مقالة منهجية

التعبير عن المؤتلف سلولاز Cel5A من الترايكوديرما reesei في نباتات التبغ

DOI:

10.3791/51711

⸱

يونيو 13, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واستخدمت نباتات التبغ لإنتاج سلولاز الفطرية، TrCel5A، عبر نظام التعبير عابر. ويمكن رصد التعبير باستخدام انصهار بروتين الفلورسنت، واتسم نشاط البروتين التعبير آخر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانزيمات المهينة السليلوز، السليلوزات، هي أهداف كل من البحث والمصالح الصناعية. كثرة هذه الإنزيمات في إلى ثقافة الصعب الكائنات الحية، مثل الفطريات بناء خيوط والبكتيريا اللاهوائية، وقد سارعت استخدام التكنولوجيات المؤتلف في هذا المجال. طرق التعبير النباتية هي نظام مرغوب فيه لإنتاج على نطاق واسع من الإنزيمات وغيرها من البروتينات مفيدة صناعيا. هنا، وأظهرت وسائل للتعبير عابر لendoglucanase الفطرية، الترايكوديرما reesei Cel5A، في نيكوتيانا تبغ. ويرد ناجحة التعبير البروتين، ومراقبتها من قبل مضان باستخدام انصهار بروتين mCherry انزيم. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام مجموعة من الاختبارات الأساسية لدراسة نشاط T. أعرب عابر reesei Cel5A، بما في ذلك SDS-PAGE، النشاف الغربية، zymography، فضلا عن مضان والركيزة المقايسات تدهور قائم على الأصباغ. النظام المذكور هنا يمكن أن تستخدم لإنتاج الخلية النشطةulase في فترة زمنية قصيرة، وذلك لتقييم إمكانية زيادة الإنتاج في النباتات من خلال نظم التعبير التأسيسية أو محرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تصور تدهور الكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية وتحولها إلى وقود سائل كوسيلة للحد من الاعتماد على الوقود الأحفوري. واحد عقبة كبيرة في إنشاء نظم معالجة الكتلة الحيوية غير مجدية اقتصاديا في تدهور الأنزيمية من السليلوز وهيميسيلولوز 1. تظهر أنظمة التعبير النبات إمكانات كبيرة لإنتاج الإنزيمات على نطاق صناعي. يتم تأسيس نظم الزراعية للنباتات الحصاد واقتصاديا في حجم بالفعل، كما كانت منذ آلاف السنين. إنتاج السليلوزات في النباتات غير المرغوب فيه بسبب عوامل مثل سهولة حلمهة ذاتية 2، وإمكانية تعظيم الاستفادة من انخفاض مستويات إنزيم عن طريق زيادة هضم جدران الخلايا النباتية 1. أخيرا، مصنع أنظمة تسمح استهداف البروتينات المؤتلف لمجالات محددة من الخلايا النباتية وقادرون على تعديل posttranslationally الانزيمات حيث المطلوبة 3.

ve_content ">

يستخدم تبغ النيكوتين (التبغ) الشائع جدا باعتباره النموذج الحي للدراسات بروتين تعبير مغاير في النباتات، ويرجع ذلك إلى النمو والكتلة الحيوية معالمه السريع تراكم 4. التعبير عابرة من البروتينات المؤتلف هو الأسلوب الذي يتيح إنتاج البروتين في فترات زمنية قصيرة 5، مع الحفاظ على المرونة لتوطين وبالتالي تعديلات ما بعد النقل من البروتينات المحددة، أي السليلوزات. وهذا يتيح إنتاج سلولاز (ق) للتحليل الأساسي، في حين وضع أيضا الأساس لمزيد من استراتيجيات التعبير في النباتات. باستخدام هذه الاستراتيجية التعبير عابرة، يتم إنتاج endoglucanase من غليكوزيل هيدرولاز العائلة 5، Cel5A، والمستمدة من المضيف الفطرية الترايكوديرما reesei (Hypocrea jecorina) 6 (المشار إليها فيما يلي باسم TrCel5A). TrCel5A هو 42 كيلو دالتون البروتين الذي الغليكوزيلاتي أصلا وغير نشطة للغاية في HYDroylzing سلاسل السليلوز 7.

