يعد زرع جلد الذيل نموذجا قويا لدراسة الرفض المعتمد على الخلايا التائية وتحريض التسامح أثناء الاستجابات المناعية الخيفية في الفئران. تتمثل مزايا هذا البروتوكول في الجراحة الغازية البسيطة ، وسهولة المراقبة دون الحاجة إلى التضحية بالفأر المتلقي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتطلب دراسة استجابات الخلايا التائية وعواقبها أثناء التعرف على المستضد الخيفي نموذجا يمكن المرء من التمييز بين الخلايا التائية المانحة والمضيفة ، ومراقبة الكسب غير المشروع بسهولة ، وتكييف النظام من أجل الإجابة على أسئلة مناعية مختلفة. أنشأ مدور وزملاؤه عملية زرع جلد الذيل الخيفي في الفئران في عام 1955. منذ ذلك الحين ، تم تعديل نموذج زراعة الجلد وتكييفه باستمرار للإجابة على أسئلة محددة. إن استخدام جلد الذيل يجعل من السهل تسجيل هذا النموذج لرفض الكسب غير المشروع ، ولا يتطلب تحضيرا مكثفا ولا تخديرا عميقا ، وهو قابل للتطبيق على من جميع الخلفيات الجينية ، ويثبط النخر الإقفاري ، ويسمح بالتدخل الكيميائي والبيولوجي.
بشكل عام ، تكون كل من الخلايا التائية الخيفية CD4 + و CD8 + مسؤولة عن رفض الطعوم الخيفية لأنها تتعرف على مستضدات التوافق النسيجي الرئيسية غير المتطابقة من سلالات الفئران المختلفة. تم وصف العديد من النماذج لتنشيط الخلايا التائية الخيفية في الفئران المزروعة بالجلد. كان تحديد جزيئات التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى والثانية في سلالات الفئران المختلفة بما في ذلك الفئران C57BL / 6 خطوة مهمة نحو فهم ودراسة الردود المنطقية بوساطة الخلايا التائية. في نموذج زرع جلد الذيل الموصوف هنا ، تكون الطفرة ثلاثية النقاط (I-Abm12) في الأخدود المقدم للمستضد لجزيء معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية (I-Ab) كافية للحث على تنشيط الخلايا التائية CD4 + الخيفي القوي في الفئران C57BL / 6. يتم رفض ترقيع الجلد من الفئران I-Abm12 على الفئران C57BL / 6 في غضون 12-15 يوما ، بينما يتم قبول الطعوم الزاوية لمدة تصل إلى 100 يوم. يسمح غياب الخلايا التائية (CD3 - / - و Rag2 - / - الفئران) بقبول ترقيع الجلد لمدة تصل إلى 100 يوم ، والتي يمكن التغلب عليها عن طريق نقل 2 × 104 خلايا تائية من النوع البري أو الخلايا التائية المعدلة وراثيا. تتكاثر الخلايا التائية المنقولة بالتبني وتنتج IFN-γ في فئران Rag2 المزروعة I-Abm12.
المقدمة
زرع الأعضاء الصلبة مثل الجلد والقلب والكلى هو الآن إجراء القياسية في الممارسة الطبية في جميع أنحاء العالم 1. يمكن رفض الأعضاء المزروعة بنجاح من قبل تفعيل نظام المناعة المتلقي، الذي يعترف مستضدات التوافق النسيجي الرئيسي من الجهة المانحة. مرضى زرع بالتالي تحتاج إلى علاج بالأدوية المثبطة للمناعة 2. تأسست خيفي زرع الجلد في الفئران عن طريق مدور وزملاؤه في عام 1955، وكان مفيدا لتحديد الجزيئات المستهدفة وصفها لاحقا معقدة التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) الصف الأول والثاني. منذ ذلك الحين، تم زرع الجلد نموذج تعديل بشكل مستمر وتكييفها لدراسة دور مجموعات فرعية الخلايا T وأهمية الكيميائية والبيولوجية التدخل في قمع رفض الكسب غير المشروع 2-4. الجلد من الأذن والجذع هي أكثر صعوبة لإعداد وهم اكثر عرضة لنقص الأكسجة ونخر الجلد من الذيل 5؛ ومع ذلك،الإجراء هو زرع مماثلة. بالإضافة رصد الذيل زرع الجلد من السهل نظرا لنسيج الشعر سمة من الجلد.
