مقالة منهجية

العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

DOI:

10.3791/51694

⸱

سبتمبر 11, 2014

1Department of Pediatrics, Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد التقنيات الأساسية والتحسينات معالجة تجميد كسر العينات والمواد النانوية البيولوجية للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. هذا الأسلوب هو الأسلوب المفضل للكشف عن الملامح التركيبية والتخصصات الأغشية البيولوجية وللحصول على البيانات والأبعاد المكانية مستوى التركيبية في علوم المواد وتكنولوجيا النانو المنتجات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف تجميد كسر / تجميد عملية يتم بموجبها حفر العينات والبيولوجية عادة أو المواد متناهية الصغر في الطبيعة، والمجمدة، ومتشظية، وتكراره لتوليد الكربون / البلاتين "الزهر" يهدف للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. تخضع العينات معدلات تجميد ultrarapid، وغالبا في وجود وكلاء واق من البرد للحد من تكوين بلورات الجليد، مع انقسام لاحق من العينة في النيتروجين السائل تبريد تحت درجات حرارة عالية فراغ. يتم نسخ سطح بكسر الناتجة واستقرت عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين من زاوية أن يمنح السطح التفاصيل ثلاثي الأبعاد لالمدلى بها. وقد أثبتت هذه التقنية المنير خاصة للتحقيق في أغشية الخلايا وتخصصاتهم، وساهمت إلى حد كبير في فهم النموذج الخلوي للخلية وظيفة ذات الصلة. في هذا التقرير، إلا أننا مسح متطلبات الصك والبروتوكول الفني لأداءتجميد الكسر، والتسمية وخصائص الطائرات كسر المرتبطة بها، الاختلافات على الإجراء التقليدي، ومعايير لتفسير الصور للتجمد الكسر. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لتحقيق التركيبية في العديد من مجالات بيولوجيا الخلية ويبشر بالخير باعتبارها تقنية التصوير الناشئة عن الجزيئي، وتكنولوجيا النانو، ودراسات علوم المواد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقديم مفهوم والتطبيق العملي لمعالجة تجميد كسر العينات البيولوجية بواسطة Steere 1 قبل أكثر من نصف قرن. جهاز أوائل خصصت المكونات المتباينة إلى مكتفية ذاتيا وحدة العمل 1. تم تعديل الجهاز الأصلي وصقلها في الأدوات المتاحة تجاريا من أجل استيعاب الحاجة الماسة للتلاعب عن بعد، وصيانة فراغ عالية، وتبخر الكربون والمعادن لإنتاج نسخة طبق الأصل مناسبة للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (الشكل 1 والشكل 2).

يتكون الصك النموذجي لفراغ الغرفة عالية مع جدول العينة وجود الذراع مشراح ريغولابلي الانتاجية النيتروجين السائل (الشكل 1). يضم غرفة أيضا على مسدسين الإلكترون، واحدة لتحقيق الاستقرار تبخر الكربون المتمركزة على 90º زاوية لمرحلة عينة والآخر لالبلاتين عيوالأسطوانات / الكربون التظليل في زاوية قابلة للتعديل، وعادة 15º - 45º (الشكل 2). يتم تطبيق السلطة الى وحدة لتشغيل مضخة فراغ والألواح الإلكترونية ينظم تعديل درجة الحرارة والإلكترون السيطرة على السلاح.

تصور أصلا كوسيلة لتحقيق تحسين التصوير من الفيروسات وتجميد كسر اكتسبت المزيد من الشعبية كأسلوب لفحص وتحليل أغشية الخلايا وتخصصاتهم 2، 3. في الواقع، كان هذا الإجراء جزءا لا يتجزأ من توضيح العلاقات هيكل / وظيفة في الخلايا والأنسجة والعديد من هذه الدراسات الوقوف صفا ومساهمات الكلاسيكية إلى الخلية والبيولوجيا الجزيئية 4-9. كان الهدف الرئيسي والأساس المنطقي لتطوير تقنية تجميد كسر للحد من التحف ملاحظتها في الإلكترون المجهري المستمدة من قرار التثبيت الكيميائية والمعالجة التقليدية المستخدمة في المجهر الإلكتروني البيولوجي. هنا الهدف هو الحد الكيميائيةتثبيت وتجميد العينة مع سرعة كافية وغالبا في وجود cryoprotectant من أجل الحد من تكوين بلورات الجليد والتحف تجميد الأخرى. وفي الآونة الأخيرة، وقد وجدت هذه التقنية تجدد الاهتمام من علماء البيولوجيا الجزيئية والمحققين علوم المواد للفحص الجسيمات النانوية والمواد النانوية.

