مقالة منهجية

عزل السريع وتنقية الميتوكوندريا لزرع الأنسجة بواسطة التفكك والتفضيلية الترشيح

DOI:

10.3791/51682

⸱

سبتمبر 6, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف طريقة لعزل السريع الميتوكوندريا الخزعات النسيجية الثدييات. تم المتجانس كبد الفئران أو مستحضرات العضلات والهيكل العظمي مع dissociator النسيج التجاري وتم عزل الميتوكوندريا عن طريق الترشيح من خلال مرشحات التفاضلي شبكة من النايلون. الميتوكوندريا الوقت العزلة هو <30 دقيقة مقارنة ب 60-100 دقيقة باستخدام طرق بديلة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طرق العزلة الميتوكوندريا التي سبق وصفها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي و / أو Ficoll التدرج الطرد المركزي تتطلب 60 الى 100 دقيقة لإكمال. نحن تصف طريقة لعزل الميتوكوندريا السريع لخزعات من الثدييات باستخدام dissociator النسيج التجاري والترشيح التفاضلي. في هذا البروتوكول، يتم استبدال التجانس اليدوي مع دورة التجانس موحدة للdissociator في الأنسجة. وهذا يسمح للموحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. بعد تفكك الأنسجة، ويتم تصفية جناسة من خلال شبكة مرشحات النايلون، والتي تزيل الخطوات الطرد المركزي المتكررة. ونتيجة لذلك، والعزلة الميتوكوندريا يمكن أن يؤديها في أقل من 30 دقيقة. هذا البروتوكول العزلة ينتج حوالي 2 × 10 10 الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس من 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب) عينة الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتوجد الميتوكوندريا في كل خلية في الجسم ما عدا خلايا الدم الحمراء وتشارك في عدد كبير من العمليات الخلوية والأيض المهمة 1-4. لأن العديد من هذه الوظائف، يمكن أن تلف الميتوكوندريا لها آثار ضارة 3. من أجل التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وضعف عدة طرق العزلة الميتوكوندريا تم وصفها. أقرب الحسابات المنشورة التاريخ العزلة الميتوكوندريا إلى 1940s 5-8. أظهرت محاولة موثقة الأولى العزلة الميتوكوندريا عن طريق طحن أنسجة الكبد في بمدافع الهاون تليها الطرد المركزي في محلول الملح على سرعة منخفضة 5،8. في وقت لاحق، وسعت مجموعات أخرى على الإجراء الأصلي وأظهرت الأنسجة تجزئة استنادا التفاضلية الطرد المركزي 6-8. هذه الأساليب المبكرة شكلت أساس التقنيات الحالية والتي غالبا ما تتضمن التجانس، و / أو التفاضلية الطرد المركزي 9-15. عدد homogenizatiعلى الطرد المركزي والخطوات يختلف بين البروتوكولات. هذه الخطوات المتكررة تزيد من الوقت لعزل الميتوكوندريا وفي نهاية المطاف خفض قدرتها على البقاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسبب أضرارا التجانس اليدوي وتتعارض النتائج الميتوكوندريا إذا لم يتم السيطرة بشكل صحيح 10،16.

في الآونة الأخيرة، كنا التجانس والتفضيلية الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا لزرعها في أنسجة عضلة القلب 17،18. هذا الإجراء يتطلب عزلة طويلة ما يقرب من 90 دقيقة وكان انطباق السريري لهذه الطريقة بالتالي محدود. للسماح للاستخدام العلاجي الحاد في العلاج السريري والجراحية وضعنا الداخلي العزلة الميتوكوندريا السريع التي يمكن القيام بها في أقل من 30 دقيقة.

الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن تفكك نسيج موحد يسمح موحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. في additأيون، واستخدام الترشيح التفاضلي في مكان الطرد المركزي التفاضلي يلغي تستغرق وقتا طويلا والخطوات الطرد المركزي المتكررة السماح لعزل أسرع من الميتوكوندريا المختصة العالية النقاء وقابلة للحياة والتنفس.

القدرة على عزل الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس في أقل من 30 دقيقة تسمح للتطبيق السريري. هذا البروتوكول العزلة لديها امكانات للاستخدام في جراحة الشريان التاجي الالتفافية تطعيم (CABG) والإجراءات العلاجية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد

