وقد استخدمت على نطاق واسع تسليخ مجهري لفحص الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات داخل الأنسجة. القبض على الليزر المجهري (LCM) هو الأسلوب الأكثر شيوعا، ولكن تقنية الطحن الجديدة، mesodissection، وهو متاح في الآونة الأخيرة. ونحن لشرح استخراج الحمض النووي الريبي من mesodissected الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح حبيبية المتفطرة السلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
وقد استخدم تسليخ مجهري لفحص الأنسجة في الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، ومستويات بروتين لأكثر من عقد من الزمان. القبض على الليزر المجهري (LCM) هو الأسلوب الأكثر شيوعا تسليخ مجهري اليوم. في هذه التقنية، يتم استخدام الليزر لإذابة الوزراء البريطانى غشاء لدن أن يعتلي قسم الأنسجة المجففة 1. ثم يتم رفع قسم الأنسجة المركبة وفصلها عن الغشاء. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تستخدم بنجاح للفحص الأنسجة، وذلك هو مضيعة للوقت ومكلفة. وعلاوة على ذلك، والانتهاء بنجاح من الإجراءات باستخدام هذه التقنية يتطلب استخدام ليزر، مما يحد من استخدامها. نهج تسليخ مجهري أكثر بأسعار معقولة وعملية جديدة تسمى mesodissection هو الحل الممكن لمطبات LCM. هذه التقنية تستخدم نظام MESO-1/MeSectr إلى طاحونة الأنسجة المطلوب من شريحة شنت عينة الأنسجة في حين الاستغناء وقت واحد والشفط السوائل لاسترداد عينة الأنسجة المطلوب فيقليلا مطحنة للاستهلاك. قبل أن تبدأ عملية تشريح، بمحاذاة المستخدم البارافين جزءا لا يتجزأ من الفورمالين الثابتة (FFPE) ينزلق مع الهيماتوكسيلين ويوزين الملون (H & E) الشريحة المرجعية. بعد ذلك، المشغل بشرح منطقة تشريح المطلوب والعائدات لتشريح شريحة المناسبة. برنامج يولد صورة أرشيفية للتشريح. والميزة الرئيسية لmesodissection هي مدة قصيرة اللازمة لتشريح شريحة، مع ما معدله عشر دقائق من إعداد لأخذ عينات من جيل في هذه التجربة. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام أكثر بكثير فعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستعمال. والعيب طفيف هو أنه ليست دقيقة مثل التقاط الليزر المجهري. في هذه المقالة ونحن لشرح كيف يمكن استخدام mesodissection لاستخراج الحمض النووي الريبي من الشرائح من حبيبية FFPE الناجمة عن المتفطرة السلية (MTB).
المقدمة
عينات تقليديا microdissected يدويا من الأنسجة إما كليا أو الشرائح باستخدام إبرة ومشرط. هذا يستلزم وجود فصل واضح بين قسم الأنسجة من الاهتمام والأنسجة المحيطة بها القسمين 2. مع التقدم الحالي في مجال تكنولوجيا التنميط الجزيئي، كانت هناك حاجة متزايدة لتقييم الأنسجة على المستوى الخلوي. بسبب القيود المفروضة على تسليخ مجهري دليل، أنشئت التقنيات بما في ذلك LCM للسماح بمزيد من الدقة العزلة. هذه التقنية تسمح للباحث لعزل السكان خلية معينة من مختلف أنواع الخلايا والشرائح، والتي يمكن ان تستخدم بعد ذلك لفحوصات المصب مثل التنميط التعبير الجيني. على الرغم من أن فعالة جدا لفحوصات المصب، LCM لا يخلو من القيود. الأولى، LCM هي عملية مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. بالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى الطبيعة غير المستقرة من الحمض النووي الريبي، فإنه غالبا ما يشكل تحديا للحصول على جودة عالية الحمض النووي الريبي من عينات LCM 2. نظرا لديsadvantages من LCM، التطورات الجديدة في التكنولوجيا تسليخ مجهري لا تزال هناك حاجة لجعلها في متناول عدد أكبر من الباحثين بطريقة حساسة بأسعار معقولة والوقت.