تجميد كسر وتجميد حفر الصور تظهر طابع ثلاثي الأبعاد، وأحيانا مخطئون لالميكروسكوب الإلكتروني الماسح. ومع ذلك، يتم فحص الاستعدادات للتجمد الكسر بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ ومساهمة رئيسية لدراسات مورفولوجية عالية الدقة هو تمثيلها فريد من عناصر هيكل / وظيفة أغشية الخلايا. يبدأ التجهيز تجميد كسر من خلال تجميد الخلايا والأنسجة مع سرعة كافية للحد من بلورة الجليد و / أو مع استخدام وكلاء cryoprotectant مثل الجلسرين. ثم يتم كسر العينات تحت فراغ ومندوبيتم إنشاء LICA عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين على سطح كسر. يتم هضم العينة الأصلية من النسخ المتماثلة التي يتم استردادها على معيار EM العينة الشبكة. سوء تفسير آخر شائع من الصور للتجمد الكسر هي أنها توضح سطوح الخلايا. لكن المنطلق الأساسي لتجميد كسر هو أن يتم تقسيم الأغشية البيولوجية من خلال طبقة ثنائية الدهون من خلال عملية كسر (الشكل 3). هذه العملية في الأغشية البيولوجية غلة جهان كسر، واحد الذي يكشف عن تنظيم نصف الغشاء الملاصق للالسيتوبلازم، وPF وجه، واحد الذي يكشف عن نصف النشرة ثنائي الجزيء من الغشاء الذي هو المتاخمة للخارج الخلية الوسط، وEF وجه. لا تمثل سطوح الخلايا الحقيقية في الصور تجميد كسر ولكن تظهر فقط عند استخدام الخطوة اللاحقة أضاف تجميد الحفر باتباع الإجراء الكسر. من أجل حفر العينات بشكل فعال بكسر سابقا للكشف عن سطح التفصيللتر، يجب أن يتم تجميد العينات بمعدل سريع وبدون unetchablecryoprotectant. ويتم إنجاز الحفر من المياه من سطح العينة بكسر كشف الميزات الأساسية عن طريق وضع ذراع مشراح التبريد خلال المرحلة عينة خلق فرق درجة الحرارة بين مرحلة عقد العينة والتبريد الذراع مشراح الذي يسبب الماء لسامية من على سطح الأرض. عندما يتم تصعيد المياه من سطح العينة بكسر خلال المناورة-الحفر تجميد، ثم قد كشفت جوانب الأسطح الفعلية الخلية المصفوفة خارج الخلية، والهياكل هيكل الخلية، والتجمعات الجزيئية في ارتفاع القرار. وبالتالي تجميد كسر وتجميد حفر ليست حيث تبادل بل تعكس عملية تدريجية وهذه الأخيرة التي قد لا يكون ضروريا أو مرغوبا فيه تبعا لاحتياجات الدراسة معينة.

بعد تجميد كسر / حفر إجراءات تجميد، تتعرض السطوح المتصدعة إلى evapora موجهةTIVE المعاطف من الكربون والبلاتين من أجل تقديم الدعم والتصوير النقيض من النسخة المتماثلة. قد يكون البلاتين / الكربون أحادي الاتجاه أو التبخر التصوير الدوارة ويتم إنجاز إما المقاومة أو البنادق الإلكترون. التظليل أحادي الاتجاه من زاوية معروفة، وعادة 30º - 45º، مفيد في أداء العمليات الحسابية المورفولوجية معينة. العينات التي تعرضوا إلى أعماق الحفر وعادة ما تكون دوارة مظلل ويتم عكس الصور الناتجة من هذه العينات فوتوغرافيا للتقييم.