توفر هذه المقالة إجراء مفصلة لفئة MHC II عدم تطابق زرع الذيل الجلد الذي يسمح لدراسة جوانب مختلفة من CD4 + T الخلية بوساطة رفض طعم خيفي والتسامح في الفئران. الطفرة ثلاث نقاط الطبيعي في MHC الدرجة الثانية IA جزيء ب (وتسمى IA bm12) 6-9 يكفي للحث على رفض المغايرة الجلد في C57BL / 6 الفئران 8. جزيء bm12 IA ينشط خلايا CD4 + T مع مختلف αβ-T الخلايا مستقبلات (TCR) سلاسل من C57BL / 6 الفئران، التي تم تحديدها بين الخلايا T-Vα2Vβ8 TCR محددة من أجل توليد ماوس TCR-10 المعدلة وراثيا. وقد استخدم نقل بالتبني من الخلايا T-Vα2Vβ8 TCR محددة لوضع نموذج الرفض في C57B العوز المناعيL / 6 Rag2 - / - الفئران زرعها مع IA bm12 الجلد.
الاختلافات الجينية بين المتبرع والمتلقي تؤثر على نتائج القبول والرفض زرع. هناك أنواع مختلفة من عمليات زرع: زرع طعم ذاتي هي من الفرد المتلقي نفسه؛ syngrafts والمغايرة هي من زرع الأفراد متطابقة وراثيا وجينيا لا علاقة لها على التوالي. وقد ثبت قبول مختلفة خيفي زرع الأعضاء من خلال التدخل الكيميائية والبيولوجية في المرضى ونماذج الماوس 11،3،4. في النهج الأساسي، أظهرت مكافحة CD3 المعالجة الضد C57BL / 6 الفئران البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من IA bm12 الذيل الجلد (بيانات غير منشورة). أدى استنزاف CD4 + و CD8 + T الخلايا قبل زرع في الفئران المتلقية في قبول MHC من الدرجة الأولى والثانية ترقيع غير متطابقة (القس في 12). ومن المثير للاهتمام، ورفض ترقيع الجلد يعتمد على وجود CD4 + خلايا T (القس في 12). في هذا النموذج، تستهدف تفاعلات معينة بين الخلايا المناعية المختلفة من خلال منع الجزيئات costimulatory مع الأجسام المضادة أو قمع مع الخلايا التائية التنظيمية قد تحفز التسامح (بيانات غير منشورة). في الواقع، ومنع كل من CD40 CD28 وأدى إلى طويلة الأجل طعم خيفي الجلد التسامح 13،14.
زرع الذيل الجلد هو سهلة لتنفيذ وسهلة لرصد مقارنة زرع الأعضاء الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، زرع الذيل الجلد هي سهلة التحضير وأقل عرضة لنقص التروية من أنسجة الجلد الأخرى. وعلى النقيض من حقن التخدير، واستخدام الغاز مخدر (isofluorane) خلال زرع يقصر كل من الإجراء والانتعاش مرة المستفيدة. الشباك من زرع الذيل الجلد، والتي قد تؤدي إلى عدم اكتمال التئام الجروح ورفض الكسب غير المشروع، ومنعه من خلال تطبيق لاصق الأنسجة. علاوة على ذلك، IA bm12 الذيل الجلد نموذج زرع ينشط حصرا CD4 + الخلايا التائية في كل مناعيا والفئران العوز المناعي (من نفس الخلفية الوراثية) تسهيل تفسير النتائج.
يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر موثوق بها، واستنساخه رصدها بسهولة أن يسمح للتدخل الكيميائية والبيولوجية. ويهدف نموذج للتحقيق في الرفض والتسامح تحريض زرع الذيل الجلد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
في هذا المنشور الفيديو والبروتوكول، وأجريت كافة الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول الحيوانية التي وافقت عليها السلطة كانتون بازل شتات، سويسرا. تنفيذ كافة الإجراءات في ظروف معقمة حيثما كان ذلك ممكنا.