واحدة من هذه التقدم في التكنولوجيا تسليخ مجهري تتوفر الآن تقنية تعرف باسم mesodissection. في هذا الأسلوب يتم استخدام آلة لطحن قسم الأنسجة المشروح من الاهتمام وحرف هاء قبل أن تتحول إلى استهلاك مطحنة بت 3. المقبل، يمكن أن يستنشق هذه العينة في أنبوب جمع وتستخدم للتطبيقات المصب. مزايا هذا النظام هي أنه أقل تكلفة ووقت حساس. في تجربتنا، ونظام يسمح للتشريح قسم الأنسجة الورم الحبيبي الرئة في عشر دقائق. من ناحية أخرى، فإن LCM التقليدية المرجح أن يتطلب ساعات لإتمام العملية. نظام يسمح للمشغل لتحميل شريحة إشارة إلى استخدام وعلى سبيل المقارنة، وكذلك أداة للالشرح. بالإضافة إلى ذلك يتم إنشاء تقرير يوضح المنطقة (ه) من الشريحة التي تم تشريح. هناك نوعان من عيوب الرئيسي لmesodissection. على الرغم من فعالية في استخراج خلايا متعددة، فإنه يمثل تحديا لعزل خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك، دقة الصورة الناتجة ليست واضحة كما لو باستخدام المجاهر التصوير الأخرى.
السل (TB) هو القاتل الرئيسي الأمراض المعدية الإنسانية في جميع أنحاء العالم والنتائج من الإصابة بفيروس المواضيع المتميزة. في الغالبية العظمى من الأفراد المعرضين لهباء من المواضيع المتميزة، هو عدوى محدودة خفية. في 10 ملايين شخص سنويا على الأقل، فإنه يؤدي إلى مرض السل النشط 4. خلال العدوى الكامنة، ويرد MTB داخل آفات الرئة المرضية المعروفة باسم الأورام الحبيبية. ومن ثم فقد قيل أن نتائج العدوى MTB تقرر على مستوى الورم الحبيبي 5.
نحن هنا لشرح كيف يمكن استخدام mesodissection لmicrodissect حبيبية الناجمة عن المواضيع المتميزة. الشرائح المستخدمةهي من FFPE أنسجة الرئة من المكاك وهو قرد اسيوي المصابة. لغرض هذه المظاهرة، ونحن سوف تشريح حبيبية في مجملها. علينا أن نبرهن أيضا أن الحمض النووي الريبي يمكن استخراجها من النسيج استردادها. ويمكن تطبيق هذه التقنية لعينات الأنسجة من مختلف عينات أخرى ومن ثم تستخدم لمجموعة متنوعة من المقايسات المصب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. معايرة Mesodissection الصك مع 2iD برامج التصوير
وسوف تحال برامج التصوير ل2iD إما البرنامج أو البرنامج للفترة المتبقية من هذا المقال. وهناك حاجة لتعقب هذه الخطوة بشكل صحيح الصورة وكذلك مواءمة الأطر الشريحة متعددة.
- بدوره على الصك والكمبيوتر.
- البرمجيات مفتوحة وحدد "أداة معايرة".
- معايرة السفر المرحلة باستخدام عصا التحكم. الانتقال إلى مرحلة الموضع الأيسر العلوي. اضغط على "مجموعة" تحت الخطوة 1 في البرنامج.
- تحرك مرحلة لخفض الموقف الصحيح. اضغط على "مجموعة" تحت الخطوة 2 في البرنامج.
- معايرة تطلع عن طريق الضغط على أول "Z-زر" التجمع لرفع الرأس. اضغط على زر "نضح نبض" والزر "تشريح" على عصا التحكم حتى السيطرة الغطاس قضيب يصل المنصب. اضغط على "مجموعة" تحت الخطوة 3 من البرنامج.
- اضغط على "إعادة تعيين نضح و# 8221؛ الزر. مرة واحدة توقف المكبس في أسفل موقف الصحافة "مجموعة" في الخطوة 4.
- انقر على علامة التبويب "نطاق".