ويستند أسلوب التعبير عابرة الموصوفة هنا على نظام نسبيا استخداما، التسلل يترك المصنع مع Agrobacteria تحمل الجينات في المصالح في ناقلات التعبير المناسب. للسماح للتحليل السريع للنجاح في بلانتا التعبير، TrCel5A يمكن أيضا التعبير عن بروتين الانصهار مع mCherry، وهو بروتين فلوري أحادى المستمدة أصلا من Discosoma س. بروتين DsRed 8، إضافة إلى ستة بقايا الحامض الأميني (صاحب العلامة) لتنصهر وC-محطة (TrCel5A-mCherry). وهكذا يمكن رصد تعبير عن انصهار بروتين مغاير، TrCel5A-mCherry، في النباتات التي تنمو باستخدام الضوء الأخضر لدراسة mCherry تشتت. إذا رغبت في ذلك، أقسام رقيقة من المواد النباتية يمكن فحصها تحت المجهر الضوء الأخضر لإقامة توطين محددة من البروتين. لهذا العمل، وإشارة وترانوأدرجت الجلوس الببتيدات في بناء، في توطين تصدير البروتين مغاير للشبكية هيولي باطني 9.

لتحليل نشاط السليلوزات أعرب النباتية، بما في ذلك TrCel5A، يمكن تشغيل عدد من الاختبارات النشاط سلولاز. بعد استخراج من مجموع البروتينات النباتية القابلة للذوبان، TrCel5A يمكن تنقيته جزئيا باستخدام تقنية الحضانة الحرارية. تم تأسيس حجم البروتين باستخدام SDS-PAGE تليها النشاف الغربية. Zymography يمكن استخدامها لتحليل نشاط ضد ركائز، مثل السليلوز الذي كان كربوكسي ميثليته (صنع السليلوز carboxymethyl: CMC) للالذوبان 10. سلولاز وجلوكوزيد النشاط يمكن رصدها باستخدام fluorophore 4-ميثيل مبيليفيريل (4-MU) المرتبطة β-D-cellobioside (مجتمعة: 4-MUC). طريقة أخرى لتقييم النشاط endoglucanase ينطوي على التحليل الطيفي للCMC الذي ارتبط مع الآزو دانتم (Remazolbrilliant الأزرق R) 11. بالإضافة إلى ذلك، كل من نشاط البروتين endoglucanases ومجموعة من السليلوزات يمكن رصدها عن طريق استخدام اختبار تحليل السكر، مثل هيدرازيد ف هيدروكسي البنزويك حمض (PAHBAH) مقايسة 12. هذه التقنيات يمكن استخدامها لتوضيح وتحديد نشاط سلولاز أعرب المصالح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. النمو البرية نوع N. تبغ النباتات

  1. أن ينمو N. تبغ L. السيرة الذاتية. النباتات بيتي هافانا SR1 على التربة ووضع البذور التبغ على الأواني المناسبة مليئة تربة طبيعية للإنبات. 2 بعد أسابيع، ونقل الشتلات إلى الأواني الفردية. احتضان النباتات في الدفيئة مع ثابتة 22 درجة مئوية (الفترة المظلمة) أو 25 درجة مئوية (الفترة ضوء) و 70٪ رطوبة الهواء النسبية. توفير الإضاءة في 16/8 ساعة ضوء / دورة الظلام (مثل فيليبس مصابيح IP65 400 واط؛ 180 ميكرومول · · م -1 ثانية -2؛ λ = 400-700 نانومتر) والماء يوميا.

