يوصف طريقة لعزل السريع الميتوكوندريا الخزعات النسيجية الثدييات. تم المتجانس كبد الفئران أو مستحضرات العضلات والهيكل العظمي مع dissociator النسيج التجاري وتم عزل الميتوكوندريا عن طريق الترشيح من خلال مرشحات التفاضلي شبكة من النايلون. الميتوكوندريا الوقت العزلة هو <30 دقيقة مقارنة ب 60-100 دقيقة باستخدام طرق بديلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل السريع وتنقية الميتوكوندريا لزرع الأنسجة بواسطة التفكك والتفضيلية الترشيح
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
طرق العزلة الميتوكوندريا التي سبق وصفها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي و / أو Ficoll التدرج الطرد المركزي تتطلب 60 الى 100 دقيقة لإكمال. نحن تصف طريقة لعزل الميتوكوندريا السريع لخزعات من الثدييات باستخدام dissociator النسيج التجاري والترشيح التفاضلي. في هذا البروتوكول، يتم استبدال التجانس اليدوي مع دورة التجانس موحدة للdissociator في الأنسجة. وهذا يسمح للموحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. بعد تفكك الأنسجة، ويتم تصفية جناسة من خلال شبكة مرشحات النايلون، والتي تزيل الخطوات الطرد المركزي المتكررة. ونتيجة لذلك، والعزلة الميتوكوندريا يمكن أن يؤديها في أقل من 30 دقيقة. هذا البروتوكول العزلة ينتج حوالي 2 × 10 10 الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس من 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب) عينة الأنسجة.
المقدمة
وتوجد الميتوكوندريا في كل خلية في الجسم ما عدا خلايا الدم الحمراء وتشارك في عدد كبير من العمليات الخلوية والأيض المهمة 1-4. لأن العديد من هذه الوظائف، يمكن أن تلف الميتوكوندريا لها آثار ضارة 3. من أجل التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وضعف عدة طرق العزلة الميتوكوندريا تم وصفها. أقرب الحسابات المنشورة التاريخ العزلة الميتوكوندريا إلى 1940s 5-8. أظهرت محاولة موثقة الأولى العزلة الميتوكوندريا عن طريق طحن أنسجة الكبد في بمدافع الهاون تليها الطرد المركزي في محلول الملح على سرعة منخفضة 5،8. في وقت لاحق، وسعت مجموعات أخرى على الإجراء الأصلي وأظهرت الأنسجة تجزئة استنادا التفاضلية الطرد المركزي <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
إعداد
- إعداد 1 M-K HEPES محلول المخزون (ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع KOH).
- تحضير 0.5 M-K EGTA المالية الحل (ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع KOH).
- إعداد 1 M KH 2 PO 4 أسهم الحل.
- إعداد 1 M MgCl 2 محلول المخزون.
- إعداد المجانسة العازلة (درجة الحموضة 7.2) 300 ملي السكروز، K-10 ملي HEPES، وK-1 ملم EGTA. تخزينها في 4 درجة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد الرقم يحدد الخطوات الإجرائية في عزل الميتوكوندريا باستخدام تفكك الأنسجة والترشيح الفارق في الشكل 1. مجموع الوقت الإجرائي هو أقل من 30 دقيقة.
وتم الحصول على عينات الأنسجة باستخدام 6 ملم خزعة لكمة. كان وزن النسيج 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب). بلغ عدد الميتوكوندريا المعزولة على النحو الذي يحدده حجم الجسيمات العد 2.4 × 10 10 ± 0.1 × 10 10 الميتوكوندريا لعضلات الهيكل العظم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لعزل الميتوكوندريا بنجاح باستخدام هذا البروتوكول لا بد من الحفاظ على كل الحلول وعينات الأنسجة على الجليد للحفاظ على استمرارية الميتوكوندريا. حتى عندما حافظت على الجليد، والميتوكوندريا المعزولة تظهر انخفاضا في النشاط الوظيفي على مر الزمن 19. ونحن نوصي جميع الحلول والإضافات يكون قبل إعداد. نحن قبل تزن وتخزين سبتيليزين ألف في 4 مأخوذة ملغ في 1.5 مل أنابيب microfuge وتخزينها في -20 درجة مئوية. وبالمثل BSA يوزن مسبقا وتخزينها في 20 مأخوذة ملغ في 1.5 مل أنابيب microfuge التي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تم علاج جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية الحالية. ليس لدينا مصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذه الدراسة من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد جرانت HL- 103542، وجائزة تريل بليزر المتميزة المؤسسة الغرفة بحوث التخدير لCAP.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| السكروز | سيجما ألدريتش | 84100 | |
| هيبس | سيجما ألدريتش | H4034 | |
| EGTA | سيجما ألدريتش | E4378 | |
| Substilsin A | سيجما ألدريتش | P5380 | |
| BSA | سيجما ألدريتش | A7906 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | سيجما ألدريتش | P5379 | |
| MgCl2< / sub> | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite نظام فحص اللمعان ، 1,000 مجموعة الفحص | Perkin Elmer | 6016941 | |
| 50 مل أنابيب مخروطية | دينار بحريني | 352098 | |
| 40 مو ؛ م مرشحات النايلون | BD & nbsp ؛ | 352340 | |
| GentleMACS C أنبوب | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 مل أنبوب Eppendorf | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 مم خزعة لكمة | Miltex | 33-36 | |
| 10 & م Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf الطرد المركزي 5415C | مارشال Scientific | EP-5415C & nbsp ؛ | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| ألواح 96 بئر ، معالجة زراعة الأنسجة | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 شاكر مداري | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 الهجين متعدد الأوضاع ؛ قارئ Microplate | BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| نظام Oxytherm | Hansatech Instruments | ||
| الدم | فيشر Scientific | 267110 |
المراجع
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