- وضع معايرة المسطرة على الجانب الفارغ.
- التركيز المجهر إذا لزم الأمر.
- رسم خط بين اثنين من قضبان نطاق باستخدام الماوس.
- أدخل مسافة مربع وصفت الخطوة 2. اضغط على "حساب" زر في.
- انقر على "التقاطع" علامة التبويب. تحويل سرعة المحرك إلى 1.
- إدراج xScisor في التجمع الرأس. انخفاض التجمع في الرأس ض محور موقف جاهزة عن طريق الضغط على زر "ض محور". ملاحظة: الجمعية الرأس هو هيكل كبير على أعلى الصك تشريح. وسوف تحال إلى xScisor كما قليلا مطحنة الاستهلاكية للفترة المتبقية من هذا المقال.
- انقر على زر "تشريح الانخراط" الموجود على عصا التحكم. ملاحظة: يقع هذا الزر على الجزء العلوي من عصا التحكم.
- تحديد مركز الدوران بصريا. للقيام بذلك، والتحرك وسط التقاطع أكثر من مركز الدوران باستخدام تعريفد المعلمة في الخطوة 1 من البرنامج. استخدام الأسهم صعودا وهبوطا في "س" والقضبان "المحور الصادي" لضبط بكسل لمحاذاة التقاطع. انقر فوق "تم" علامة التبويب.
- انقر على أيقونة "الوطن". ملاحظة: يتم تمثيل ذلك من خلال صورة منزل يقع في الزاوية العليا اليمنى.
2. إنشاء مرجع صورة
- وضع H & E الشريحة على خشبة المسرح. وضع غطاء على رأس مبهمة الشريحة. دفع الصك عن طريق تحريك عصا التحكم لمنطقة المرجوة من H & E الشريحة. حفظ الصورة الناتجة. ملاحظة: إما أن "التقاط إشارة" أو علامة التبويب "تشريح" التبويب يمكن استخدامها لإكمال هذه الخطوة.
3. محاذاة لتشريح الأنسجة
- انقر على "تشريح الأنسجة" الخيار على الشاشة الرئيسية.
- ملء "المشغل"، "عدد تشريح الانضمام"، "الرقم المرجعي الانضمام"، "رقم الباركود xScisor،" & #8220؛ تشريح الكثير السوائل عدد "،" حجم xScisor "و" صفا "في" الإعداد "علامة التبويب.
- انقر على "العثور على الأنسجة" علامة التبويب.
- الاستيراد المحفوظة مسبقا صورة المرجعية.
- وضع الشريحة FFPE غير ملوثين من 5 ميكرون سمك على المسرح. الانتقال إلى مرحلة نفس المنطقة بوصفها واحدة صورت في الصورة المرجعية. انقر على "إدراج صورة" التبويب.
- انقر على "محاذاة" التبويب. استخدام الماوس والأسهم المرتبطة بها لمحاذاة الصورة إشارة إلى صورة غير ملوثين.
4. علق الشرائح
- انقر على "علق" علامة التبويب.
- استخدام الماوس لرسم دائرة حول المنطقة المرغوب فيه من الشريحة التي سيتم microdissected.
5. تحميل مستهلكات مطحنة بت
- ملء الاستهلاكية طاحونة الشيء مع العازلة المطلوب، هنا عازلة دليل المفاتيح العامة، عن طريق سحب المكبس صعودا وهبوطا في حركة السوائل عدة مرات. تأكد استبعاد الهواءالفقاعات.
- رفع Z-محور طريق الضغط على "زر Z-المحور".
- تحميل الاستهلاكية مطحنة بت في الجهاز. القيام بذلك عن طريق تحريك طاحونة الشيء الاستهلاكية في الجزء العلوي من الجهاز بحيث خط أبيض على خطوط الصك حتى مع خط أسود على مطحنة بت الاستهلاكية. اضغط على "إعادة تعيين الطموح" الزر للسماح المكبس ليتم إنزالها في الموضع الصحيح. ملاحظة: يجب أن يكون من السهل أن تنزلق طاحونة الشيء الاستهلاكية. إذا لم يكن، تأكد من محاذاة الشقوق بشكل صحيح.