2. التعبير عابر من TrCel5A وTrCel5A-mCherry البروتينات

  1. تحت ظروف معقمة، واختيار واحدة من المستعمرات المورمة Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK تقرير الرصد العالمي، KMR، RifR) التي تحتوي إما pTRAkc-ER-TrCel5A أو pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry ونقل إلى دورق مخروطي يحتوي على 10 مل خلاصة الخميرةمرق (YEB، الذي أعد وفقا للمواصفات المصنعين) المتوسطة والكانامايسين (50 ملغ / مل)، ريفامبيسين (50 ملغ / مل)، وكربنيسيلين (100 ملغ / مل) للاختيار. احتضان لمدة 36-40 ساعة عند 26 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. ملاحظة: تصميم بنيات ملائمة للتعبير البروتين هو خارج نطاق هذه الورقة، ولكن للإرشاد، وأساليب ماكلين وآخرون 13 ومونرو وPellham 14 يمكن اتباعها لتصميم بناء.
  2. تأخذ 200 ميكرولتر من كل ثقافة لتطعيم 20 مل من YEB مع تركيزات المضادات الحيوية المذكورة أعلاه واحتضان تحت نفس الظروف كما كان من قبل.
  3. بعد 36-40 ساعة، preinduce الثقافات عن طريق إضافة 2 ميكرولتر acetosyringon (200 ميكرومتر تركيز النهائي)، و 100 ميكرولتر 40٪ (ث / ت) محلول الجلوكوز و 200 ميكرولتر من 1 M MES العازلة درجة الحموضة 5.6. احتضان بين عشية وضحاها.
  4. إعداد 100 مل من العازلة 2X تسلل (100 جرام / لتر سكروز، 3.6 جم / L الجلوكوز، 8.6 غرام / لتر Murashige وسكوغ أملاح القاعدية، وضبط درجة الحموضة إلى 5.6 باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم).
  5. قياس OD 600 من الثقافات مع التخفيفات 01:05 حتى يصل إلى OD 600 من 5-6. حساب حجم الثقافة اللازمة ل30 مل تسلل المتوسطة في OD 600. إضافة 15 مل من 2X العازلة تسلل، ثم إضافة H 2 O منزوع الأيونات لجعل عازلة تصل إلى 30 مل.
  6. تأخذ النباتات من الاحتباس الحراري واستخدام غيض ماصة إلى نيك الجانب مجافي المحور الثالث من 3 إلى 5 عشر ورقة من أعلى لتخفيف التسلل.
  7. استخدام غيض ماصة إلى نيك الجانب مجافي المحور من الأوراق لتخفيف التسلل.
  8. ملء المحاقن مع تسلل المتوسطة ووضعها (بدون إبرة) على واحدة من النكات التي سبق. دعم المحاقن مع الاصبع على الجانب متجه نحو المحور ورقة. اضغط المتوسطة بعناية في الأنسجة مناطق رقة في interveinal. ملاحظة: بعد تسلل، وزراعة النباتات في الدفيئة في ظل نفس الظروف كما هو موضح أعلاه. أيضا، الحفاظ على نسبة متساوية من untrعتيد، والنباتات غير عابرة التعبير (NTEPs) والضوابط، في ظل نفس الظروف والنباتات تسلل.

3. تقييم TrCel5A-mCherry التعبير في أوراق النبات

  1. بعد 4-6 أيام، واتخاذ النباتات تسللت مع أ. المورمة تحتوي على pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry من الاحتباس الحراري ووضعها في غرفة مظلمة لتحليل مضان.
  2. لتصور مضان في أقسام ورقة التعبير عن TrCel5A-mCherry والنباتات ضوء باستخدام مصدر ضوء المحمولة التي ينبعث منها ضوء أخضر في 515 نانومتر مع فلتر الحمراء (620-750 نانومتر). ملاحظة: في عمق يمكن أن يتحقق توصيف التعبير البروتين في أوراق النبات بواسطة إجازات باجتزاء رقيقة مع vibratome والفحص تحت ضوء ومضان المجهري. لهذا اتبع الخطوات التالية:
    1. قطع أجزاء صغيرة من حوالي 5 × 5 مم حجم من أوراق تسلل وتضمينها في 4٪ المنحل الاغاروز في 50 ملي العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 5.7).
    2. قطعقسم من 80-90 حجم ميكرون من أوراق جزءا لا يتجزأ باستخدام vibratome. وضعها على شريحة المجهر، وتغطي مع العازلة أو زلة الغطاء ودراستها باستخدام المجهر في التكبير 10X مع كاشف مضان، وذلك باستخدام نفس الطول الموجي وتصفية ذكر أعلاه.