التاريخية فضلا عن الهدف الحالي للتجميد كسر / تجميد حفر تقنية هو الحد التثبيت الكيميائية ومعالجة العينات القطع الأثرية التي ترتبط مع المزيد من إجراءات انتقال المجهر الإلكتروني التقليدية. ومع ذلك، توفر هذه التقنية ميزة جوهرية في قدرته على إضفاء التفاصيل ثلاثي الأبعاد، وبالتالي تسهيل الحصول على البيانات المظهرية في البيولوجي، وعلم المواد، ونالعينات anotechnology. إجراءات تجميد كسر وتجميد حفر معقدة ومتعددة الأوجه، ويتم تخصيص بعض جوانب تطبيقها. يقدم هذا العرض وجهة نظر الدراسة من السمات الرئيسية لعملية ويشار القارئ لبروتوكولات شاملة نشرت 10 و 11 من أجل معالجة التفاصيل وتخصيص عملية لتلبية احتياجات بحثية محددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد العينات البيولوجية لتجميد كسر / تجميد حفر

  1. استخدام صياغة تثبيتي EM التقليدية مثل غلوتارالدهيد 2٪ + 2٪ امتصاص العرق في 0.1 م العازلة الفوسفات لمدة 1 ساعة. لإجراء التثبيت الأولي من الأنسجة البيولوجية. ملاحظة: في حين أنه قد يكون من المرغوب فيه تجميد بعض أنواع العينات دون تثبيت مسبق، والدم المنقولة الاحتياطات العالمية الممرض ولاية تثبيت المناسبة حيث تتكون العينة من الأنسجة البشرية.
  2. بعد التثبيت الأولي، وشطف العينة في نفس عازلة تستكمل مع 0.2 M السكروز مدة لا تزيد عن 1 ساعة.
  3. نقل العينة إلى حل cryoprotectant تتكون من الجلسرين 25٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات مدة لا تزيد عن 1 ساعة.

2. تجميد وتخزين العينات قبل تجميد كسر

  1. اختر الذهب أو النحاس عينة بذرة من حجم وشكل العينة المناسب ليتم معالجتها (الشكل 4 ).
  2. باستخدام ملقط الصف غرامة و / أو قياس موقف إبر حقنة صغيرة شظايا صغيرة من العينة على رأس كعب عينة المعدن.
    1. خفض محتوى السائل من العينة إلى زجة، الغراء قليلا مثل الاتساق عن طريق رسم خارج السائل من حافة كعب مع ورق الترشيح.
    2. النسخ المتماثلة واحدة، استخدام إبر صغيرة مقياس حقنة لخلق كومة من الأنسجة على كعب. النسخ المتماثلة مزدوجة، عكس كعب آخر وضعه بالضبط على كعب ووضعه برفق على سطح العينة خلق شطيرة (الشكل 5A). لا تضغط على عينة من بذرة من بين اثنين.
  3. ملء سفينتين ديوار معزولة مع النيتروجين السائل. ملاحظة: السفينة الأولى يستوعب وظيفة المعدنية التي تحتوي على بئر صغير الذي يستخدم لتسييل كمية صغيرة من غاز البروبان من اسطوانة المتاحة تجاريا (الشكل 5B). السفينة الثانية هي التخزين المقسمة / عقد سفينة للجيزةلاي الحفاظ على العينات المجمدة تحت النيتروجين السائل.
    1. باستخدام فوهة الاسطوانة وضعه في البئر البروبان، افتح صمام اسطوانة والسماح لتدفق الغاز في البئر السفينة الأولى حيث سيتم تسييل. ملاحظة: تحذير! البروبان متفجر، قد تسبب تجميد الإصابة على الاتصال، ويعتبر خانقة. استخدام البروبان فقط في غطاء الكيميائية المعتمدة لمثل هذا الاستخدام مع الحرص على تجنب مصادر الاشتعال غريبة، وذلك باستخدام الملابس الواقية ضد درجات الحرارة المنخفضة، والحفاظ على التهوية الكافية.
    2. في أسرع وقت ممكن، والتقاط عينة جبل بالملقط الصف غرامة ويغرق عليه في الغاز المسال في أول سفينة لعدة ثوان ثم نقل بسرعة الى السفينة عقد الثانية من النيتروجين السائل (الشكل 5B).
    3. مرة واحدة يتم تجميد العينات وتخزينها تحت النيتروجين السائل حتى جاهزة للنقل إلى محطة تجميد كسر. نقل بذرة إلى تخزين أكبر النيتروجين السائل الحاويات ديوار للتمديدينبغي أن تؤخذ تخزين إذا رغبت، ولكن الحرص على عدم السماح للبذرة لذوبان الجليد.

