Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية

ملخص

الخميرة، خميرة الخباز كان، كائن نموذج المفتاح لتحديد ودراسة الجينات التي تنظم نشوء حيوي وظائف الجهاز endosomal. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوضع العلامات المحددة للمقصورات endosomal للدراسات التركيبية.

الملخص

الإندوسومات هي واحدة من كبرى غشاء الفرز نقاط التفتيش في الخلايا حقيقية النواة والتي تنظم إعادة تدوير أو تدمير معظمها من البروتينات الغشاء البلازمي وجولجي. ونتيجة لذلك النظام endosomal يلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية، والطفرات في جينات المنتمين إلى هذه الشبكة من العضيات مترابطة بواسطة وسائل النقل الحويصلي، يسبب أمراض خطيرة بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية. لذا من الأهمية رئيس هو لفهم الآليات الكامنة وراء نشوء حيوي وتنظيم نظام endosomal. كان الخباز الخباز الخميرة محوريا في هذه المهمة. لتسمية تحديدا وتحليل على مستوى التركيبية النظام endosomal هذا النموذج الحي، فإننا نقدم هنا بروتوكول مفصلة لامتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts تليها التصور من هذه الجسيمات من خلال تعزيز التفاعل الفضة. هذا الأسلوب هو أيضا قيمة للغايةل لفحص الصرفي من المسوخ مع عيوب في الاتجار endosomal. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس فقط ينطبق على الامتحانات التركيبية لكنها يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع labelings immunogold للتحقيقات البروتين التعريب.

المقدمة

نظام endosomal هو جهاز الفرز غشاء الرئيسية التي تلعب أدوارا متعددة الخلوية حاسمة بما في ذلك الاتجار انزيم الليزوزومية مستقبلات الفرز وإعادة التدوير من غشاء البلازما (بعد الظهر) مستقبلات ^1،2. وتنقسم الإندوسومات في ثلاث مقصورات مختلفة، مثال. والإندوسومات في وقت مبكر (EE)، والإندوسومات الراحل (LE) والإندوسومات إعادة التدوير. ويستند هذا التصنيف على الوقت الذي يستغرقه للمواد endocytosed للوصول إليهم، على بروتينات محددة وعلامة على التشكل. يمكن أن تكون إما تسليمها الأغشية، أي البروتين والدهون طبقات ثنائية، المنضوية من PM إلى الجسيمات الحالة عبر الإندوسومات للتدهور أو إعادة تدويرها مرة أخرى. ويتم نقل الأغشي....

البروتوكول

1. إعداد الكوراء

1. احتضان بين عشية وضحاها الخميرة في 30 درجة مئوية في 10 مل من المتوسط ​​مناسب يحدده تصميم التجربة.
2. بعد اليوم، وقياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر (OD ₆₀₀₎ باستخدام مضواء، تمييع الخلايا في نفس الثقافة المتوسطة إلى OD ₆₀₀ من 0.2-0.4 وتنمو منها إلى مرحلة النمو المتسارع إلا إذا كان تصميم التجربة يتطلب حالة مختلفة. الخلايا في مرحلة الأسي عندما الثقافة لديه OD ₆₀₀ من 1-2.
3. جمع 10 OD _600....

النتائج

ويبين وفقا لبروتوكول المقدمة، مورفولوجية النظام الخميرة جسيم داخلي يمكن أن يكون وصول EM الإرسال. الشكل 1 أنواع مختلفة من المقصورات endosomal التي تم التوصل إليها، وبالتالي المسمى مع nanogold. وnanogold محسنة الفضة يمكن رؤيتها بوضوح كما الإلكترون جسيمات كثيفة. الإعدادات المثلى التي أنشئت لتعزيز تفاعل الفضة يسمح وجود جزيئات الذهب في مجموعة متجانسة الحجم ما بين 5 و 15 نانومتر، والتي لا تتداخل مع التركيب الدقيق للخلية الخميرة. غشاء البلازما وكذلك المقصورات endosomal ف.......

المناقشة

المناعية الإلكترون المجهري هو الاسلوب الذي يسمح الجمع بين توطين البروتينات مع قرار التركيبية من الناقلين والعضيات حيث تتواجد هذه البروتينات. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما عند دراسة نظام الخميرة endosomal لأن حجرات لها تظهر هياكل نقط كما في مضان المجهري. وبالتالي فإنه من الصعب تمييزها. لهذا السبب، فإن استخدام مسبار كشفها بواسطة EM ودخول الطريق التقامي بطريقة تعتمد الوقت أمر بالغ الأهمية للاحتفال تحديدا الإندوسومات مختلفة. هذا النوع من التحقيق هو قيمة لتقييم وظائف الإلتقام ⁶

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأنابيب (piperazin-1،4-bis (2-ethansulfensaure)Merck	، دارمشتات ، ألمانيا	1،102،200،250
HEPES	Merck ، دارمشتات ، ألمانيا	391،340
EGTA	Sigma ، سانت لويس ، MO	E4378
MgCl2< / sub>· ؛ 6H2< / sub>O	Merck ، دارمشتات ، ألمانيا	1،058،330،250
DL-Dithiothreitol	Sigma ، سانت لويس ، MO	D0632
Sorbitol	Sigma ، سانت لويس ، MO	S1876
Nanogold NanoProbes مشحونة إيجابيا	، Yaphank ، NY	2022	عند -20 درجة ؛ C
HQ-silver & trade; تعزيز عدة	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	متجر في -20 & درجة; C
بارافورمالدهيد (PFA)	سيجما ، سانت لويس ، ميزوري	441244
جلوتارالديهايد 8٪ EM الصف	Polyscience، Inc. ، Warrington ، PA	216	متجر في -20 درجة ؛ C
إنزيم لايتيك	MP Biomedicals ، سانتا آنا ، كاليفورنيا	153526	مخزن عند -20 درجة ؛ C
Parafilm M	Sigma, St louis, MO	P7793
50 شبكات شبكات النيكل	Agar Scientific ، ستانستيد ، المملكة المتحدة	G209N
سكين الماس المناعي بالتبريد 35 درجة ؛	Diatome AG ، بيل ، سويسرا	NA.
UCT ultramicrotome	لايكا ، سولمز ، ألمانيا	NA
Formvar 15/95	المجهر الإلكتروني الراتنج ، هاتفيلد ، بنسلفانيا	15800
50 شبكات شبكات النيكل   ؛	Agar Scientific ، ستانستيد ، المملكة المتحدة	AGG2050N
Parafilm	Sigma ، سانت لويس ، MO	P7793
صندوق تخزين الشبكات	Leica ، Solms ، ألمانيا	162-50
Falcon 100 مم × 15 مم طبق بتري	Corning ، Corning ، NY	351029
ماصات شعرية باستور 150 مم	Van Bruggen Glas ، روتردام ، هولندا	10216234
1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة	Sarstedt, Nü mbrecht ، ألمانيا	72690001
أنبوب 50 مل	Bio-one ، Alphen aan den Rijn ، هولندا	210296
Benchkote واقي السطح	Whatman ، Maidstone ، المملكة المتحدة   ؛	1159201

متجر علوم