4. TrCel5A استخراج من أوراق التبغ

  1. قطع قطعة من يترك التبغ إلى الوزن التقريبي من 1 غرام من النباتات المصابة مع أ. المورمة تحتوي على pTRAkc-ER-TrCel5A ومكان في بمدافع الهاون precooled مع النيتروجين السائل. إضافة كمية مناسبة من النيتروجين السائل للعينات. طحن يترك لمسحوق باستخدام مدقة precooled.
  2. إضافة 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد إلى هذه المسألة ورقة الأرض وتخلط حتى غالبية المسألة ورقة في التعليق. استخراج الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، واتخاذ طاف التي تحتوي على البروتين.
  3. CentriFUGE استخراج في 15،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، واتخاذ طاف التي تحتوي على البروتين والحرص على عدم تعطيل بيليه. تجاهل بيليه.
  4. تنقية جزئيا TrCel5A التي يحتضنها طاف التي تحتوي على البروتين عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. السماح للراحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة أخرى، ثم الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تكرار عملية تنقية جزئية لمحطات غير تسلل للحصول على عينات السيطرة. استخدام هذه العينات لجميع التجارب التالية. ملاحظة: يمكن تخزين حلول البروتين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع أو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  5. تكرار عملية تنقية جزئية لمحطات غير تسلل للحصول على عينات السيطرة. استخدام هذه العينات لجميع التجارب التالية. ملاحظة: يمكن تخزين حلول البروتين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع أو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

5. SDS-PAGE، الغربية التنشيف، ونيتروجينية-CMC Zymography من TrCel5A-mCherry

  1. شراء أو إعداد 12٪ (ث / ت) المواد الهلامية SDS-PAGE وفقا لأساليب تأسيس 15.
  2. تذوب في الماء CMC للحصول على 1.5٪ (ث / ت) الحل. لجعل المواد الهلامية CMC-SDS-PAGE، بديلا 1 مل من 1.5٪ CMC ل1 مل من الماء في محلول 10 مل SDS-PAGE مزيج هلام، مما أدى إلى 0.1٪ (ث / ت) CMC + 12٪ (ث / ت ) SDS-PAGE مزيج هلام. صب جل طبيعي. ملاحظة: تأكد أن CMC في الحل الأصلي يذوب تماما من قبل مجموعة من التحريك والتسخين إلى 40 ° C (اكرر مباشرة قبل إعداد الحل هلام).
  3. تفسد عينات من الغليان في وجود SDS، وفقا لطرق أنشئت 12. كعنصر تحكم إيجابية، واستخدام 1:500 التخفيف من خليط سلولاز المتاحة تجاريا من T. reesei، مثل T. reesei آي تي سي سي 26921. كعنصر تحكم السلبية استخدام حل البروتين أعدت بالمثل من الأوراق غير اخترقتها (NTEPs).
  4. تنفيذ الكهربائي وفقا لبروتوكولات العادية 15،على سبيل المثال استخدام 200 V ل~ 50 دقيقة مع توقف الكهربائي مرة واحدة وصلت الجبهة صبغ الجزء السفلي من هلام.
  5. وصمة عار واحد هلام SDS-PAGE باستخدام 0.1٪ (ث / ت) Coomassie الأزرق اللامع ويزيل اللون باستخدام الميثانول / حامض الخليك الجليدية الخليط. ملاحظة: تلطيخ السريع وdestaining يمكن القيام بها عن طريق تسخين بلطف وتلطيخ destaining الحلول، أي باستخدام الميكروويف لمدة 15 ثانية ~ لتسخين (ولكن لا تغلي) أولا ثم تلطيخ الحلول destaining، وتغيير الحل destaining بعد 10 دقيقة ، أو عندما تبرد، وكرر مع حل destaining جديدة.
  6. أداء النشاف الغربية واحد هلام SDS-PAGE باستخدام بروتوكولات تأسيس 16،17. استخدام الأجسام المضادة التالية: أ الضد الأرنب بولكلونل ضد صاحب العلامة (الابتدائي) والماعز المضادة للأرنب بولكلونل الأجسام المضادة المنطقة التيسير التي تم مترافق إلى الفوسفاتيز القلوية (الثانوي). ملاحظة: يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة الثانوية لتمكين التصور باستخدام تترازوليوم tetrazolالبوتاسيوم chloride/5-bromo-4-chloro-3 'indolyphosphate ف طولويدين الملح (NBT / BCIP)، كما هو موضح 18.
  7. أداء البروتين في جل طوي ثانية على 0.15٪ (ث / ت) هلام CMC SDS-PAGE التي يحتضنها الجل في 1.5٪ (ث / ت) β-cyclodextrin، 20 ملي فوسفات سترات العازلة، ودرجة الحموضة 6.5، في درجة حرارة الغرفة مع لطيف تهتز لمدة 15 دقيقة 19.
  8. تجاهل حل β cyclodextrin وتغسل لفترة وجيزة الجل مع H 2 O. احتضان عند RT في 50MM الصوديوم العازلة خلات (الرقم الهيدروجيني 4.8) لمدة 15 دقيقة أخرى. أداء CMC zymography باستخدام refolded 0.15٪ CMC SDS-PAGE هلام التي يحتضنها الجل في 30 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.8 لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
  9. أداء CMC zymography باستخدام refolded 0.15٪ (ث / ت) هلام CMC SDS-PAGE التي يحتضنها الجل في 30 ملي خلات الصوديوم العازلة (درجة الحموضة 4.8) لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
  10. وصمة عار الجل لمدة 10 دقيقة باستخدام 0.1٪ ث / ت الكونغو حل يزيل اللون الأحمر ولمدة 30 دقيقة أو حتى يتم احظت فرق واضح باستخدام 1 M ناالبنود. غسل هلام مع 0.3٪ (ت / ت) وحامض الخليك لتصوير أكثر وضوحا.

