محلل خلية مقرها الممانعة الحقيقي في الوقت كأداة لتحديد المسارات الجزيئية تشارك في العصبية والحمايه العصبيه في خط الخلية العصبية

ملخص

< p class = 'jove_content'> من شأنه أن يساعد تحسين مقايسات السمية العصبية في المختبر في تحديد مركبات وقائية عصبية جديدة. يتم تقديم فائدة محلل الخلايا القائم على المعاوقة في الوقت الفعلي لتحديد السمية الخلوية والحماية الخلوية في خطوط الخلايا العصبية وتحديد مشاركة مسارات المراسلة الثانية ، وبالتالي اكتساب نظرة ثاقبة في آلية الحماية العصبية.

الملخص

العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ لديهم موت الخلايا العصبية المعنية في الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بهم. تحسن في نماذج المختبر لدراسة آثار اعصاب أو عصبية المخدرات ومسارات المصب المعنية من شأنه أن يساعد التبصر في الآليات الجزيئية من العصبية / السمية العصبية ويحتمل تسهيل تطوير الأدوية. ومع ذلك، العديد من المقايسات الموجودة في المختبر سمية لها القيود الرئيسية - الأكثر تقييم السمية العصبية والعصبية عند نقطة زمنية واحدة، وعدم السماح لمراقبة بالطبع الوقت وحركية التأثير. وعلاوة على ذلك، فإن الفرصة لجمع المعلومات عن مسارات الإشارات المشاركة في المصب العصبية في الوقت الحقيقي وتكون ذات أهمية كبيرة. في البروتوكول الحالي وصفنا استخدام الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل لتحديد آثار اعصاب السيروتونين 2A (5-HT _2A) منبهات مستقبلات في خط الخلية العصبية تحت خالية من التسمية والوقت الحقيقي كونديتالأيونات باستخدام قياسات مقاومة. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن على مثبطات مسارات الرسول الثانية يمكن أن تستخدم لتحديد جزيئات المصب المشاركة في تأثير اعصاب. وصفنا أيضا فائدة هذه التقنية لتحديد ما إذا كان لها تأثير على تكاثر الخلايا يساهم في التأثير الملحوظ اعصاب. النظام يستخدم لوحات الإلكترونيات الدقيقة الخاصة المشار إليها باسم E-التي تحتوي على لوحات بالتناوب صفائف مسرى مكروي الذهب على السطح السفلي من الآبار، بمثابة أجهزة استشعار الخلية. يتم تعديل قراءات مقاومة من قبل عدد من الخلايا الملتصقة، بقاء الخلية، مورفولوجيا، والتصاق. مشتق معلمة أبعاد يسمى مؤشر الخلية من قياسات المعاوقة الكهربائية ويستخدم لتمثيل الوضع الخلية. عموما، في الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل يسمح في الوقت الحقيقي، وتقييم خالية من التسمية من العصبية والعصبية، وتقييم الثاني تورط مسارات رسول، والمساهمة في المزيدتقييم مفصل والإنتاجية العالية من المركبات اعصاب المحتملة في المختبر، لاختيار المرشحين العلاجي.

المقدمة

موت الخلايا العصبية يلعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية من العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ ^1. توافر موثوقة وعالية الإنتاجية في فحوصات المختبر سمية أمر بالغ الأهمية للحصول على فهم أفضل للآليات العصبية وللمساعدة في اختيار جزيئات اعصاب كمرشحين العلاجية في تطوير العقاقير ^2. ومع ذلك، هناك العديد من القيود على استخدامها على نطاق واسع في المختبر العصبية assays.They تقييم السمية العصبية / العصبية في وقت واحد نقطة عدم السماح للقرار الحركي. غالبا ما تستخدم التسمية أو التحقيق التي يمكن أن تتداخل مع مسارات الإشارات والحد دراسات إضافية في نفس سكان الخلية، وغالبا ما تكون كثيفة العمالة....

البروتوكول

1. إعداد

1. وضع محطة محلل خلية في الوقت الحقيقي في حاضنة زراعة الأنسجة وضعت في 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2. تنفيذ جميع التعامل زراعة الخلايا والعلاجات الدوائية في نسيج الثقافة هود في ظل ظروف معقمة.
2. ملاحظة: خطوط الخلايا العصبية التي تتطلب إعدادات درجة حرارة مختلفة مقارنة الظروف القياسية للثقافة، ينبغي تبعا لذلك. للخطوط الخلايا الملتصقة ضعيفة، واستخدام وكلاء طلاء لتسهيل التفاعل مع الخلايا الميكروية الذهب في قاع الآبار لللوحة E 96.
3. إعداد ا....

النتائج

يؤدي الحرمان من الدم إلى انخفاض في قيم مؤشر الخلية، والتي يمكن رصدها بشكل مستمر مع محلل خلية في الوقت الحقيقي

المحفزات السمية العصبية إلى الخلايا تؤدي إلى انخفاض في قيم مؤشر الخلية، والتي يمكن رصدها في الوقت الحقيقي مع تقنية عرض وديناميات التي تعتمد على التحفيز العصبي محددة ونوع من الخلايا التي تمت دراستها. يوضح الشكل (2) والزيادة في مؤشر الخلية عندما تزرع الخلايا SK-N-SH ف.......

المناقشة

يقدم البروتوكول الحالي فائدة محلل خلية في الوقت الحقيقي لتقييم مستمر وتحت ظروف خالية من تسمية / التأثيرات السمية العصبية اعصاب من المركبات في خطوط الخلايا العصبية وإلى التبصر في مسارات الرسول الثانية المشاركة في التنفيذ.

على الرغم من فائدة محلل خلية في الوقت الحقيقي لدراسة السمية الخلوية وآثار المخدرات على تكاثر الخلايا والمعترف بها عموما، استخدمت سوى عدد قليل من الدراسات في أنواع الخلايا العصبية ذات الصلة. أظهرن.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
xCELLigence  حزمة نظام RTCA SP	ACEA Biosciences	رقم: 00380601030	يتكون من محلل RTCA ومحطة RTCA SP ووحدة التحكم RTCA
E-plate 96	ACEA Biosciences	رقم: 05232368001	لزراعة الخلايا ، يتم إدخالها في محطة RTCA
SP SK-N-SH خلايا	ATCC (بالشراكة مع معايير LGC)	يمكن استبدال HTB-11	بخط خلايا عصبية ملتصق آخر ذي أهمية
DMEM / F12 & nbsp ؛	Sigma-Aldrich	D8437	وسط زراعة الخلايا
تقنيات حياة مصل الأبقار الجنيني		16140-063	تكاثر المكملات الغذائية ، ولكن ليس وسط الحرمان من المصل
قارورة زراعة الأنسجة T175	Sarstedt	83.1812.302	لزراعة الخلايا ، والتي سيتم طلاؤها لاحقا على E-Plate 96
0.05٪ Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	من أجل التربسين للخلايا المزروعة في قوارير زراعة الأنسجة
صولجان 2.0 عداد الخلايا	Merck Millipore	PHCC20060	عداد الخلايا الآلي
تقنيات الحياة المالحة المخزنة بالفوسفات		10010-015	لغسل الخلايا
(±)-ناهض هيدروكلوريد DOI	سيجما-ألدريتش	D101	5-HT2A لعلاج زراعة الخلايا
LY-294002 مثبط هيدروكلوريد	سيجما-ألدريتش	L9908	PI3-K لعلاج زراعة الخلايا   ؛
مركب Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	مع نشاط ناهض 5-HT2A لعلاج زراعة الخلايا
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	سيجما-ألدريتش	D4540	لإذابة LY-294002 وماليات الليزوريد