1. إعداد جراحة
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والشاش قبل الاستخدام.
- تسخين سادة دافئة وتنظيم الأدوات الجراحية على الطاولة (جدول المواد / طرق).
- فتح الضمادات الشريط الاصبع. تطبيق الفازلين على لوحة الجرح مع مسحة القطن (تأكد من تغطية الشاش تماما).
- وزن الفئران وإدارة تسكين البوبرينورفين 0.05 مغ / كغ من وزن الجسم. ملاحظة: هذا سيوفر تسكين مباشرة بعد الزرع.
2. إعداد الذيل الجلد لزرع
- الموت ببطء الفئران المانحة (على سبيل المثال، IA bm12) في CO 2 الخنق ودisinfect ذيول بمحلول تطهير قبل الختان.
- وضع الذيل مع شريط أسود أسفل على لوحة بلاستيكية نظيفة وقطع عليه طوليا في جميع أنحاء خط الوسط، مما يجعل شق سطحية تنطوي فقط على طبقة الجلد.
- سحب قبالة الجلد من الذيل باستخدام ملقط تجتاح.
- وضع الذيل الجلد في صحن 10 سم ثقافة الخلية مليئة 10 مل HBSS.
3. الإجراءات الجراحية
- تخدير الفئران المتلقي (على سبيل المثال، C57BL / 6) عن طريق استنشاق حل isofluorane 3٪ في صندوق الاستقراء شفافة. ملاحظة: يستغرق 3-5 دقيقة للفأر للوصول إلى الطائرة التخدير الجراحي. استخدام مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- وضع الماوس على لوحة دافئة وتطبيق 1.5٪ isofluorane عبر قناع الفم وتقويم كل العاكسة الحيوانية أخمص القدمين معسر.
- يحلق موقع الظهري من الفئران المتلقي (على سبيل المثال، C57BL / 6) وإزالة الشعر تلويث باستخدام الشاش جنوب غرب الجافةمن أساسها.
- تطهير حليق موقع الزرع مع الحل العقيم.
- قرصة الجلد بالملقط في موقع الوسط / اليمين للظهر واستخدام مقص منحني لجعل شق جولة من حوالي 1 × 0.6 سم.
- في حالة حدوث نزيف، ثم تنظيف الجرح مع مسحة القطن المعقم.
- تقييم حجم شق وقطع الزرع من الحجم المقدر من الذيل الجلد باستخدام المشرط.
- تقليم زوايا لتقريب عملية الزرع.
- تحميل زرع على مشرط، الزائدة الجافة من HBSS على مسحة القطن المعقم ووضعه في السرير الكسب غير المشروع من الماوس المتلقي.
- تجنب تداخل المانحة والمضيفة الجلد والأنسجة وتطبيق لاصق على منطقة الاتصال حصرا.
- تطبيق الجص دون الطويات حول الخصر الماوس.
- تطبيق لاصقة ضمادة غير مرنة لإصلاح الجص إلى الماوس (3 ملم تحول).
- شق مع مقص حوالي 3 ملم في الموقع بطني العليا للضمادة. ملاحظة: هذا هو لتجنب آرapping الأسنان الماوس، أثناء مرحلة الانتعاش.
- إزالة مخدر الفم قناع والحفاظ على الفئران المزروع على لوحة التسخين حتى مستيقظا.
- العودة الفئران المزروعة إلى أقفاصها فقط عندما تعافى تماما وتقييم قدرتهم على التنقل لضمان أن ضمادة ليست ضيقة جدا.
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الايثانول 70٪ قبل الشروع في عملية جراحية المقبل.
4. رعاية ما بعد الجراحة
- إضافة شراب المحتوية على الباراسيتامول لمياه الشرب (4 ملغ / مل) وادارته لمدة 7 أيام.
- العودة إلى غرفة الماوس الحيوان بمجرد استعادتها.
- عن كثب مراقبة الفئران لعلامات سريرية بما في ذلك الاكتئاب أو التغيرات السلوكية الأخرى (الأكل أو الجمود)، ومظهر غير طبيعي (عدم وجود الاستمالة) أو الموقف (بيلو-الانتصاب أو الموقف منحنية) للمرة الضمادة في مكانها (1 أسبوع).