6. 4 MUC آخر الفحص من TrCel5A

  1. إعداد محلول المخزون من 10 ملي 4 MUC في 50٪ (ت / ت) والميثانول، وتخزينه في الظلام في RT
  2. مباشرة قبل الفحص، يعد الحل العمل 4-MUC 2X، ويتألف من 1 ملم 4-MUC و 60 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.8.
  3. تنفيذ هذا الاختبار على عينات تحتوي على 100 ​​ميكرولتر من البروتين ورقة (مع أو بدون TrCel5A أعرب inducibly)، و 100 ميكرولتر مزيج سلولاز المتاحة تجاريا من T. 1:1،000 reesei، وH 2 O نقية، على التوالي. تشغيل كل عينة في ثلاث نسخ.
  4. ماصة 100 ميكرولتر من الحل العمل 4-MUC في آبار منفصلة من لوحة 96 جيدا، ثم يضاف 100 ميكرولتر من كل عينة.
  5. تحديد 0 دقيقة timepoint من 4-MU مضان من خلال التحليل الطيفي الفلورسنت، وذلك باستخدام الطول الموجي الإثارة من 360 نانومتر والطول الموجي من 465 نانومتر الانبعاثات.
  6. احتضان لوحات لمدة 20دقيقة عند 50 درجة مئوية، مع تغطية الجفون لاصقة لمنع التبخر. وقف رد الفعل من خلال تجميد (أو عن طريق الجمع بين 100 ميكرولتر 0.15 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 10.0، و 100 ميكرولتر من العينة في لوحة منفصلة).
  7. تحديد نقطة النهاية من 4-MU مضان من خلال التحليل الطيفي الفلورسنت، وذلك باستخدام الطول الموجي الإثارة من 360 نانومتر والطول الموجي من 465 نانومتر الانبعاثات. طرح 0 دقيقة من نقطة النهاية (20 دقيقة) timepoint للحصول على تغيير في القيم مضان.