  1. إعداد 1 M-K HEPES محلول المخزون (ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع KOH).
  2. تحضير 0.5 M-K EGTA المالية الحل (ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع KOH).
  3. إعداد 1 M KH 2 PO 4 أسهم الحل.
  4. إعداد 1 M MgCl 2 محلول المخزون.
  5. إعداد المجانسة العازلة (درجة الحموضة 7.2) 300 ملي السكروز، K-10 ملي HEPES، وK-1 ملم EGTA. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  6. إعداد التنفس العازلة 250 ملي السكروز، 2 مم KH 2 PO 4، 10 ملم MgCl 2 و 20 ملي K-HEPES العازلة (درجة الحموضة 7.2) و 0.5 ملي K-EGTA (8.0 درجة الحموضة). تخزينها في 4 درجة مئوية.
  7. إعداد 10X PBS المالية الحل عن طريق إذابة 80 جم من كلوريد الصوديوم، و 2 غرام من بوكل، 14.4 غرام من نا 2 هبو 4، و 2.4 غرام من KH 2 PO 4 في 1 L مزدوج المقطر H 2 O (7.4 درجة الحموضة).
  8. إعداد 1X PBS قبل pipetting 100 مل 10X PBS إلى 1 L مزدوج المقطر H 2 O.
  9. إعداد سبتيليزين مخزون من وزنها من 4 ملغ من سبتيليزين ألف فيإلى أنبوب 1.5 مل microfuge. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  10. إعداد BSA المالية التي وزنها من 20 ملغ من BSA في أنبوب 1.5 مل microfuge. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

عزل الميتوكوندريا (الشكل 1)

  1. مباشرة قبل العزلة، ويحل سبتيليزين ألف في 1 مل من المجانسة العازلة.
  2. مباشرة قبل العزلة، ويحل BSA في 1 مل من المجانسة العازلة.
  3. جمع عينتين أنسجة جديدة باستخدام 6 ملم عينة خزعة لكمة وتخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
  4. نقل اثنين من اللكمات 6 ملم من الأنسجة لأنبوب التفكك C تحتوي على 5 مل من البرد الجليد التجانس العازلة.
  5. تجانس الأنسجة عن طريق تركيب أنبوب C التفكك على dissociator الأنسجة وتحديد دورة العزلة الميتوكوندريا المحددة مسبقا (60 ثانية التجانس).
  6. إزالة أنبوب التفكك C إلى دلو الجليد.
  7. إضافة 250 ميكرولتر من سبتيليزين مخزون الحل لجناسة، مزيج من انعكاس واحتضان جناسة على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  8. وضع مرشح شبكة 40 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
  9. إضافة 250 ميكرولتر من الطازجة BSA الحل لاسهم الراشح وتخلط بواسطة انقلاب.
    ملاحظة: حذفت هذه الخطوة إذا كان مطلوبا الميتوكوندريا تقرير البروتين.
  10. وضع مرشح 40 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
  11. وضع مرشح 10 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
  12. نقل الترشيح لاثنين قبل المبردة 1.5 مل أنابيب microfuge والطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 10 دقيقة في4 درجة مئوية.
  13. إزالة طاف وإعادة تعليق والجمع بين الكريات في 1 مل من الجليد الباردة التنفس العازلة.

ATP الفحص

ملاحظة: لتحديد النشاط الأيضي الميتوكوندريا المعزولة والتلألؤ فحص ATP يمكن أن يؤديها باستخدام عدة ATP الفحص. بروتوكول، تم تزويد الكواشف والمعايير في عدة الفحص. يوصف ملخص الإجراء أدناه.

