وقد استخدمت على نطاق واسع تسليخ مجهري لفحص الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات داخل الأنسجة. القبض على الليزر المجهري (LCM) هو الأسلوب الأكثر شيوعا، ولكن تقنية الطحن الجديدة، mesodissection، وهو متاح في الآونة الأخيرة. ونحن لشرح استخراج الحمض النووي الريبي من mesodissected الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح حبيبية المتفطرة السلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
وقد استخدم تسليخ مجهري لفحص الأنسجة في الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، ومستويات بروتين لأكثر من عقد من الزمان. القبض على الليزر المجهري (LCM) هو الأسلوب الأكثر شيوعا تسليخ مجهري اليوم. في هذه التقنية، يتم استخدام الليزر لإذابة الوزراء البريطانى غشاء لدن أن يعتلي قسم الأنسجة المجففة 1. ثم يتم رفع قسم الأنسجة المركبة وفصلها عن الغشاء. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تستخدم بنجاح للفحص الأنسجة، وذلك هو مضيعة للوقت ومكلفة. وعلاوة على ذلك، والانتهاء بنجاح من الإجراءات باستخدام هذه التقنية يتطلب استخدام ليزر، مما يحد من استخدامها. نهج تسليخ مجهري أكثر بأسعار معقولة وعملية جديدة تسمى mesodissection هو الحل الممكن لمطبات LCM. هذه التقنية تستخدم نظام MESO-1/MeSectr إلى طاحونة الأنسجة المطلوب من شريحة شنت عينة الأنسجة في حين الاستغناء وقت واحد والشفط السوائل لاسترداد عينة الأنسجة المطلوب فيقليلا مطحنة للاستهلاك. قبل أن تبدأ عملية تشريح، بمحاذاة المستخدم البارافين جزءا لا يتجزأ من الفورمالين الثابتة (FFPE) ينزلق مع الهيماتوكسيلين ويوزين الملون (H & E) الشريحة المرجعية. بعد ذلك، المشغل بشرح منطقة تشريح المطلوب والعائدات لتشريح شريحة المناسبة. برنامج يولد صورة أرشيفية للتشريح. والميزة الرئيسية لmesodissection هي مدة قصيرة اللازمة لتشريح شريحة، مع ما معدله عشر دقائق من إعداد لأخذ عينات من جيل في هذه التجربة. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام أكثر بكثير فعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستعمال. والعيب طفيف هو أنه ليست دقيقة مثل التقاط الليزر المجهري. في هذه المقالة ونحن لشرح كيف يمكن استخدام mesodissection لاستخراج الحمض النووي الريبي من الشرائح من حبيبية FFPE الناجمة عن المتفطرة السلية (MTB).
المقدمة
عينات تقليديا microdissected يدويا من الأنسجة إما كليا أو الشرائح باستخدام إبرة ومشرط. هذا يستلزم وجود فصل واضح بين قسم الأنسجة من الاهتمام والأنسجة المحيطة بها القسمين 2. مع التقدم الحالي في مجال تكنولوجيا التنميط الجزيئي، كانت هناك حاجة متزايدة لتقييم الأنسجة على المستوى الخلوي. بسبب القيود المفروضة على تسليخ مجهري دليل، أنشئت التقنيات بما في ذلك LCM للسماح بمزيد من الدقة العزلة. هذه التقنية تسمح للباحث لعزل السكان خلية معينة من مختلف أنواع الخلايا والشرائح، والتي يمكن ان تستخدم بعد ذلك لفحوصات المصب مثل التنميط التعبير الجيني. على الرغم من أن فعالة جدا لفحوصات المصب، LCM لا يخلو من القيود. الأولى، LCM هي عملية مكل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. معايرة Mesodissection الصك مع 2iD برامج التصوير
وسوف تحال برامج التصوير ل2iD إما البرنامج أو البرنامج للفترة المتبقية من هذا المقال. وهناك حاجة لتعقب هذه الخطوة بشكل صحيح الصورة وكذلك مواءمة الأطر الشريحة متعددة.
- بدوره على الصك والكمبيوتر.
- البرمجيات مفتوحة وحدد "أداة معايرة".
- معايرة السفر المرحلة باستخدام عصا التحكم. الانتقال إلى مرحلة الموضع الأيسر العلوي. اضغط على "مج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين البروتوكول المذكور أعلاه كيفية استخدام تقنية mesodissection جديدة لاستخراج الحمض النووي الريبي من FFPE الشرائح الأنسجة. وأظهرت فعالية هذا البروتوكول من خلال الشرائح FFPE من حبيبية الرئة من NHP المصابين المواضيع المتميزة في مختلف المراحل المعدية. أرقام 1-3 عبارة عن صور من الصك. الشكل 4 يصور كيفية حدوث عملية تشريح والصورة الناتجة التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج. الجدول 1 يبين نتائج استخراج الحمض النووي الريبي مع الحبي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Mesodissection هو الاسلوب الذي يمكن تطبيقه على استخراج الحمض النووي الريبي من الشرائح الآفة المرضية الناجمة عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض. بل هو ضرورة أن المستخدم يقيس الصورة ومحاذاة الصورة بشكل صحيح. لتحقيق ذلك، يجب معايرة الصك التالية التوجيهات على برامج التصوير. عند تشريح، إذا الشريحة ومجال الاهتمام يجري تشريح لا محاذاة، يجب على المستخدم إعادة ضبط الصك. آخر خطوة حاسمة في عملية تشريح لتحميل طاحونة الشيء الاستهلاكية بطريقة بحيث يخلو من الفقاعات قبل تشريح (الخطوة 5.1). وقد وجد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب يكشف عن أنه لا توجد المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه التالية NIH الجوائز / subawards لدعم هذا البحث: R01HL106790، R01HL106790-S1، R01HL106786، R01AI089323، R21AI091457، R21RR026006، P20RR020159، C06RR017563، 8T32OD011124-08، وP51OD011104.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | أحجام أخرى متوفرة | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | كياجين | 28104 |
المراجع
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer spe....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
الوسوم