7. نيتروجينية-كاربوكسيميثيل السليلوز آخر الفحص من TrCel5A

  1. إعداد مخزون من 1.5٪ (ث / ت) نيتروجينية-CMC التي يتم تخزينها في RT، وهطول محلول يحتوي على 18 ملي خلات الزنك، 0.5 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5 و 80٪ من الإيثانول (ت / ت)، وتخزين في غرفة درجة الحرارة.
  2. مباشرة قبل الفحص، يعد الحل نيتروجينية-CMC 2X العمل، ويتألف من 1٪ (ث / ت) نيتروجينية-CMC (في H 2 O) و 60 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.8.
  3. الجمع بين 50 ميكرولتر من عينة و 50 ميكرولتر من العملالحل جي في 1.5 مل أنابيب.
  4. عينات الاختبار التي تحتوي على 50 ميكرولتر من البروتين ورقة (مع أو بدون TrCel5A أعرب عابر)؛ 100 ميكرولتر من خليط سلولاز المتاحة تجاريا من T. reesei المخفف 1:1،000؛ ونقية H 2 O. عينات والمعايير تعمل في ثلاث نسخ.
  5. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية. وقف رد الفعل من خلال إضافة 250 ميكرولتر من هطول الحل. دوامة كل عينة بقوة لمدة 10 ثانية لضمان الحلول مجتمعة تماما.
  6. احتضان العينات في RT لمدة 10 دقيقة ثم الدوامة مرة أخرى. عينات الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة 200 ميكرولتر من كل عينة طاف لوحة 96 جيدا، مع الحرص على عدم تعطيل بيليه.
  7. الفحص باستخدام التحليل الطيفي الامتصاصية في الطول الموجي من 590 نانومتر.

8. PAHBAH الفحص من TrCel5A

  1. استخدام حفرة لكمة لقطع دائرة (~ 5.5 مم) من ورق الترشيح. إضافة 100 ميكرولتر 60 ملي NAAC، ودرجة الحموضة 4.8، و 100 ميكرولتر من العينات، إما تحتوي على البروتين ورقة (مع أو بدون TrCel5A أعرب inducibly) أو T. التجارية reesei خليط سلولاز، المخفف 1:1،000، واحتضان مع مرشح الدوائر ورقة لمدة 20 ساعة عند 50 درجة مئوية مع 300 دورة في الدقيقة تهتز. لكل عينة حضنت مع ورق الترشيح، وأيضا احتضان حل مكررة دون ورق الترشيح كما فردية عينة الضوابط.
  2. إعداد 330 ملي ف هيدروكسي هيدرازيد حمض البنزويك (PAHBAH) حل A عن طريق إذابة PAHBAH في H 2 O مع إضافة 5 مل حمض الهيدروكلوريك تتركز لما مجموعه 100 مل الحل، وتخزينها في RT. ملاحظة: يتم تحقيق أفضل النتائج عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك إلى وحدة تخزين أصغر من PAHBAH الطين، أي 30 مل، والذي يحرك تحت درجة حرارة للمساعدة في حل قبل اتخاذ هذا الحجم إلى 100 ​​مل مع H 2 O.
  3. إعداد PAHBAH الحل B، تحتوي على سترات الصوديوم 50 ملي، وكلوريد الكالسيوم 10 ملم، و 500 ملم هيدروكسيد الصوديوم وتخزينها في RT.
  4. Immediately قبل الفحص، وإعداد حل العاملة 1.5X من 1 مل PAHBAH كاشف إلى 9 مل حل العازلة، متجر على الجليد حتى الاستخدام (لاستخدامها في غضون 4 ساعة).
  5. تحضير العينات في بالحرارة 0.2 أو 0.5 مل أنابيب. الجمع بين 5 ميكرولتر من كل حل المحتضنة مع ورق الترشيح (الخطوة 8.1) 45 ميكرولتر من H 2 O و 100 ميكرولتر من الحل PAHBAH العمل. يجب تشغيل الضوابط عينة (عينات المحتضنة دون ورق الترشيح) تحت نفس تركيزات (5 ميكرولتر عينة، 45 ميكرولتر H 2 O، والحل يعمل 100 ميكرولتر PAHBAH). أيضا اختبار المعايير 5 (5 ميكرولتر) تحتوي على ما بين 0 و 0.2 غرام / لتر من الجلوكوز، ونقية H 2 O. عينات والمعايير تعمل في ثلاث نسخ.
  6. احتضان العينات لمدة 10 دقيقة بالضبط عند 100 درجة مئوية، ثم تبرد في RT لمدة 10 دقيقة بالضبط. حلول ماصة في 96 لوحة جيدا والفحص الطيفي عند طول موجي 410 نانومتر من. طرح الفردية عينة التحكم (حضنت دون ورق الترشيح) من العينات للحصول على النهائيالقيم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعرب عن TrCel5A وTrCel5A-mCherry بنجاح في نباتات التبغ باستخدام نظام التعبير عابرة (أرقام 1A و 1B). النظر في نمط التعبير عن بروتين الانصهار TrCel5A-mCherry كشفت أوراق صحية (الشكل 1C)، والذي أظهر نطاق واسع تعبير البروتين تحت الضوء الأخضر (الشكل 1D).