  1. تتوازن الكواشف عدة لRT.
  2. إعداد 10 ملي ATP المالية الحل عن طريق إذابة بيليه ATP مجفف بالتجميد في 1،170 ميكرولتر من الماء المقطر مزدوجة. تخزين ATP المالية القياسية الحل وعينات الميتوكوندريا مستعدة على الجليد.
  3. إضافة 5 مل من محلول الركيزة العازلة إلى قارورة من حل الركيزة مجفف بالتجميد. المزيج بلطف ووضع في الظلام.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التنفس لجميع آبار سوداء، أسفل مبهمة، 96 لوحة جيدا.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من الميتوكوندريا من العينات مستعدة لكل بئر ساتحاد كرة القدم الأسود، أسفل مبهمة، 96 لوحة جيدا. ملاحظة: يتم مطلي العينات في ثلاث نسخ. تشمل على التوالي لمعايير وثلاثة آبار للسيطرة سلبية (التنفس الاحتياطي).
  6. إضافة 50 ميكرولتر من الثدييات حل تحلل الخلية لجميع الآبار، بما في ذلك المعايير والضوابط.
  7. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على شاكر المداري في 125 دورة في الدقيقة.
  8. أثناء الحضانة إعداد معايير ATP في تركيزات 0.1 ملم، 0.05 ملم، 0.01 ملم، 0.005 ملم، 0.001 ملم، و0.0001 ملي ATP من 10 ملي ATP المالية الحل. مخزن المعايير على الجليد.
  9. بعد الحضانة، وإضافة 10 ميكرولتر من المعايير ATP إلى الآبار المقابلة كما هو موضح على الخريطة وحة. يتم تنفيذ المعايير في نسختين: مذكرة.
  10. إضافة 50 ميكرولتر من الحل الركيزة أعيد إلى كل بئر.
  11. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري لمدة 5 دقائق عند 125 دورة في الدقيقة.
  12. مفتوحة Gen5 1.11 البرنامج على جهاز كمبيوتر مرتبط مع طيفي.
  13. تحت عنوان "إنشاء عنصر جديد "، انقر على" تجربة ".
  14. انقر على "بروتوكول الافتراضي". انقر على "موافق".
  15. في العمود الأيسر، حدد "البروتوكول"، ثم "الداخلي".
  16. حدد "تأخير". تعيين ل00:10:00. انقر على "موافق".
  17. حدد "اقرأ". حدد "التلألؤ" من القائمة المنسدلة. ضبط الإعدادات الأخرى إلى ما يلي: اقرأ نوع نقطة النهاية والتكامل الوقت 0: 01.00 MM: SS.ss، تصفية مجموعات 1، الانبعاثات هول، البصريات الوظيفة الأعلى، الحساسية 100، أوفست الأعلى المسبار الرأسي 1.00 ملم.
  18. عندما لوحة جاهزة للتحليل، انقر فوق "قراءة لوحة" أيقونة على الصف العلوي. انقر على "اقرأ". عندما يفتح طيفي، ووضع لوحة في علبة مع جيدا A1 في الزاوية اليسرى العليا. سوف يظهر مربع مع درجة حرارة فتح. انقر على "اقرأ". ملاحظة: القيم العليا ترتبط مع زيادة مستويات ATP والنشاط الأيضي العالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد الرقم يحدد الخطوات الإجرائية في عزل الميتوكوندريا باستخدام تفكك الأنسجة والترشيح الفارق في الشكل 1. مجموع الوقت الإجرائي هو أقل من 30 دقيقة.

وتم الحصول على عينات الأنسجة باستخدام 6 ملم خزعة لكمة. كان وزن النسيج 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب). بلغ عدد الميتوكوندريا المعزولة على النحو الذي يحدده حجم الجسيمات العد 2.4 × 10 10 ± 0.1 × 10 10 الميتوكوندريا لعضلات الهيكل العظم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لعزل الميتوكوندريا بنجاح باستخدام هذا البروتوكول لا بد من الحفاظ على كل الحلول وعينات الأنسجة على الجليد للحفاظ على استمرارية الميتوكوندريا. حتى عندما حافظت على الجليد، والميتوكوندريا المعزولة تظهر انخفاضا في النشاط الوظيفي على مر الزمن 19. ونحن نوصي جميع الحلول والإضافات يكون قبل إعداد. نحن قبل تزن وتخزين سبتيليزين ألف في 4 مأخوذة ملغ في 1.5 مل أنابيب microfuge وتخزينها في -20 درجة مئوية. وبالمثل BSA يوزن مسبقا وتخزينها في 20 مأخوذة ملغ في 1.5 مل أنابيب microfuge التي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم علاج جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية الحالية. ليس لدينا مصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد جرانت HL- 103542، وجائزة تريل بليزر المتميزة المؤسسة الغرفة بحوث التخدير لCAP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
السكروزسيجما ألدريتش84100
هيبسسيجما ألدريتشH4034
EGTAسيجما ألدريتشE4378
Substilsin Aسيجما ألدريتشP5380
BSAسيجما ألدريتشA7906
KH2< / sub>PO4< / sub>سيجما ألدريتشP5379
MgCl2< / sub>Sigma AldrichM8266
NaClSigma AldrichS6191
KClFisher ScientificP2173
Na2< / sub>HPO4< / sub>Fisher ScientificS374
ATPlite نظام فحص اللمعان ،
1,000 مجموعة الفحص		Perkin Elmer6016941
50 مل أنابيب مخروطيةدينار بحريني352098
40 مو ؛ م مرشحات النايلونBD & nbsp ؛352340
GentleMACS C أنبوبMiltenyl Biotech120-005-331
1.5 مل أنبوب EppendorfFisher Scientific05-408-129
6 مم خزعة لكمةMiltex33-36
10 & م PluristrainerPluriselect43-500-10-03
Eppendorf الطرد المركزي 5415Cمارشال ScientificEP-5415C & nbsp ؛
GentleMACS Dissociator Miltenyl Biotech130-093-235
ألواح 96 بئر ، معالجة زراعة الأنسجةVWR82050-732
Rotomax 120 شاكر مداريHeidolph544-41200-00
Synergy H4 الهجين متعدد الأوضاع
  ؛ قارئ Microplate		BioTek
Multisizer 4 Coulter CounterBeckman CoulterA63076
نظام OxythermHansatech Instruments
الدمفيشر Scientific267110
مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317(2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

الوسوم

ATP

مقالات ذات صلة