- أقل Z-المحور بواسطة الضغط على زر مرة أخرى "Z-المحور".
6. تشريح الأنسجة (الشكل 4)
- فتح "تشريح" علامة التبويب.
- تحويل السيارات وتطلع بسرعة إلى 1.
- خانة الاختيار "إظهار تتبع". ملاحظة: هذا يسمح للمستخدم لتصور منطقة تشريح أثناء عملية التشريح.
- مرة واحدة على استعداد للتشريح، والاستمرار في عقد زر "المشاركة" وكذلك "نضح & #8221؛ زر عصا التحكم في الوقت الذي يتجه في اتجاه عكس عقارب الساعة لتشريح الأنسجة.
- يواصل تشريح في اتجاه عكس عقارب الساعة حتى نضح هو علامة التبويب "الكامل" أحمرا.
7. إفراغ وإزالة مستهلكات مطحنة بت
- وضع أنبوب microfuge 0.5 ميكرولتر تحت غيض من طاحونة الشيء الاستهلاكية.
- اضغط على "الطموح" قضيب التحكم بسرعة لإخراج العينة إلى microfuge أنبوب.
- الصحافة مع زيادة القوة لإخراج المستخدمة للاستهلاك طاحونة الشيء.
- شطف جزء الأنسجة عن طريق سحب المكبس الخلفي. دفع المكبس إلى الأمام للتعبير عن العينة المتبقية في استهلاك طاحونة الشيء. سيتم الآن الوارد جزء الأنسجة داخل microfuge أنبوب.
8. عينة ليز مع بروتين الهضم K تلاه المعالجة الحرارية
- إضافة 70 ميكرولتر TE درجة الحموضة 8.5 تحتوي على 5 ميكروغرام من بروتين كاف لانتشال عينة الأنسجة.
- وضع العينة في برمجة سخان شاكر.
- الهضم الكامل للبرمجة باستخدام سخان شاكر في الإعداد التالي: 60 ˚ مئوية لمدة 30 دقيقة في 1،500 دورة في الدقيقة؛ 82 ˚ مئوية لمدة 15 دقيقة في 1،500 دورة في الدقيقة؛ و25 ˚ مئوية لمدة 1 دقيقة في 450 دورة في الدقيقة. العينة هو الآن على استعداد لتطبيقات المصب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين البروتوكول المذكور أعلاه كيفية استخدام تقنية mesodissection جديدة لاستخراج الحمض النووي الريبي من FFPE الشرائح الأنسجة. وأظهرت فعالية هذا البروتوكول من خلال الشرائح FFPE من حبيبية الرئة من NHP المصابين المواضيع المتميزة في مختلف المراحل المعدية. أرقام 1-3 عبارة عن صور من الصك. الشكل 4 يصور كيفية حدوث عملية تشريح والصورة الناتجة التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج. الجدول 1 يبين نتائج استخراج الحمض النووي الريبي مع الحبي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Mesodissection هو الاسلوب الذي يمكن تطبيقه على استخراج الحمض النووي الريبي من الشرائح الآفة المرضية الناجمة عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض. بل هو ضرورة أن المستخدم يقيس الصورة ومحاذاة الصورة بشكل صحيح. لتحقيق ذلك، يجب معايرة الصك التالية التوجيهات على برامج التصوير. عند تشريح، إذا الشريحة ومجال الاهتمام يجري تشريح لا محاذاة، يجب على المستخدم إعادة ضبط الصك. آخر خطوة حاسمة في عملية تشريح لتحميل طاحونة الشيء الاستهلاكية بطريقة بحيث يخلو من الفقاعات قبل تشريح (الخطوة 5.1). وقد وجد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب يكشف عن أنه لا توجد المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه التالية NIH الجوائز / subawards لدعم هذا البحث: R01HL106790، R01HL106790-S1، R01HL106786، R01AI089323، R21AI091457، R21RR026006، P20RR020159، C06RR017563، 8T32OD011124-08، وP51OD011104.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | أحجام أخرى متوفرة | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | كياجين | 28104 |
المراجع
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
الوسوم