تم إجراء استخراج مجموع البروتينات القابلة للذوبان في نباتات التبغ التي كانت الأوراق التي تحتوي على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير المؤتلف من السليلوزات هو مجال اهتمام كبير، ويرجع ذلك إلى الرغبة في نظم أكثر كفاءة إنتاج الوقود الحيوي 1. النباتات تقدم العديد من الإمكانيات لإنتاج سلولاز ناجحة، مع ميزات مثل تقنيات الحصاد الاقتصادي وأساليب حلمهة ذاتية كونها خصائص مرغوبة جدا لإنتاج الوقود الحيوي على نطاق واسع. أبعد من ذلك، استخدام تعريب مختلفة لإنتاج البروتينات تسمح، إذا لزم الأمر، والتعديلات ما بعد النقل 20. تغيير النباتات لتمكين التعبير التأسيسية للالسليلوزات، في حين تقدم فوائد واضحة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل BMBF Forschungsinitiative "BIOENERGIE 2021 - Forschung FÜR يموت Nutzung فون Biomasse" والكتلة التميز "الوقود مصممة خصيصا من الكتلة الحيوية"، الذي يتم تمويله من خلال مبادرة التميز من قبل الحكومات الاتحادية وحكومات الولايات الألمانية لتعزيز العلوم والبحث في الجامعات الألمانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-methylumbelliferyl & beta ؛ -D-cellobiosideSIGMA-ALDRICHM6018
حمض الخليكROTH3738
Acetosyringon (مركز) ROTH6003
مضاد حيوي - كاناميسينROTHT832
مضاد حيوي - ريفامبيسينROTH4163
مضاد حيوي - كاربينيسيلينروث6344
الجسم المضاد - الأرانب المضادة له(6) pAbROCKLAND600-401-382
الأجسام المضادة - الماعز المضادة للأرانب AP ، FC pAbDIANOVA111-055-008
Azo-carboxymethyl celluloseMEGAZYMES-ACMC
& beta - سيكلودكسترينSIGMA-ALDRICHC4805
ثنائي هيدراتكلوريد الكالسيومSIGMA-ALDRICHC5080
كربوكسي ميثيل السليلوزROTH3333.1
السليولاز من Trichoderma reesei< / em> ATCC 26921SIGMA-ALDRICHC2730
الكونغو الأحمرSIGMA-ALDRICH75768
Coomasie الأزرق اللامع G 250ROTH9598.2
D (+) -الجلوكوزROTH8337
الإيثانولROTHK928
- ورق نشاف RotilaboROTHCL67
NBT / BCIPSIGMA-ALDRICH72091
MES bufferROTH4256
MethanolROTH8388
سترات الصوديومROTH3580
دوديسيل كبريتات الصوديومSERVA20765
هيدروكسيد الصوديومROTH6771
التربة ، Einheitserde classic   ؛PATZER GMBH
- Infinite M200TECAN
SucroseSIGMA-ALDRICHS-5390
4-Hydroxy benzhydrazide SIGMA-ALDRICHH9882
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتROTH1058
مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية - BLAK RAYUVP
Vibratome - VT1000SLeica
ورق ترشيح مطياف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Agrobacterium SDS PAGE Zymography

مقالات ذات صلة