التبويب.
   3. من القائمة المنسدلة حدد "الإثارة الطول الموجي 485" و "528 الطول الموجي الانبعاثات". ضرب "موافق" علامة التبويب.
   4. في "البصرية" القائمة الخيار حدد "أسفل" وضرب "موافق" علامة التبويب. العودة إلى قائمة "الأعمال" وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وانقر على زر "موافق".
   5. إدراج صفيحة ميكروسكوبية في قارئ لوحة وانقر على زر "تشغيل". وسيتم تصدير النتيجة في جداول البيانات إكسل.
2. حساب النسبة المئوية من الخلايا الملتصقة باستخدام الصيغة التالية: نسبة الخلايا الملتصقة = (متوسط ​​كثافة الفلورسنت قراءة في الآبار غسلها) / (متوسط ​​كثافة الفلورسنت قراءة في الخلايا غير مغسولة) × 100٪.

Results

وفيما يلي مثال على مقايسة التصاق باستخدام خلايا T الأولية حفز مع تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة لمكافحة CD3. فمن المفيد معرفة مضان من الخلايا غير مغسولة (أي التحميل المجموع). خلايا Unstimulated بمثابة سيطرة سلبية وسلطة النقد الفلسطينية الخلايا المعالجة هي مراقبة إيجابية للأجسام المضادة للCD3. الخلايا مطلي في الآبار غير المصقول بمثابة الرقابة على ICAM-1. في تجربة نموذجية النسبة المئوية للخلايا ملتصقة تعامل سلطة النقد الفلسطينية ما بين 40٪ إلى 50٪ في حين بلغت نسبة الخلاي...

Discussion

هناك عدة فحوصات لدراسة الإشارات إلى LFA-1 وتفعيل الخلايا التائية التصاق ^12. التدفق الخلوي يستخدم لقياس LFA-1 على تقارب في الخلايا الحية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تربط بشكل انتقائي لمحني إما تمديد أو LFA-1. واحدة من القيود المفروضة على هذه الطريقة هو أنه لا يأخذ في الاعتبار الطمع ولل integrins '. المقايسات الهجرة هي أدوات مفيدة لكنها قياس الهجرة، وليس التصاق تافه عند نقطة زمنية محددة. نماذج الماوس لدراسة الخلايا اللمفاوية T الهجرة (على سبيل المث...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
قارئ الألواح	BioTek	Synergy H1 ماصة هجينة
متعددة القنوات	فيشر	21-377-829
صفيحة دقيقة 96 بئر مع قاع بصري	Corning Costar	3603
المؤتلف ICAM-1	R & D Systems	ADP4-050
الأجسام المضادة ل CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	المجسات الجزيئية	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم	Gibco	14190250
الخلايا الليمفاوية الطرفية	< > على سبيل المثال < / م > الماوس أو كلوريد المغنيسيوم البشري
	سيجما ألدريتش	M8266
كلوريد الكالسيوم	سيجما ألدريتش	499609
برنامج الجيل الخامس المفتوح	BioTek	الإصدار 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
أنابيب الطرد المركزي 15 و 50 مل	فيشر	352099 ، 352070
ماصات باستور بلاستيكية يمكن التخلص منها	فيشر	13-711-7M
قوارير ثقافة T-75	فيشر	50-754-1366
RosetteSep طقم تشويه الخلايا	التائية StemCell Technologies	15061