3. عملية لتجميد كسر صك وتجهيز العينات

  1. تحميل العينات على حامل نحاس والى غرفة
    1. تحميل بذرة عينة الذهب في كتيب من نوع نسخة مزدوج حامل عينة أو المشبك الجهاز تحت النيتروجين السائل والحفاظ هناك حتى على استعداد لوضع في غرفة العينة (الشكل 6).
    2. عندما حقق فراغ الغرفة عالية (حوالي 2 × 10 -6 م بار) وتم تبريد المرحلة إلى درجة حرارة النيتروجين السائل، وإيقاف المضخة، وتنفيس الغرفة، ووضع عينة بذرة شنت على الطاولة عينة في أسرع وقت ممكن .
    3. بدوره على مضخة، إعادة فراغ عالية، واستخدام مرحلة ودرجة الحرارة ذراع التحكم الإلكترونية لضبط درجة الحرارة جدول العينة إلى -100 درجة مئوية والنيتروجين السائل مباشرة إلى الذراع مشراح وBRIنانوغرام إلى درجة حرارة النيتروجين السائل.
  2. عملية كسر
    1. على تحقيق فراغ عالية، ودرجة حرارة -100 درجة مئوية مرحلة والذراع مشراح في درجة حرارة النيتروجين السائل، وفتح عن بعد مزدوج حامل عينة طبق الأصل مما كسر العينات على يتصاعد العينة (تجميد fracture_movie1.mov).
    2. في حالة العينات المعدة للالحفر كسر التالية، استخدم شفرة حلاقة الاحتفاظ بها في المشبك على الذراع مشراح أن يحلق (أي كسر) سطح العينات بدلا من خطوة 3.2.1 (تجميد-etch_movie2.mov).
    3. إذا كانت خطوة الحفر تجميد المضافة هي التي يتعين القيام بها، ضع الذراع مشراح تبريد فوق السطوح كسر واحد لعدة دقائق. ملاحظة: هذه المناورة سامية (أي حفر) الماء من سطح كسر. تأثير هذه المناورة هو الكشف عن خلية الأسطح الحقيقية، المصفوفة خارج الخلية، و / أو التجمعات الجزيئية من التسامي من المياه، بالإضافة إلى FRActure يواجه تمر عبر طبقة ثنائية المادة الدهنية من الأغشية.
  3. التظليل المعدنية والدعم نسخة التبخر باستخدام البنادق الإلكترون
    1. تفعيل البلاتين / الإلكترون الكربون أو بندقية المقاومة والسماح لها تتبخر طبقة رقيقة (حوالي 2 نانومتر) من البلاتين / الكربون على سطح كسر من زاوية من 30º - 45º. وهذا يتطلب عادة حوالي 15-20 ثانية.
    2. تفعيل الإلكترون الكربون أو بندقية المقاومة كما في الخطوة 3.3.1 وتتبخر طبقة رقيقة من الكربون على سطح عينة من كسر مباشرة (90º) النفقات العامة لتقديم الدعم إلى النسخة المتماثلة. وهذا يتطلب عادة حوالي 15-20 ثانية.
  4. استرجاع النسخ المتماثلة
    1. عند الانتهاء من التظليل التكرار والاستقرار الكربون، إيقاف مضخة فراغ، وتنفيس الغرفة، وإزالة عينة من جبل الصك.
    2. باستخدام زوج من ملقط الصف غرامة إزالة كل كعب عينة الذهب من ضعفكتيب متماثلة / المشبك والسماح لذوبان الجليد لعدة ثوان قبل خفض بلطف كعب على سطح الماء في لوحة البقعة (الشكل 7). ملاحظة: النسخة المتماثلة الكربون / البلاتين تحتوي على مواد العينة ملتصقة سوف تطفو على سطح الماء.
    3. مناورة النسخ المتماثلة باستخدام سلك حلقة غرامة أو التقليدية النحاس الإلكترون شبكة المجهر عقدت بواسطة ملقط الصف غرامة ونقل إلى مكان آخر لوحة تحتوي على 5٪ ثاني كرومات الصوديوم في حامض الكبريتيك 50٪ للواحد إلى عدة ساعات. ملاحظة: هذا الحمام يساعد على هضم المواد البيولوجية الفعلية عينة من النسخة المتماثلة. يمكن استبدال قوة الكامل التبييض المنزلية لثاني كرومات / محلول حمض الكبريتيك.
    4. عند اكتمال عملية الهضم، ونقل النسخة المتماثلة مرة أخرى إلى سطح المياه النظيفة واسترداد على معيار النحاس الإلكترون المجهري الشبكة. (ملاحظة: النسخ قد تفتيت إلى قطع صغيرة أثناء عملية الهضم ولكنها قد تحتوي حتى النسخ المتماثلة صغيرة جدا معلومات جوهرية ويجب أن تكون RETRieved وفحصها.) مخزن نسخة تدعم شبكات في صناديق الشبكة المتاحة تجاريا حيث ستبقى مستقرة لسنوات مع معالجة طيف.