5. إزالة ضمادة (6-7 أيام بعد الزرع)
- انيسthetize الفئران عن طريق استنشاق حل Isofluorane 3٪ في صندوق الاستقراء شفافة (انظر أعلاه).
- قطع ضمادة والجص مع مقص الشريان وبعناية إزالتها. ملاحظة: تجنب تمتد من موقع الزرع.
- مراقبة الفئران لزرع علامات سريرية (انظر 4.3) ويسجل لرفض ترقيع الجلد (الجدول 1). ملاحظة: نظام نقاط الكسب غير المشروع يستفيد من القوام الشعر المختلفة على الجلد الذيل مقارنة الظهرية الجلد. يصنف مظهر عملية الزرع، ورفضه في 3 درجات. وعادة ما يتم رفض الجلد خيفي (MHC II متطابقة، على سبيل المثال، IA bm12) الطعوم من C57BL / 6 الفئران مناعيا في غضون 12-15 يوما زرع آخر (البيانات الخاصة و 15-20).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في النهج الأول تم زرع C57BL / 6 الفئران مع IA المغايرة bm12 وIA ب syngrafts. بعد إزالة الضمادات، ترقيع واضح علامات التئام الجروح دون إغلاق منطقة الاتصال في C57BL / 6 الفئران (الشكل 1A). بعد إزالة الضمادات، أدى CD4 + T التهاب بوساطة الخلايا إلى ظهور مناطق نخرية (البقع الحمراء) ورفض IA المغايرة bm12 في C57BL / 6 الفئران ضمن 13 أيام بعد زرع (الشكل 1B-C، والرموز شغل)، في حين syngrafts تم السكوت لمدة تصل إلى ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
زرع الجلد هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة الرفض والتسامح تعتمد على خلايا تي. منذ تأسيس نموذج زرع الجلد، وطبقت العديد من التعديلات والتغييرات. في الإجراء وصفها، يتم تنفيذ IA bm12 زرع الذيل الجلد باستخدام الغاز مخدر (isofluorane). استخدام التخدير الغاز يقلل من وقت التنفيذ والانتعاش الفئران، ما يقلل من الضغط على الفئران المزروعة. يعمل الإجراء لاصقة لإصلاح الأنسجة الذيل الجلد، والتي تميل إلى حليقة أكثر من الأذن أو الأنسجة الظهرية الجلد. وعلاوة على ذلك فإنه من المهم لشد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح SNF PPOOA-_119204 و PPOOP3_144918 إلى S.W.R. نشكر E. Palmer و B.T.H. Hausmann على الفئران والخبرة الفنية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| البيتادين الحل القياسي | Mundipharma | ||
| مسحة قطن | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan ، UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast شرائط الأصابع | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| لاصق المناديل الورقية Histoacryl | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic ، 2 سم x 10 م | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 | شاش معقم 10010015 Invitrogen | GIBCO | |
| ، 5 × 5 سم ، 8 طبقات | MaiMed GmbH | 21010 | |
| ملقط نمط ضيق | FST | 11003-12 | |
| مقص قزحية ناعم منحني | FST | 14095-11 | |
| مقص قزحية ناعم | FST | 14094-11 | |
| مقص مايو | FST | 14010-15 | |
| طرف كرة مقص الشريان 11.5 سم | FST | 14080-11 | |
| ملقط الأنسجة | FST | 11021-14 | |
| الشفرة الجراحية رقم 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | |
| مقابض الشفرة الجراحية | الكربوني حقنة Swann-Morton LTD | ||
| ، 1 مل | ARTSANA | طعام | |
| Temgesic ، بوبرينورفين | ESSEX Chemie AG | 0.3 مجم / مل | |
| أطباق زراعة الأنسجة 10 سم ، 60.1 سم 2< / sup> | TPP | ||
| فازلين | Vifor SA | ||
| وسادة | دافئة من النوع Solis | Type 223 |
المراجع
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al. New perspectives of immunosuppression. Transplantation proceedings. 45 (3), 1224-1231 (2013).
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current protocols in immunology. , (2009).
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