4. التركيبية فحص تجميد كسر / النسخ حفر

  1. مشاهدة النسخ المتماثلة في المجهر الإلكتروني النافذ في لتسريع الجهد عادة 50-80 كيلو فولت.
  2. تسجيل الصور ذات الصلة على الفيلم TEM القياسية أو مع كاميرا رقمية عالية الدقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فرضية رئيسيا من تجميد كسر صورة التفسير هو أن الطائرات كسر تمر عبر طبقة ثنائية المادة الدهنية من الأغشية منح جهان الكسر الذي دعا اليه الاتفاقية وجه PF (البلازما كسر وجه) وEF-الوجه (خارج الخلية كسر وجه) (الشكل 3). وPF وجه هو النصف من الغشاء الدهني طبقة ثنائية المتاخمة للسيتوبلازم الخلية وEF-الوجه النصف من الغشاء الدهني طبقة ثنائية المتاخمة للبيئة خارج الخلية. تقنية تجميد كسر مفيدة بشكل خاص للتحقيق في بنية الغشاء وجهين وعادة ما تكون مختلفة بشكل متميز مع PF-جوه يجري م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات التالية مقدمته والتوافر التجاري، تجميد كسر / واستخدمت على نطاق واسع لحفر إجراءات التحقيق في هيكل غشاء البيولوجي. في الواقع، لقد تم الحصول على أفضل وجهات النظر من بعض التخصصات الهيكلية للأغشية في الاستعدادات تجميد كسر / حفر. وساهمت هذه الدراسات ليس فقط لفهم التنظيم الهيكلي من الأغشية ولكن أيضا قدمت نظرة ثاقبة كيف ترتبط البنية والوظيفة.

ظهور روتيني المجهر الإلكتروني البيولوجي الناجمة عن إدراك أن العلاجات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف ليس لديه ما يفصح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العرض التقديمي من خلال جائزة المبتكر السريري ل JLC من معهد البحوث الطبية للمضيفات ومن قبل وكالة حماية البيئة الأمريكية. على الرغم من أن البحث الموصوف في هذه المقالة قد تم تمويله كليا أو جزئيا من قبل وكالة حماية البيئة الأمريكية من خلال اتفاقية تعاونية CR83346301 مع مركز الطب البيئي والربو وبيولوجيا الرئة في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ، إلا أنه لم يخضع لمراجعة الأقران والسياسة المطلوبة من الوكالة ، وبالتالي لا يعكس بالضرورة آراء الوكالة ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي. لا يشكل ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية تأييدا أو توصية بالاستخدام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Balzers مصنع التجميد والكسر / التجميدBalzersBAF400T
المخازن المؤقتة القياسيةمختلف الموردين
مثبتات الألدهيدالقياسية موردين
مختلفين ثنائي كرومات الصوديومموردين مختلفين
حامض الكبريتيكموردين
مختلفين الإمدادات التي يمكن التخلص منها من أجل تبخر البلاتين / الكربونTechnotrade International
النيتروجين السائلالموردين
البروبانمختلف الموردين
الإمدادات التي يمكن التخلص منها للفحص المجهري الإلكترونيعلوم المجهر
نقل المجهرCarl Zeiss Inc.
المختلفينالإلكتروني الإلكتروني

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
  2. Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
  3. Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
  4. Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
  5. Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
  6. Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
  7. Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
  8. Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
  9. Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
  10. Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
  11. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
  12. Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
  13. Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
  14. Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
  15. Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
  16. Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
  17. Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
  18. Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
  19. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
  20. Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
  21. Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
  22. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  23. Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
  24. Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
  25. Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
  26. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
  27. Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
  28. Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
  29. Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
  30. Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
  31. Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
  32. Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
  33. Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة